Wir danken P. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura für Antikörper und A. Debec, den Lagerzentren Bloomington und Vienna für Fliegen. Danke an C. Jackson für Anregungen und anregende Diskussionen.

1. Drosophila Hodensammlung
HINWEIS: Junge Männchen (0-15 h nach der Eklosion) sind notwendig, um diploide Keimzellen (dh Spermatogonie und Spermatozyten) zu untersuchen.
<ol><li>Wählen Sie junge Fliegen so weit wie möglich aus, um Störungen durch die Entwicklung von Spermatiden zu minimieren.</li>
	<li>Anästhesieren Sie Fliegen durch kurze Exposition gegenüber Kohlendioxid und Übertragen auf ein Fliegenpad14,15.</li>
	<li>Unter einem Seziermikroskop (10-fache Vergrößerung) den Kopf mit einer Zette entfernen.</li>
	<li>5 bis 10 enthauptete Fliegen auf 100 μL Ringer-Puffer (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, vollständiger Proteininhibitor, pH 6,8) auf einen silikonbeschichteten Glasträger auf schwarzem Hintergrundträger übertragen.</li>
	<li>Verwenden Sie mit einem Seziermikroskop bei einer 40-fachen Vergrößerung ein Paar Einer Zange Nummer 5, um eine Fliege zwischen Thorax und Bauch zu halten, und ziehen Sie mit einer anderen Zange den Bauch vom Thorax weg. Isolieren Sie schnell die Hoden und das angrenzende Gewebe aus dem Fliegenkadaver15 und legen Sie einen neuen Tropfen Ringers Puffer auf denselben Objektträger.</li>
	<li>Sobald alle Hoden fertig sind, reinigen Sie die Hoden von den verbleibenden Geweben (Akzessodrüse und äußere Genitalien).</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssigen Puffer aus dem Tropfen, der die sezierten Hoden enthält. Verwenden Sie in der Regel eine p200-Pipette mit einer 10-μL-Spitze, die auf einer 200-μL-Spitze angebracht ist. Dies ermöglicht die Entfernung des Flüssigkeitsüberschusses durch eine kleine Öffnung. Legen Sie einen Tropfen 4% Paraformaldehyd-Fixiermittel auf den Tropfen, der die sezierten Hoden enthält, und geben Sie die Hoden dann schnell in ein Röhrchen mit frischer Fixierlösung.</li>
</ol>2. Paraformaldehyd-Fixierung
<ol><li>Bereiten Sie 2 ml Fixierlösung kurz vor dem Gebrauch vor: 600 μL 4% Paraformaldehyd verdünnt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 30 μL NP40 20% plus 1200 μL Heptan in einem 2 mL silikonisierten Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie 4% Paraformaldehyd in PBS, das in 600 μL Aliquoten hergestellt und bei -20 °C gelagert wird. Achtung: Heptan und Paraformaldehyd sind giftig und sollten in einem Abzug gehandhabt werden. Entsorgen Sie diese gemäß den Vorschriften des Gastinstituts.</li>
	<li>Übertragen Sie die Hoden mit einer p200-Mikropipette mit einer breiten Öffnungsspitze auf die PFA/NP40/Heptan-Lösung. Schütteln Sie den Schlauch 30 s lang von Hand auf und ab. Setzen Sie die Fixierung der Hoden auf einem Rotationsmischer bei Raumtemperatur für 30 minuten fort.</li>
	<li>Stoppen Sie den Rotationsmischer und legen Sie das Rohr in ein Rohrgestell, damit die Phasentrennung erfolgt und sich die Hoden am Boden des Rohres absetzen können.</li>
	<li>Entfernen Sie das gesamte Heptan und die Fixierlösung und spülen Sie die Hoden schnell dreimal mit 1x PBS aus.</li>
	<li>In ein sauberes 200 μL Einzelröhrchen überführen. Führen Sie alle Inkubationen in diesen kleinen Röhrchen durch, um die Menge der verwendeten Antikörper zu minimieren.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssigen Puffer mit einer 200 μL-Mikropipette, an der sowohl eine P200- als auch eine P10-Spitze angebracht sind. Achten Sie darauf, keine Hoden anzusaugen.</li>
	<li>Halten Sie die Hoden in 1x PBS auf Eis, bis alle Proben fertig sind.</li>
</ol>3. Antikörperfärbung in Lösung
<ol><li>Verwerfen Sie das PBS und lassen Sie die Hoden in 0,3% PBS-T für 30 minuten bei Raumtemperatur, um die Zellmembranen zu permeabilisieren.</li>
	<li>Im selben Puffer plus 5% normales Ziegenserum (NGS) für 1 h vorinkubieren.</li>
	<li>200 μL des primären Antikörpers verdünnt in 0,3% PBS-T plus 5% NGS ( Materialtabelle )werden hinzugefügt.</li>
	<li>Inkubieren Sie den primären Antikörper über Nacht bei 4 °C (oder Raumtemperatur) mit sanftem Rühren auf einer Wippe.</li>
	<li>3 mal in 0,3% PBS-T für 15 min auf einer Wippe bei Raumtemperatur waschen. Lassen Sie die Hoden sich durch die Schwerkraft auf den Boden der Röhre absetzen.</li>
	<li>Fügen Sie 200 μL sekundären Antikörper hinzu, der 1:500 verdünnt ist, aus der dyLight-konjugierten Serie.</li>
	<li>Inkubieren Sie den sekundären Antikörper in einer dunklen Kammer für 4 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>In 0,3% PBS-T für 15 min auf einer Wippe bei Raumtemperatur waschen. Dann mit 0,2% PBS-T und 0,1% PBS-T wiederholen, jedes Mal für 30 minuten auf einer Wippe bei Raumtemperatur. Waschen Sie das Reinigungsmittel abschließend in 1x PBS für 30 Minuten, um das Reinigungsmittel zu entfernen.</li>
	<li>180 μL DAPI-Lösung bei 1 μg/ml in 1x PBS für 15 min hinzufügen. Die Stammlösung beträgt 10 mg/ ml inH2O. Vermeiden Sie die Herstellung von Stammlösung in PBS, die das DAPI-Färbesignal auf diffusem Chromatin in größeren Spermatozyten reduzieren kann.</li>
	<li>3x für je 5 min waschen.</li>
	<li>Verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um einen Kreis auf einem sauberen Dia zu zeichnen.</li>
	<li>Saugen Sie hoden an und legen Sie sie auf den Schlitten. Das Vorspülen der weiten Blendenspitze mit 0,1% PBS-T verhindert, dass die Hoden an der Spitze haften. Entfernen Sie überschüssiges PBS.</li>
	<li>Fügen Sie einen Tropfen (ca. 100 μL) Citifluor AF1 hinzu.</li>
	<li>Legen Sie vorsichtig einen Glasdeckel über das Gewebe und achten Sie darauf, dass Luftblasen nicht einfangen.</li>
	<li>Versiegeln Sie den Abdeckverschluss mit klarem Nagellack auf dem Schlitten.</li>
	<li>Beobachten Sie Objektträger auf einem Mikroskop.</li>
</ol>4. Kolokalisationsanalysen
<ol><li>Erfassen Sie konfokale Bilder. Wir verwendeten ein Zeiss LSM 710 Konfokalmikroskop (63x Plan Apochromatic Öl) mit einer z-Auflösung von 0,5 oder 1 μm.</li>
	<li>Wählen Sie verschiedene Zellen aus unabhängigen Hoden aus.</li>
	<li>Importieren Sie Bilder in Verarbeitungssoftware (z. B. Imaris).</li>
	<li>Definieren Sie den Kern durch manuelle Segmentierung, um die benachbarten Kerne auszuschließen. Verwenden Sie die Coloc-Software; Es sammelt die Pearson-Korrelationskoeffizienten (PCCs) innerhalb des gesamten Volumens zwischen 2 Fluorophoren.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic,+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis.">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+assembly+in+Drosophila+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells.">Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).</li><li>Fabbretti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Analysis+of+Nuclear+Lamina+Behavior+during+Male+Meiosis+and+Spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0151231 (2016).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinas-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 1, 71-148 (1993).</li><li>Hiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis-specific+TAF+homologs+collaborate+to+control+a+tissue-specific+transcription+program.">Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program.</a> Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).</li><li>Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+TAFs+counteract+Polycomb+to+turn+on+terminal+differentiation.">Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation.</a> Science. 310 (5749), 869-872 (2005).</li><li>White-Cooper, H., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+aspects+of+transcription+regulation+in+male+germ+cells.">Unique aspects of transcription regulation in male germ cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).</li><li>Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAD1:+Kinetochore+Receptors+and+Catalytic+Mechanisms.">MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51 (2018).</li><li>Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+checkpoint+protein+Xmad1+recruits+Xmad2+to+unattached+kinetochores.">Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).</li><li>Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+checkpoint+proteins+HsMAD1+and+HsMAD2+are+associated+with+nuclear+pore+complexes+in+interphase.">Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase.</a> Journal of Cell Science. 114, 953-963 (2001).</li><li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components.">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li><li>Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mad1+influences+interphase+nucleoplasm+organization+and+chromatin+regulation+in+Drosophila.">Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila.</a> Open Biology. 8 (10), (2018).</li><li>Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smurf-mediated+differential+proteolysis+generates+dynamic+BMP+signaling+in+germline+stem+cells+during+Drosophila+testis+development.">Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development.</a> Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).</li><li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started:+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila.">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes.">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2641 (2011).</li><li>Gigliotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup154,+a+new+Drosophila+gene+essential+for+male+and+female+gametogenesis+is+related+to+the+nup155+vertebrate+nucleoporin+gene.">Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene.</a> Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).</li><li>Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+lamina+regulates+germline+stem+cell+niche+organization+via+modulation+of+EGFR+signaling.">The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).</li><li>Fawcett, D. W., Chemes, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+distribution+of+nuclear+pores+during+differentiation+of+the+male+germ+cells.">Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells.</a> Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue,+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis.">Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), 1273-1275 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), 102-104 (2012).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+analysis+of+meiosis+and+morphogenesis.">Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).</li><li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis.">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).</li><li>Theofel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tBRD-1+and+tBRD-2+regulate+expression+of+genes+necessary+for+spermatid+differentiation.">tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation.</a> Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).</li><li>Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+dany+is+essential+for+transcriptional+control+and+nuclear+architecture+in+spermatocytes.">Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes.</a> Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur erfolgreichen Immunmarkierung von drosophila-Hoden bei Erwachsenen. Wie in anderen Verfahren berichtet, müssen junge Männer verwendet werden (wir haben sogar das Alter auf weniger als 20 Stunden nach der Eklosion verkürzt), um das Vorhandensein von sich entwickelnden Spermien zu minimieren, die die Spermatozyten behindern könnten. Die Dissektion sollte schnell sein und die Antikörperverdünnung muss angepasst werden, um das Signal-Rausch-Verhältnis21,22,23zu optimieren. Da wir mit anderen Protokollen keine Färbung in der gesamten Tiefe des Hodens beobachteten, entwickelten wir eine Fixierungsmethode, die PFA zusammen mit NP40 und Heptan kombiniert. Wir verwenden jetzt routinemäßig 600 μL 4% Paraformaldehyd in PBS mit 30 μL von 20% NP40 plus zwei Volumen Heptan. Dies ist entscheidend, um eine ausreichende Permeabilisierung zu ermöglichen. Die Reduzierung der NP40-Menge auf 10 μL reduziert die Beschriftung sichtbar. Alle nachfolgenden Schritte wurden in Suspension durchgeführt und der überschüssige Puffer wurde entfernt, indem die Hoden durch die Schwerkraft sanft zum Boden des Rohres absteigen konnten. Für den letzten Schritt, bei dem die Proben auf einen Objektträger übertragen werden, spülen wir die Spitze in 0,1% PBS-T aus, um zu verhindern, dass die Hoden am Kegel haften. Beobachtungen zufolge funktioniert das immunhistologische Färbeprotokoll gut mit einer Vielzahl von Kernproteinen, einschließlich der hier verwendeten Marker, sowie Sonden epigenetischer Histonmodifikationen, Lamin und Nukleoporinen. Wir stellen fest, dass das Protokoll auch für Larven hoden verwendet werden kann, in diesem Fall sollte das Heptan weggelassen werden, da es die Hoden schwieriger macht, sich intakt zu erholen.
Das Protokoll wurde speziell entwickelt, um unbeschädigte Stapel der Spermatozyten für eine effiziente und einheitliche Markierung des Hodens zusammen zu halten. Wir illustrierten das Protokoll mit den großen Spermatozyten im Spätstadium, deren unförmige Kerne sie zu den am schwierigsten zu erhaltenden Zellen machen. Darüber hinaus wird in diesen Spermatozyten die Kernmarkierung oft verdünnt, wahrscheinlich aufgrund der Größe der Kerne. Zum Beispiel wird häufig beobachtet, dass die DAPI- oder Lamin-Markierung in den Zellen an der Hodenspitze stärker ist und zunehmend schwächer und dispergierterwird,wenn die Spermatozytenwachsen 3,24. Dies könnte auch einer der Gründe dafür sein, dass die Verteilung von Nukleoporinen nur in Zellen im Frühstadium (Spermatogonie und frühe Spermatozyten) beschrieben wurde17.
Ausgezeichnete Bilder der Immunfärbung von Drosophila S5-Spermatozyten wurden veröffentlicht, insbesondere für die hodenspezifischen t-BRD- und Dany-Proteine25,26 unter Verwendung von entweder 0,3% Natriumdesoxycholat-Protokoll oder nach Zerquetschen des Gewebes21,22. In unseren Händen führen Kürbisse zu einer signifikanten Ungleichmäßigkeit der Färbung in den Tiefen des Organs und opfern auch die 3D-Struktur. Selbst wenn die Verwendung von 0,3% Natriumdeoxycholat bessere Ergebnisse lieferte, beobachteten wir immer noch eine Ungleichmäßigkeit. Daher bevorzugen wir NP40 wegen seiner Reproduzierbarkeit und Qualität der Etikettierung. Die konfokalen Bilder erlauben die Rekonstruktion von 3D-Bildern für Kernproteine. Zum Beispiel haben wir diese Methode erfolgreich mit vielen verschiedenen Sonden angewendet, die hier durch die intranukleäre MINT-Domäne veranschaulicht werden, die eng mit den autosomalen Chromatinmassen und dem Kernporennetzwerk verbunden ist. Die faszinierende 3D-Verteilung der Kernporen dieser Spermatozytenkerne steht nun für weitere Studien zur Verfügung. Die Bilder erlauben eine reproduzierbare Quantifizierung der Kolokalisation aus verschiedenen Spermatozyten desselben Hodens und aus verschiedenen Hoden. Unseres Wissens ist dies das erste Mal, dass an solchen Proben eine genaue Quantifizierung durch den Pearson-Korrelationskoeffizienten gemessen wurde. Es gibt die Sicherheit, die für einen genauen Vergleich der immunmarkierten Proteinspiegel verschiedener Hoden erforderlich ist.

Drosophila-Hoden sind ein wertvolles Modell für das Studium der nuklearen Architektur. In mitotischen Spermatogonienzellen ist das Kernvolumen weitgehend mit Chromatin besetzt. Diese Zellen durchlaufen vier Teilungsrunden und produzieren eine Zyste von 16 primären Spermatozyten. In den nächsten Tagen durchlaufen die Spermatozyten 6 Entwicklungsstadien (S1-S6), wobei das Volumen stark zunimmt, ungefähr 20-fach1,2. Sie verändern auch ihre Kernmorphologie. Der Umriss des Kerns, der durch das Lamin Dm0 offenbart wird, wird unregelmäßig und zeigt tiefe Invaginationen1,3. Damit einher gehen umfangreiche Genexpressionsveränderungen und Modifikationen in der Chromatinorganisation1,4,5,6,7. Die Interphasenchromosomen sind im Stadium S4-S5 gut definiert und bilden drei verschiedene Massen, die den 2 wichtigsten bivalenten Autosomen und dem X-Y-Paar entsprechen, das an den Nukleolus angedockt ist.
Mad1 wurde ursprünglich als Schlüsselkomponente des mitotischen Checkpoints isoliert (überprüft in8). In der Interphase wird es als primär an der Kernhülle, aber auch im Nukleoplasmus9,10,11lokalisiert beschrieben. Bei Drosophila hoden berichteten wir, dass Mad1 im Nukleoplasma prominent ist, eng mit den beiden großen autosomalen Chromatinmassen und in geringerem Maße mit dem XY-Chromatin verbunden ist. Wir haben diese Chromatin-assoziierte Struktur als MINT (Mad1-containing IntraNuclear Territory)12definiert. Vier weitere Proteine waren mit MINTs in Spermatozyten assoziiert: das Nukleoporin Mtor/Tpr, das SUMO peptidase Ulp1, das mitotische Checkpointprotein Mad2 und eine Untereinheit eines Polycomb-ähnlichen Komplexes Raf212.
Um die Beschreibung von MINTs zu vervollständigen, mussten wir Antikörper verwenden und wurden mit den technischen Problemen konfrontiert, die im Allgemeinen bei der Immunfärbung im Hoden auftreten: eine schlechte Permeabilität, die zu einer signifikanten Ungleichmäßigkeit der Färbung in der Tiefe des Hodens, insbesondere in den großen Spermatozyten, führt. Szerschmierte Präparate erhöhten den Antikörperzugang, führten jedoch zu komprimierten Bildern, schränkten die 3D-Analysen ein und verhinderten die Messung der quantitativen Fluoreszenz, einschließlich der Kolokalisierung. Das Problem der Antikörperpenetration könnte auch durch Permeabilisierungsmittel wie 0,3% Na-Desoxycholat13angegangen werden, aber dieses Verfahren führte in unseren Händen nicht zu reproduzierbaren Ergebnissen. Da wir viele Co-Labeling-Experimente durchgeführt haben, haben wir versucht, das Permeabilisierungsprotokoll zu verbessern. Die Kombination von 1% NP40 plus Heptan führte zu mehr Reproduzierbarkeit, insbesondere bei der Untersuchung der großen Spermatozyten.
Dieses Protokoll führt die Fixierung und Immunfärbung von Hoden in Suspension durch, verbessert die Probenqualität sowie verbessert die Reproduzierbarkeit und macht sie für die konfokale Mikroskopie geeignet. Wir haben das Protokoll verwendet, um die räumlichen Beziehungen bestimmter Kernhüllenproteine mit den nukleoplasmatischen Strukturen großer Spermatozyten besser zu definieren. Diese Methode wird es ermöglichen, die Veränderungen, die die Spermatozytenentwicklung begleiten, besser zu überprüfen, zum Beispiel die dynamischen strukturellen Veränderungen des Kerns einschließlich Chromatin, Nukleoplasma und der Kernporen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1005px;" width="1005">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Drosophila srains</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Mad1-GFP</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Mtor RNAi&#160;</td>
			<td style="width:129px;">VDRC</td>
			<td style="width:93px;">ID 110218</td>
			<td>Vienna Drosophila RNAi Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Materials</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:277px;">DAPI&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock solution must be prepared in H2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dumont # 5 Fine Forseps&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MBP Wide Bore Pipette Tips</td>
			<td style="width:129px;">Fisherbrand</td>
			<td>11917744</td>
			<td>Wide aperture tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific&#160;0.2 mL Individual Tube</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 ml micro centrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>T3531-200EA&#160;</td>
			<td>Siliconized 2ml tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citifluor AF1</td>
			<td style="width:129px;">Citifluor</td>
			<td>AF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dakopen&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">Z377821-1EA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>NS02L-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 4%</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P6148-500G&#160;</td>
			<td>Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X&#160;; aliquot by 600 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 1X</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>14190094</td>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T&#160;</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td></td>
			<td>PBS 1X&#160; containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100, for molecular biology,&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GFP booster</td>
			<td style="width:129px;">Chromotek</td>
			<td>gba488</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Mtor</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;">1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat anti-Nup62</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;">1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guinea-pig anti-Ulp1</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Rabbit anti-Raf2</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DyLight conjugated series&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse,&#160; rabbit or rat) as second antibodies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining of whole-mount drosophila testes for 3d confocal analysis of large spermatocytes

Drosophila-Hoden sind ein leistungsfähiges Modellsystem zur Untersuchung biologischer Prozesse, einschließlich Stammzellbiologie, Kernarchitektur, Meiose und Spermienentwicklung. Die Immunmarkierung des gesamten Drosophila-Hodens ist jedoch oft mit einer signifikanten Ungleichmäßigkeit der Färbung aufgrund der Antikörperpenetration verbunden. Gequetschte Präparate überwinden das Problem nur teilweise, da sie die 3D-Qualität der Analysen verringern. Hierin beschreiben wir ein Whole-Mount-Protokoll mit NP40 und Heptan während der Fixierung zusammen mit der Immunmarkierung in flüssigen Medien. Es bewahrt das für die konfokale Mikroskopie geeignete Volumen zusammen mit einer reproduzierbaren und zuverlässigen Markierung. Wir zeigen verschiedene Beispiele für die 3D-Rekonstitution von Spermatozytenkernen aus konfokalen Abschnitten. Die Reproduzierbarkeit von Intra- und Inter-Hoden ermöglicht die 3D-Quantifizierung und den Vergleich der Fluoreszenz zwischen einzelnen Zellen verschiedener Genotypen. Wir verwendeten verschiedene Komponenten der intranukleären MINT-Struktur (Mad1-containing Intra Nuclear Territory) sowie zwei Komponenten, die mit dem Kernporenkomplex verbunden sind, um dieses Protokoll und seine Anwendungen auf den größten Zellen des Hodens, den S4-S5-Spermatozyten, zu veranschaulichen.

Das Haupthindernis für eine angemessene Färbung der Drosophila-Hoden ist die begrenzte Penetrabilität von Antikörpern, die teilweise durch die Verwendung von gequetschten Präparaten gelöst wurde, aber auf Kosten einer Einschränkung der 3D-Analysen (z. B. 3D-Darstellung oder Maß der Kolokalisierung). Das Verfahren ermöglicht eine einheitliche Kennzeichnung und bewahrt das Volumen aller Zellen des Hodens. Hier haben wir die Darstellung der Methode auf die 3D-Darstellung von S4-S5-Spermatozyten konzentriert, da diese die größten Zellen sind und somit empfindlicher auf Verformungen durch Quetschen reagieren. Wir verwendeten verschiedene nukleare Marker, darunter Nukleoporine und die Markierung der intranukleären MINT-Domäne (Mad1-containing Intra Nuclear Territory), die durch das mitotische Protein Mad112beschrieben wird. Da MINTs durch mehrere verschiedene Antikörper aufgedeckt werden konnten, haben wir sie verwendet, um die Robustheit des Protokolls für die quantitative 3D-Kolokalisierung zu testen, eine Methode, die eine korrekte räumliche Auflösung erfordert.
Das oben beschriebene Protokoll ermöglicht die Erfassung konfokaler Bilder von ausreichender Qualität, um dann für die 3D-Rekonstitution behandelt zu werden. Vier benachbarte serielle Abschnitte eines S5-Spermatozyten im Stadium sind in Abbildung 1Adargestellt und zeigen eine repräsentative Immunfärbung von MINT (Mad1-Immunmarkierung mit GFP-Booster in Rot) zusammen mit DAPI (in Cyan). Die Chromosomen sind in den charakteristischen 3 Hauptclustern organisiert und die MINT-Struktur wird detailliert um die DNA herum gezeigt, die eng mit den autosomalen Chromatinmassen verbunden ist, sich aber von ihnen unterscheidet. Die Auflösung erlaubt auch den Nachweis des Vorhandenseins von Mad1 an der nuklearen Peripherie sowie zwischen den autosomalen Massen der Chromosomen 2 und 3. Für die 3D-Darstellung haben wir die Imaris-Software verwendet. Die Kernoberfläche wurde durch die geringe Präsenz von Mad1 an der Kernhülle (grau) und MINT durch eine hohe Akkumulation von Mad1 im Kern (rot) zusammen mit DAPI-Färbung (blau) definiert(Abbildung 1A). Der 3D-Rekonstitutionsfilm veranschaulicht gut das Volumen und die Beziehung von Mad1 (an der Kernhülle und in der MINT) zusammen mit den Chromosomen in Den Spermatozyten der Stufen S4–S5.
Die Verteilung von Nukleoporinen wurde in diesen Zellen nur schlecht beschrieben, wahrscheinlich aufgrund der Schwierigkeit, sie in diesen großen unförmigen Kernen zu erkennen. Die Verteilung von Nup154 wurde bisher nur einmal berichtet und Nup153 und Nup98 wurden nur in der Spermatogonie und kleinen, frühen Spermatozyten untersucht17 . Die 3D-Rekonstitutionen großer S5-Spermatozyten, die durch das Nukleoporin Nup62 und durch Importin β (Produkt des Ketel-Gens) gefärbt wurden, waren durchführbar und sind in Abbildung 1C bzw. Abbildung 1Ddargestellt. Diese kernporenbesezisierten Komponenten erscheinen ungleichmäßig über den Kernrand als Punkte unregelmäßiger Größe verteilt. Beispielsweise sammelt sich der Importin-β um das autosomale Chromatin ähnlich wie dort, wo bereits ein Lamin-Netzwerk beschrieben wurde3. Diese Art der Verteilung mit porenreichen Bereichen und großen porenfreien Bereichen wurde elektronenmikroskopisch in Nagetierspermatozyten beschrieben18. Das Verständnis der Veränderungen in der Lamin- und Nukleoporinverteilung würde helfen, die Kernhüllenstruktur in diesen G2-Zellen kurz vor der männlichen Meiose zu verstehen.
Während das 3D-Volumen der Zellen erhalten bleibt, ermöglicht dieses Protokoll auch, dass Antikörper gleichmäßig in die Tiefe jeder Zelle eindringen, was quantitative Analysen wie die Kolokalisierung ermöglicht. Der Pearson-Korrelationskoeffizient (PCC) ist eine etablierte Metrik. Es kann von +1 (bedeutet perfekte positive Korrelation) bis −1 (perfekte negative Korrelation)19reichen. Um die Lokalisation von MINT-Partnerproteinen relativ zu Mad1 in Spermatozyten zu bewerten, haben wir zuvor die PCC auf einem einzelnen Abschnitt von 0,5 μm mit ImageJ in S5-Spermatozyten12 geschätzt (Abbildung 2A, B). Wir haben das Protokoll tiefer getestet, indem wir die 3D-Kolokalisierung auf den gesamten Kernen anstelle einer Oberfläche verwendet haben. Das Volumen der Kerne wurde durch manuelle Segmentierung definiert und die PCC mit dem Colocation-Tool gemessen. Wir analysierten acht S5-Spermatozytenkerne aus demselben Hoden oder verschiedenen Hoden. Abbildung 2B zeigt eine 3D-Darstellung eines Kerns, der zur Messung des PCC diente. Abbildung 2D zeigt die Messung des PCC an acht verschiedenen S5-Spermatozytenkernen aus drei verschiedenen Hoden. Die PCC-Werte unterscheiden sich nicht und variieren von 0,6 und 0,75, was auf einen hohen Wert für die Kolokalisierung hinweist. Diese sind nicht von der PCC zu unterscheiden, die auf einem einzigen Abschnitt definiert ist. Somit erlaubt das Verfahren eine reproduzierbare einheitliche Markierung und bewahrt ein gutes Volumen aller Zellen des Hodens.
Da das Protokoll eine zuverlässige Messung der Kolokalisierung von unabhängigen Hoden ermöglicht, ermöglichte es den Vergleich der Färbung verschiedener Fliegengenotypen. Dies wurde hier durch den Vergleich von WT-Fliegen und Fliegen RNAi für Mtor erschöpft (erzeugt durch Expression von dsRNA UAS-Linien und dem Bam-Gal4-Treiber, die eine erhebliche Erschöpfung in späten Spermatogonien und frühen Spermatozyten erreichen20). Wie für die Kolokalisierungsexperimente beschrieben, wurden Mtor-RNAi-erschöpfte Hoden und Wildtypen-Hoden seziert und zusammen fixiert und die konfokalen Bilder unter konstanten Einstellungen aufgenommen. Unter Berücksichtigung dieser Bedingungen wird der Vergleich einzelner Zellen möglich. Wir beobachteten, dass die MINT durch den Verlust von Mtor stärker betroffen ist als die Kernhülle, wie repräsentative Mtor RNAi-depleted (obere) und wt (untere) Zellen zeigen (Abbildung 3)12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig01.jpg"> Abbildung 1: Illustration der Immunfärbung von Drosophila S4-S5 Spermatozytenkernen mit verschiedenen Sonden. (A) Bilder eines einstufigen 5-Spermatozytenkerns, immungefärbt mit α-GFP-Antikörper (GFP-Booster), der die MINT-Struktur durch Mad1-GFP (rot) zusammen mit DAPI-Färbung (blau) nachweist. Es zeigt präzise die Beziehung zwischen Mad1 und den beiden autosomalen Chromatinmassen (dargestellt als Sternchen). Mad1 wird auch schwach an der Peripherie des Kerns nachgewiesen. Alle Bilder sind serielle Z-Projektionen eines Stapels von 3 (0,5 μm) aufeinanderfolgenden konfokalen Scheiben. Konfokale Bilder wurden auf einem konfokalen Mikroskop (63x, Plan Apochromatic Oil DIC Objektiv) aufgenommen. Skalenbalken sind 5 μm. (B) Bild aus einem Film Rendering des gleichen Spermatozytenkerns. Die Kernoberfläche wurde durch eine niedrige Expression von Mad1 an der Kernhülle (in Grautönen) und MINT durch eine hohe Expression von Mad1 im Kern (in Rot) definiert. (A, B) Nachdruck mit Genehmigung der zuvor veröffentlichten Abbildung (ab12). (C) 3D-Bild eines Spermatozytenkerns der Stufe 5 mit gleichzeitiger Immunfärbung von Nup62 (gelb) und MINT (GFP-Booster in rot). Der Schuppenbalken beträgt 4 μm. (D) 3D-Bild eines Spermatozytenkerns der Stufe 5 mit gleichzeitiger Immunfärbung des Importin-β Ketel (gelb) zusammen mit DNA (DAPI in blau). Maßstabsbalken sind 5 μm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61061/61061fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig02.jpg"> Abbildung 2: 2D- und 3D-Kolokalisationsquantifizierung von Mad1 zusammen mit Ulp1. (A) Zusammengeführte Bilder eines Spermatozytenkerns im Stadium 5, der immungefärbt ist mit GFP-Booster-Antikörpern, die Mad1 (grün) und einen Anti-Ulp1-Antikörper (rot) nachweisen, dargestellt als 1 μm dicker Stapel eines Spermatozytenkerns. Auf der rechten Seite ist der Pearson-Intensitätskorrelationskoeffizient angegeben, der mit dem Coloc-2 ImageJ-Plugin berechnet wurde. Der PCC wurde auf 0,73 geschätzt (Nachdruck mit Genehmigung von Raich12). (B) Zusammengeführtes Bild des Spermatozytenkerns im Stadium 5 (entsprechend dem Kern G in der nebenstehenden Tabelle), immungefärbt mit GFP-Booster-Antikörpern, die Mad1 (grün) nachweisen, und mit Anti-Ulp1-Antikörpern (rot), die in einer 3D-Projektion dargestellt sind. Das Volumen des Kerns wurde durch manuelle Segmentierung definiert. Auf der rechten Seite listet die Tabelle die Pearson-Intensitätskorrelationskoeffizienten auf, die auf 8 verschiedenen Spermatozyten (A bis H) aus 3 verschiedenen Hoden (1 bis 3) berechnet wurden. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61061/61061fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig03.jpg"> Abbildung 3: Immunfluoreszenzanalyse von Mtor RNAi-behandelten Spermatozyten im Vergleich zum Wildtyp. Zellen, die mit MtorRNAi (ID 110218) Zellen (obere Panels) und Wildtypzellen (untere Panels) erschöpft waren, wurden für Mad1-, Raf2- und Mtor-Proteine gefärbt. Die Hoden wurden fixiert und zusammen gefärbt, auf dem gleichen Dia montiert und Bilder mit den gleichen Parametern aufgenommen. Die RNAi-Zellen konnten von WT durch das Fehlen bzw. Vorhandensein von Mad1-GFP unterschieden werden. Die Abbildung ist repräsentativ für maximale Projektionen von 4 x 0,5 μm Stacks. Der Maßstabsbalken beträgt 5 μm (Nachdruck mit Genehmigung der zuvor veröffentlichten Abbildung in12). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61061/61061fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Wir präsentieren hier ein verbessertes Protokoll für die Ganzkörperpräparation und Immunfärbung von Drosophila-Hoden, das für die konfokale Mikroskopie geeignet ist und auch eine reproduzierbare und zuverlässige Markierung ermöglicht. Wir veranschaulichen dieses Protokoll durch 3D-Darstellung und Quantifizierung von Kolokalisierungsexperimenten an den großen S4-S5-Spermatozyten.

Immunfärbung von Drosophila-Hoden für die konfokale 3D-Analyse großer Spermatozyten

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

immunostaining-whole-mount-drosophila-testes-for-3d-confocal-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

4.1K Aufrufe.  Université de Paris, F 75006, Paris, France. Wir präsentieren hier ein verbessertes Protokoll für die Ganzkörperpräparation und Immunfärbung von Drosophila-Hoden, das für die konfokale Mikroskopie geeignet ist und auch eine reproduzierbare und zuverlässige Markierung ermöglicht. Wir veranschaulichen dieses Protokoll durch 3D-Darstellung und Quantifizierung von Kolokalisierungsexperimenten an den großen S4-S5-Spermatozyten.

Serie: Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Forschung

Biologie

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Verfahren zur Whole Mount Antikörper-Färbung in Küken

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

Batch Immunfärbung für Large-Scale Protein-Nachweis im Whole Affenhirn

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Whole-mount Immunhistochemische Analyse für Embryonale Limb Haut Gefäßsystem: ein Modellsystem zur Vascular Branching Morphogenese in Embryo-Studie

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoden

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Die Analyse der Apoptose in Zebrafischembryonen von Whole-mount Immunfluoreszenz an aktivierte Caspase 3 Detect

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