P.ベリザー、J.ヨハンセンH.、オクラの抗体、A.デベック、ブルーミントン、ウィーンのハエストックセンターに感謝します。提案と刺激的な議論のためのC.ジャクソンに感謝します。

1. ショウジョウバエ精巣コレクション
注:若い男性(0-15時間後-分浸)は、ジロイド生殖細胞(すなわち、精子および精子細胞)を調べるのに必要である。
<ol><li>精子の開発による干渉を最小限に抑えるために、可能な限り若いハエを選択してください。</li>
	<li>二酸化炭素への短時間の暴露によってハエを麻酔し、フライパッド14、15に移す。</li>
	<li>解剖顕微鏡(10倍の倍率)の下で、鉗子を使用して頭部を取り除く。</li>
	<li>5~10個の切断されたハエを、黒いバックグラウンドサポート上のシリコーンコーティングされたガラススライド上のリンゲルのバッファー(183 mM KCI、47 mM NaCl、10 mM Tris-HCI、1 mM EDTA、完全タンパク質阻害剤、pH 6.8)の100 μLに移します。</li>
	<li>40倍の倍率で顕微鏡を解剖すると、5個の鉗子を1組使って胸部と腹部の間にハエを保持し、他の鉗子で腹部を胸郭から引き離します。精巣と隣接組織をハエ・カーカス15から迅速に分離し、同じスライド上のリンガーの緩衝液の新しい滴に入れる。</li>
	<li>すべての精巣の準備ができたら、残りの組織(補助腺と外部生殖器)から精巣をきれいにします。</li>
	<li>解剖された精巣を含むドロップから余分なバッファを取り除きます。通常、200 μL チップの上に 10 μL チップを取り付けた p200 ピペットを使用します。これは小さい絞りを通して液体過剰の除去を可能にする。解剖精巣を含むドロップの上に4%パラホルムアルデヒド固定液の滴を置き、次いで迅速に新しい固定溶液を含むチューブに精巣を移します。</li>
</ol>2. パラホルムアルデヒド固定
<ol><li>使用直前に2 mLの固定液を調製:リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈した4%パラホルムアルデヒド600 μL、NP40 20%の30 μL+2 mLシリコン化マイクロ遠心チューブ内のヘプタン1200 μLを使用します。600 μL アリコートで調製し、-20°Cで保存した PBS で 4% パラホルムアルデヒドを使用してください。 注意: ヘプタンとパラホルムアルデヒドは有毒であり、ヒュームフードで扱う必要があります。ホスト協会の規則に従って処分する。</li>
	<li>広い開口チップを備えたp200マイクロピペットを使用して、PFA/NP40/ヘプタン溶液に精巣を移します。チューブを上下に振って30s手で動かします。室温で30分間、回転ミキサーで精巣を固定し続けます。</li>
	<li>回転ミキサーを停止し、チューブラックにチューブを置いて、相分離を可能にし、精巣がチューブの底部に落ち着くようにします。</li>
	<li>すべてのヘプタンと固定溶液を取り除き、1x PBSで3回素早く精巣をすすぐ。</li>
	<li>きれいな200 μLの個々の管に移す。これらの小さなチューブ内のすべてのインキュベーションを行い、抗体の使用量を最小限に抑えます。</li>
	<li>P200とP10チップの両方を取り付けた200 μLマイクロピペットを使用して余分なバッファーを除去します。精巣を吸引しないように注意してください。</li>
	<li>すべてのサンプルが準備ができるまで氷の上に1x PBSで精巣を保ちます。</li>
</ol>3. 溶液中の抗体染色
<ol><li>PBSを廃棄し、細胞膜を透過させるために室温で30分間0.3%PBS-Tに精巣を残します。</li>
	<li>同じバッファーに 5% 通常のヤギ血清 (NGS) を加えた 1 時間の前培養します。</li>
	<li>0.3%PBS-Tプラス5%NGS(材料表)に希釈された一次抗体の200 μLを加える。</li>
	<li>ロッカーに緩やかな攪拌を伴い、一次抗体を4°C(または室温)で一晩インキュベートします。</li>
	<li>室温でロッカーに15分間0.3%PBS-Tで3回洗浄します。重力によって精巣がチューブの底に落ち着くようにします。</li>
	<li>DyLightコンジュゲートシリーズから1:500希釈した二次抗体200μLを加えます。</li>
	<li>二次抗体を暗室で室温で4時間インキュベートする。</li>
	<li>室温でロッカーに15分間0.3%PBS-Tで洗います。その後、0.2%PBS-Tと0.1%PBS-Tで繰り返し、室温でロッカーで30分間繰り返します。洗剤を取り除くために30分間、PBS1xで最後の洗浄を行います。</li>
	<li>1μg/mLのDAPI溶液を1μg/mLで1x PBSで15分間追加します。ストック溶液はH2Oで10mg/mLであり、PBSでストック溶液を作ることを避け、より大きな精子での拡散クロマチンのDAPI染色信号を減少させることができます。</li>
	<li>3倍の洗剤を5分間洗います。</li>
	<li>疎水性バリアペンを使用して、きれいなスライドに円を描きます。</li>
	<li>試験を吸引し、スライドの上に置きます。広い開口チップを0.1%PBS-Tでプレリンスすると、精巣が先端に付着するのを防ぎます。余分なPBSを除去します。</li>
	<li>シティフルオールAF1のドロップ(約100 μL)を加えます。</li>
	<li>ガラスのカバースリップを組織の上にそっと置き、気泡をトラップしないように注意してください。</li>
	<li>クリアマニキュアを使用して、カバースリップをスライドに密封します。</li>
	<li>顕微鏡でスライドを観察します。</li>
</ol>4. 共局化分析
<ol><li>共焦点画像を取得します。Zeiss LSM 710共焦点顕微鏡(63xプランアポクロマティックオイル)を使用し、Z解像度は0.5または1μmでした。</li>
	<li>独立した精巣から異なるセルを選択します。</li>
	<li>処理ソフトウェア(例えば、イマリス)に画像をインポートします。</li>
	<li>隣接する核を除外するために、手動セグメンテーションで核を定義します。Coloc ソフトウェアを使用する。2つのフルオロフォア間の全容内でピアソンの相関係数(PCC)を収集します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic,+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis.">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+assembly+in+Drosophila+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells.">Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).</li><li>Fabbretti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Analysis+of+Nuclear+Lamina+Behavior+during+Male+Meiosis+and+Spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0151231 (2016).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinas-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 1, 71-148 (1993).</li><li>Hiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis-specific+TAF+homologs+collaborate+to+control+a+tissue-specific+transcription+program.">Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program.</a> Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).</li><li>Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+TAFs+counteract+Polycomb+to+turn+on+terminal+differentiation.">Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation.</a> Science. 310 (5749), 869-872 (2005).</li><li>White-Cooper, H., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+aspects+of+transcription+regulation+in+male+germ+cells.">Unique aspects of transcription regulation in male germ cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).</li><li>Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAD1:+Kinetochore+Receptors+and+Catalytic+Mechanisms.">MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51 (2018).</li><li>Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+checkpoint+protein+Xmad1+recruits+Xmad2+to+unattached+kinetochores.">Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).</li><li>Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+checkpoint+proteins+HsMAD1+and+HsMAD2+are+associated+with+nuclear+pore+complexes+in+interphase.">Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase.</a> Journal of Cell Science. 114, 953-963 (2001).</li><li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components.">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li><li>Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mad1+influences+interphase+nucleoplasm+organization+and+chromatin+regulation+in+Drosophila.">Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila.</a> Open Biology. 8 (10), (2018).</li><li>Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smurf-mediated+differential+proteolysis+generates+dynamic+BMP+signaling+in+germline+stem+cells+during+Drosophila+testis+development.">Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development.</a> Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).</li><li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started:+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila.">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes.">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2641 (2011).</li><li>Gigliotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup154,+a+new+Drosophila+gene+essential+for+male+and+female+gametogenesis+is+related+to+the+nup155+vertebrate+nucleoporin+gene.">Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene.</a> Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).</li><li>Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+lamina+regulates+germline+stem+cell+niche+organization+via+modulation+of+EGFR+signaling.">The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).</li><li>Fawcett, D. W., Chemes, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+distribution+of+nuclear+pores+during+differentiation+of+the+male+germ+cells.">Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells.</a> Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue,+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis.">Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), 1273-1275 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), 102-104 (2012).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+analysis+of+meiosis+and+morphogenesis.">Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).</li><li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis.">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).</li><li>Theofel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tBRD-1+and+tBRD-2+regulate+expression+of+genes+necessary+for+spermatid+differentiation.">tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation.</a> Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).</li><li>Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+dany+is+essential+for+transcriptional+control+and+nuclear+architecture+in+spermatocytes.">Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes.</a> Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、成体成群ショウジョウバエ精巣の免疫標識を成功させるための方法を提供する。他の手順で報告されているように、若い男性は精子を妨害する危険性のある精子の発症の存在を最小限に抑えるために使用する必要があります(我々も、発疹後20時間以内に年齢を短縮しました)。解剖は迅速で、抗体希釈はシグナル対ノイズ比21、22、23を最適化するように調整する必要があります。他のプロトコルを用いるため、精巣の深さ全体に染色を観察せず、NP40やヘプタンとPFAを組み合わせた固定法を開発しました。現在では、20%NP40の30 μLと2巻のヘプタンを用いたPBSで、4%パラホルムアルデヒド600 μLを日常的に使用しています。これは、十分な透過性を可能にするために重要です。NP40の量を10 μLに減らすことによって、目に見えてラベル付けを減らすことができます。その後のステップはすべて懸濁液で行い、精巣が重力によって管の底に穏やかに降下できるようにすることで余分な緩衝液を除去した。サンプルをスライドに移す最後のステップでは、0.1%PBS-Tでチップをすすいで、精巣が円錐に付着するのを防ぎます。観察によると、免疫組織学的染色プロトコルは、ここで使用されるマーカーを含む様々な核タンパク質、ならびにエピジェネティックヒストン修飾、ラミンおよびヌクレオポリンのプローブとうまく機能する。このプロトコルは幼虫精巣にも使用でき、その場合はヘプタンを省略する必要があります。
このプロトコルは、精巣の効率的で均一な標識のために、精子細胞の損傷のないスタックを一緒に維持するように特に設計されています。我々は、その不整形核が保存するのが最も困難な細胞の中でそれらを作る大きな後期精子細胞とプロトコルを示した。さらに、これらの精子細胞では核標識が核の大きさのために希薄化することが多い。例えば、DAPIまたはラミン標識が精巣の頂点で細胞内で強く、精子が3,24に成長するにつれて徐々に弱くなり、より分散することが一般的に観察される。これはまた、ヌクレオポリンの分布が初期段階の細胞(精子および初期の精子細胞)17にしか記載されていない理由の1つである可能性がある。
ショウジョウバエS5精子細胞の免疫染色の優れた画像が公開されており、特に精巣特異的t-BRDおよびdanyタンパク質25、26は、0.3%デオキシコール酸ナトリウムプロトコルを用いて、または組織21,22のスカッシュに続く。私たちの手の中では、スカッシュは臓器の深部の染色の有意な不均一性をもたらし、3D構造を犠牲にします。0.3%のデオキシコール酸ナトリウムを使用しても、より良い結果を得たとしても、我々はまだ不均一性を観察した。したがって、再現性とラベルの品質のためにNP40を好みます。共焦点画像は核タンパク質の3D画像の再構成を可能にする。例えば、我々は、この方法を、非染色体クロマチン質量と核細孔ネットワークと密接に関連する核内MINTドメインによってここに示される多くの異なるプローブを用いてうまく適用した。これらの精子細胞核の核毛の興味深い3D分布は、さらなる研究のために利用可能になりました。画像は同じ精巣および異なった精巣からの異なった精子からの共局在化の再現可能な定量を可能にする。私たちの知る限りでは、ピアソン相関係数による正確な定量がこのようなサンプルで測定されたのは初めてです。それは異なった精巣の正確な免疫標識蛋白質のレベルの比較のために必要な信頼を与える。

ショウジョウバエの精巣は、核建築の研究にとって貴重なモデルです。有糸精子細胞では、核体積は主にクロマチンによって占められます。これらの細胞は4ラウンドの分裂を受け、16の原発性精子細胞の嚢胞を産生する。次の数日間にわたって、精子細胞は6つの発達段階(S1-S6)を通過し、体積が大幅に増加し、およそ20倍1、2。彼らはまた、核形態を変えます。ラミンDm0によって明らかにされた核の輪郭は不規則になり、深い内層1、3を示す。これは、クロマチン組織1、4、5、6、7における広範な遺伝子発現変化および修飾を伴う。この相間染色体は、ステージS4-S5で明確に定義されており、2つの主要な二価オートソームと核子とドッキングされたX-Y対に対応する3つの異なる質量を形成する。
Mad1 はもともと、有糸分裂性チェックポイントの重要な構成要素として分離されました(8でレビュー)。相間では、核エンベロープに位置するが、核内に位置する9、10、11と記載されている。ショウジョウバエ精巣では、Mad1が核内で顕著であり、2つの主要な常染色体塊と密接に関連しており、XYクロマチンとのより少ない程度に関連していると報告した。我々は、このクロマチン関連構造をMINT(Mad1含有核内領域)12と定義した。他の4つのタンパク質は、精子細胞におけるMINTと関連していた:ヌクレオポリンMtor/Tpr、SUMOペプチダーゼウルプ1、有糸性チェックポイントタンパク質Mad2およびポリコーム様複合体Raf212のサブユニット。
MINTの説明を完了するために、我々は抗体を使用する必要があり、精巣における免疫染色に一般的に遭遇する技術的な問題に直面していた:透過性が悪く、特に大きな精子で精巣の深部に有意な不均一性の染色をもたらした。Squashed製剤は抗体アクセスを増加させたが、圧縮画像、3D分析を制限し、共局在化を含む定量的蛍光の測定を妨げる。抗体の浸透の問題は、0.3%Naデオキシコール酸13などの透過性剤によっても対処することができたが、この手順は我々の手の中に再現可能な結果を生み出さなかった。多くの共標識実験を行ったため、パーメバライゼーションプロトコルの改善を検討しました。1%NP40とヘプタンの組み合わせは、特に大きな精子細胞を研究する上で、より再現性をもたらした。
このプロトコルは、懸濁液中の精巣の固定および免疫染色を行い、サンプルの品質を向上させ、再現性を高め、共焦点顕微鏡に適したレンダリングを行います。我々は、このプロトコルを用いて、特定の核エンベロープタンパク質と大きな精子細胞の核内構造の空間的関係をより良く定義した。この方法は、例えばクロマチン、核細胞および核の毛穴を含む核の動的構造変化など、精子細胞の発達に伴う変化のより良い調査を可能にする。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1005px;" width="1005">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Drosophila srains</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Mad1-GFP</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Mtor RNAi&#160;</td>
			<td style="width:129px;">VDRC</td>
			<td style="width:93px;">ID 110218</td>
			<td>Vienna Drosophila RNAi Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Materials</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:277px;">DAPI&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock solution must be prepared in H2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dumont # 5 Fine Forseps&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MBP Wide Bore Pipette Tips</td>
			<td style="width:129px;">Fisherbrand</td>
			<td>11917744</td>
			<td>Wide aperture tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific&#160;0.2 mL Individual Tube</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 ml micro centrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>T3531-200EA&#160;</td>
			<td>Siliconized 2ml tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citifluor AF1</td>
			<td style="width:129px;">Citifluor</td>
			<td>AF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dakopen&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">Z377821-1EA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>NS02L-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 4%</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P6148-500G&#160;</td>
			<td>Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X&#160;; aliquot by 600 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 1X</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>14190094</td>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T&#160;</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td></td>
			<td>PBS 1X&#160; containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100, for molecular biology,&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GFP booster</td>
			<td style="width:129px;">Chromotek</td>
			<td>gba488</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Mtor</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;">1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat anti-Nup62</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;">1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guinea-pig anti-Ulp1</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Rabbit anti-Raf2</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DyLight conjugated series&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse,&#160; rabbit or rat) as second antibodies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining of whole-mount drosophila testes for 3d confocal analysis of large spermatocytes

ショウジョウバエ 精巣は、幹細胞生物学、核アーキテクチャ、微膜および精子の発生を含む生物学的プロセスを研究するための強力なモデルシステムです。しかしながら、 ショウジョウバエ 精巣全体の免疫標識は、抗体の浸透による染色の有意な不均一性と関連していることが多い。押しつぶされた準備は、解析の3D品質を低下させるので、部分的に問題を克服するだけです。本明細書において、我々は、液体媒体中の免疫標識と共に固定中にNP40およびヘプタンを用いた全実装プロトコルについて述べている。それは再生可能で信頼できるラベル付けと共に共焦点顕微鏡に適した容積を維持する。我々は、共焦点部からの精子細胞核の3D再構成の異なる例を示す。検査中および間の試験の再現性により、異なる遺伝子型の単一細胞間の 蛍光 を3D定量および比較することができます。我々は、核内MINT構造(Mad1含有核内領域)の異なる成分と、核孔複合体に関連する2つの成分を使用して、このプロトコルとその精巣の最大細胞S4-S5精子細胞への応用を説明した。

ショウジョウバエ精巣の適切な染色を得るための主な障害は、部分的に押しつぶされた製剤を使用して解決されたが、3D分析の制限(例えば3D表現または共局在化の尺度)を犠牲にして解決された抗体の限られた浸透性である。この手順では、均一なラベルを作成でき、精巣のすべての細胞の体積を保持します。ここでは、S4-S5精子細胞の3D表現に関する方法のイラストを、それらが最大の細胞であり、したがって、スカッシュからの変形に敏感であるように焦点を当てました。我々は、有糸タンパク質Mad112によって記述される核内MINTドメイン(Mad1含有核内領域)の核内MINTドメインのラベリングと核内の標識を含む異なる核マーカーを用いた。MINTは複数の異なる抗体によって明らかにすることができるので、我々はそれらを使用して、定量的3D共局在化のためのプロトコルの堅牢性をテストし、正しい空間分解能を必要とする方法である。
上述のプロトコルは、3D再構成のために処理される十分な品質の共焦点画像の取得を可能にする。S5段の隣接する4つの連続セクションが 図1Aに描かれているが、DAPI(シアン)と共にMINT(GFPブースターを赤色で使用したMad1免疫標識)の代表的な免疫染色を示す。染色体は特徴的な3つの主要な異なるクラスターに編成され、MINT構造はDNAの周りに細かく詳細に示され、常染色体塊と密接に関連しているが、異なる。この決議はまた、核周辺でのMad1の存在と、染色体2と3の常染色体塊の間の検出も可能にする。3D表現にはイマリスのソフトウェアを使用しました。核表面は、核エンベロープにおけるMad1の低レベル存在(灰色)とMINTの高レベル蓄積(赤)とDAPI染色(青色)によって定義された(図1A)。3D再構成ムービーは、S4-S5精子細胞のステージにおける染色体と共にMad1(核エンベロープとMINT)のボリュームと関係をよく示しています。
ヌクレオポリンの分布は、これらの細胞では十分に記述されておらず、おそらくこれらの大きな不整形核でそれらを検出するのが難しいためである。Nup154の分布は、以前に16とNup153およびNup98が精子および小さな、初期の精子細胞17でしか研究されなかった一度だけ報告されている。ヌクオポリンNup62および輸入β(ケテル遺伝子の産物)によって染色された大きなS5精子細胞の3D再構成は、それぞれ実現可能であり、図1Cおよび図1Dに示されている。これらの核孔関連成分は、不規則な大きさのドットとして核縁の上に不均一に分布しているように見える。例えば、インポートインβは、ラミンネットワークが既に記述されている場所と同様に、常染色体クロマチンの周りに集まる 3.この種の分布は、孔が豊富な領域と大きな孔のない領域を有する、げっ歯類精子細胞18における電子顕微鏡法によって記述されている。ラミンとヌクレオポリン分布の変化を理解することは、男性の分裂の直前にこれらのG2細胞の核エンベロープ構造を理解するのに役立ちます。
細胞の3D容積を節約しながら、このプロトコルはまた抗体がすべての細胞の深部に均一に浸透することを可能にし、共局在化のような定量的な分析を可能にする。ピアソン相関係数(PCC)は、確立されたメトリックです。それは+1(完全正の相関を示す)から−1(完全負相関)19まで及ぶ。精子細胞におけるMad1に対するMINTパートナータンパク質の局在を評価するために、S5精子細胞12 におけるImageJを用いて0.5μmの単一のセクションでPCCを推定した(図2A,B)。我々は、単なる表面ではなく、核全体に3D共局在化を使用して、プロトコルをより深くテストしました。核の体積は手動セグメンテーションによって定義され、PCCはコロケーションツールを使用して測定された。同じ精巣または異なる精巣から8個のS5精子細胞核を分析した。 図2B はPCCを測定するのに役立った核の3D表現を示す。 図2D は、3つの異なる精巣から8つの異なるS5精子細胞核に対するPCCの測定を示す。PCC 値は 0.6 と 0.75 から変化し、共局在化の高い値を示す、異なっていません。これらは、単一のセクションで定義された PCC と区別できません。したがって、この手順は、再現可能な均一なラベルを可能にし、精巣のすべての細胞の良好な体積を保持します。
このプロトコルは独立した精巣からの共局在化の信頼できる測定を可能にするので、異なるハエノタイプからの染色の比較が可能になった。これは、MTORのために枯渇したWTハエとハエRNAi(後期精子および初期の精子20で実質的な枯渇を達成するDsRNA UASラインとBam-Gal4ドライバの発現によって生成される)を比較してここに示した。共局在化実験で説明したように、Mtor-RNAiが枯渇した精巣と野生型の精巣を解剖し、一緒に固定し、共焦点画像を一定の設定で取得した。これらの条件に従って、個々の細胞の比較が可能になる。我々は、代表Mtor RNAiが枯渇した(上)およびwt(下)細胞(図3)12によって示されるように、MINTがMtorの喪失によって核エンベロープよりも影響を受けていることを観察した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig01.jpg"> 図1:異なるプローブを用いたショウジョウバエS4-S5精子細胞核の免疫染色の図示。(A) Mad1-GFP(赤)によりMINT構造を検出したα-GFP抗体(GFPブースター)で免疫染色された1段階5の精子細胞核の画像(青色)をDAPI染色(青)に一緒に行う。これは、Mad1と2つの常染色体質量(アスタリスクとして表される)との関係を正確に示す。Mad1は核の周辺でもかすかに検出される。すべての画像は、3(0.5 μm)連続の共焦点スライスのスタックのシリアルZプロジェクションです。共焦点像は共焦点顕微鏡(63倍、計画アポクロマティックオイルDIC対物レンズ)で取得した。スケールバーは5μm(B)同じ精子細胞核のムービーレンダリングからのフレームである。核表面は核エンベロープ(灰色)におけるMad1の低発現によって定義され、MINTは核内のMad1の高い発現(赤)によって定義された。(A, B)以前に公開された図の許可を得て再印刷(12から)。(C)Nup62(黄色)とMINT(赤でGFPブースター)の同時免疫染色を伴うステージ5精子細胞核の3D画像。スケールバーは、4μm(D)の3D画像である第5段階の精子細胞核を、DNA(青色のDAPI)と共に、インポートβケテル(黄色)の同時免疫染色を伴う。スケールバーは5μmです。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61061/61061fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig02.jpg"> 図2:Ulp1と共にMad1の2Dおよび3D共局在化の定量化。(A) GFPブースター抗体を用いて免疫染色されたステージ5の精子細胞核の合成画像はMad1(緑色)、および1μm厚層の精子核の厚いスタックとして表される抗Ulp1抗体(赤色)を用いた。右側には、Coloc-2 ImageJプラグインを使用して計算されたピアソン強度相関係数が示されています。PCCは0.73と推定されました(ライヒ12の許可を得て転載)。(B)ステージ5の精子細胞核(隣接表中の核Gに対応する)の合成像は、Mad1(緑色)を検出するGFPブースター抗体で免疫染色し、抗ウルプ1抗体(赤色)を3D投影で表した。核の体積は手動セグメンテーションによって定義された。右側の表には、3つの異なる精巣(1〜3)から8つの異なる精子(A〜H)で計算されたピアソン強度相関係数がリストされています。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61061/61061fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig03.jpg"> 図3:野生型と比較したMTOR RNAi処理精子細胞の蛍光免疫分析。MtorRNAi(ID 110218)細胞(上パネル)および野生型細胞(下パネル)を用いてMtorを使ってMtorを枯渇させた細胞は、Mad1、Raf2およびMtorタンパク質について染色された。精巣は固定され、一緒に染色され、同じスライドと同じパラメータで取得された画像に取り付けられました。RNAi細胞は、Mad1-GFPの不在または存在によってWTと区別され得る。この図は、4 x 0.5 μm スタックの最大投影を表しています。スケールバーは5μm(12で以前に公開された図の許可を得て転載されます)。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61061/61061fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

我々は、同焦点顕微鏡に適し、また再現可能で信頼性の高い標識を可能にする 、ショウジョウバエ 精巣の全実装および免疫染色のための改善されたプロトコルをここに提示する。我々は、大規模なS4-S5精子細胞に対する共局在化実験の3D表現および定量化によるこのプロトコルを示す。

大精子細胞の3D共焦点解析のための全山 ショウジョウバエ 精巣の免疫染色

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

immunostaining-whole-mount-drosophila-testes-for-3d-confocal-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

4.1K ビュー.  Université de Paris, F 75006, Paris, France. 我々は、同焦点顕微鏡に適し、また再現可能で信頼性の高い標識を可能にする 、ショウジョウバエ 精巣の全実装および免疫染色のための改善されたプロトコルをここに提示する。我々は、大規模なS4-S5精子細胞に対する共局在化実験の3D表現および定量化によるこのプロトコルを示す。

ビデオ: Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

初期のニワトリ胚のin situハイブリダイゼーションダブルホールマウント

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

生物学

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

チックの全マウントの抗体染色のための方法

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

全モンキー脳の大規模なタンパク質の検出のためのバッチの免疫染色

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

胚肢の皮膚の血管系のためのホールマウント免疫組織化学的解析：胚における血管分岐形態形成を研究するモデルシステム

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

の分離キイロショウジョウバエ精巣

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

全体のマウント<em&gt;上皮内</emE11.5マウス胚へのE8.5&gt;ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;精巣

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

活性化カスパーゼ3を検出するために、ホールマウント免疫蛍光法によりゼブラフィッシュ胚におけるアポトーシスの分析

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

大精子細胞の3D共焦点解析のための全山ショウジョウバエ精巣の免疫染色

要約

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この動画の章

初期のニワトリ胚のin situハイブリダイゼーションダブルホールマウント

チックの全マウントの抗体染色のための方法

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

全モンキー脳の大規模なタンパク質の検出のためのバッチの免疫染色

胚肢の皮膚の血管系のためのホールマウント免疫組織化学的解析：胚における血管分岐形態形成を研究するモデルシステム

の分離キイロショウジョウバエ精巣

全体のマウント

ホールマウントRNAを蛍光

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備

活性化カスパーゼ3を検出するために、ホールマウント免疫蛍光法によりゼブラフィッシュ胚におけるアポトーシスの分析

大精子細胞の3D共焦点解析のための全山 ショウジョウバエ 精巣の免疫染色

要約

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初期のニワトリ胚のin situハイブリダイゼーションダブルホールマウント

チックの全マウントの抗体染色のための方法

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

全モンキー脳の大規模なタンパク質の検出のためのバッチの免疫染色

胚肢の皮膚の血管系のためのホールマウント免疫組織化学的解析：胚における血管分岐形態形成を研究するモデルシステム

の分離キイロショウジョウバエ精巣

全体のマウント

ホールマウントRNAを蛍光

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備

活性化カスパーゼ3を検出するために、ホールマウント免疫蛍光法によりゼブラフィッシュ胚におけるアポトーシスの分析

大精子細胞の3D共焦点解析のための全山ショウジョウバエ精巣の免疫染色