הפרוטוקול שלנו מספק כלי חדשני להערכת הפוטנציאל האנגיוגני של נויטרופילים ראשוניים הקשורים לגידול ב- vivo ללא צורך להשתמש במודלים מלאכותיים של קו תאים נויטרופילים. עיכוב ישיר של nicotinamide phosphoribosyltransferase, זמן קצר NAMPT, נויטרופילים הקשורים לגידול עם ההעברה המאמצת הבאים שלהם לתוך בעלי חיים נושאי גידול מאפשר מניפולציה של נויטרופילים ללא תופעות לוואי רעילות מערכתית. אנו נדגים את הפוטנציאל הטיפולי של נויטרופילים הקשורים לגידול אנטי-אנגיוגני לאחר העברה למארחים נושאי גידולים לחקר חיסונים פוטנציאליים מבוססי נויטרופילים במודלים שונים של סרטן.
כדי להקים מודל עכבר גידול allogenic, לגלח את העור של 10 שמונה עד 12 שבועות נקבה אינטרפרון אלפא ו בטא קולטן subunit 1 נוקאאוט עכברים עם מכונת גילוח חשמלית לחטא את העור עם 70% אתנול, לאחר מכן לטעון שלוש פעמים 10 לשישה תאי מלנומה B16F10 למיליליטר של PBS במזרק מיליליטר אחד מצויד במחט 0.4 על ידי 19 מילימטר ולהזריק 100 microliters של ההשעיה תת עורית על האגף האחורי לתוך כל מגולח בעלי חיים. עבור העברה נויטרופילית מאמצת, לדלל את תאי מלנומה B16F10 לשש פעמים 10 לתאים השישי לריכוז מיליליטר ב- PBS נויטרופילים לדלל שטופלו מעכבי NAMPT FK866 לשש פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר של ריכוז PBS. לאחר מכן, לערבב נויטרופילים מטופלים או מעכבים עם תאי מלנומה ביחס נויטרופילים לגידול של 1:10 ולהזריק תת עורית 100 microliters של תאים לתוך עד חמישה עכברים לכל קבוצה.
לאחר הזריקות, מניחים עד חמישה עכברים נקבה מוזרקים בכלוב אחד ולהשתמש calipers כדי למדוד את אורך הגידול, רוחב, ועומק כל יום במשך 14 ימים. ביום 14 לאחר ההזרקה, לחטא את העור של כל בעל חיים מוזרק עם 70% אתנול ולהשתמש מספריים ומדפים כדי לקצור את הגידולים לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר המכיל מדיום שלם על קרח. כדי לסעיף את הגידולים לניתוח היסטולוגי, להטביע את הגידולים בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית ולהקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס.
ביום הניתוק, להפשיר את הדגימות למינוס 20 מעלות צלזיוס לפני השימוש cryotome כדי להשיג קטעים של חמישה מיקרומטר. לאחר קיבעון מחייב לא ספציפי, להכתים את חלקי רקמת הגידול עם הנוגדנים העיקריים של עניין במשך שעה אחת ב 20 מעלות צלזיוס, ואחריו שלוש שטיפות PBS. לאחר הכביסה האחרונה, להכתים את התאים עם נוגדן משני מתאים נדוש פלואורסצנטיות בצבע מכתים גרעיני כמו DAPI במשך שעה אחת ב 20 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור.
בסוף הדגירה, לייבש את השקופיות במשך 20 דקות ב 20 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור לפני הרכבה את הדגימות עם מדיום הרכבה נטול מים, ולאחר מכן לכסות כל שקופית עם להחליק כיסוי ולאפשר מדיום הרכבה להתייבש במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס לפני הדמיה הרקמות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי. לבידוד נויטרופילים הקשורים לגידול, מניחים חמישה גידולים ל הבאר לתוך בארות בודדות של צלחת סטרילית בת שש בארות בזמן שהם נקצרים ולהשתמש במספריים סטריליים כדי לטחון את הגידולים לחתיכות של שניים עד שלושה מילימטרים. לאחר מכן, לעכל את שברי הגידול עם מיליליטר אחד של דיס קולגנס d dnase 1 פתרון במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני עם לחות, ערבוב הדגימות עם מזרק 10 מיליליטר כל 15 דקות.
בסוף הדגירה, לסנן את התאים דרך מסנני 100 מיקרומטר לתוך צינור אחד 15 מיליליטר לתוך באר כדי להסיר את הסיבים מעוכל ולהוסיף PBS לנפח הסופי של 15 מיליליטר. לאסוף את התאים ניתוק על ידי צנטריפוגה lyse תאי הדם האדומים עם מיליליטר אחד של חיץ תמוגה לכל צינור. לאחר ערבוב, לשלב את התוכן מכל צינור לתוך צינור אחד 15 מיליליטר, לעצור את התגובה לאחר שתי דקות עם 11 מיליליטר של מדיום שלם ארבע מעלות צלזיוס.
לאחר הצנטריפוגה, יש למצות את גלולת הכדור במיליליטר אחד של PBS ולחסום כל כריכה לא ספציפית עם שלושה מיקרוליטרים של נוגדן Fc-block למשך 15 דקות על קרח. בסוף הדגירה, סמן את התאים בנוגדנים נגד CD11b ו- Ly6G וכל נוגדנים אחרים בעלי עניין, בתוספת DAPI, לדגירה של 30 דקות על קרח המוגן מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים ב 14 מיליליטר של PBS ולתלות מחדש את כדורי באחת פעמים 10 לתאים השביעיים למיליליטר של ריכוז בינוני שלם טרי על קרח, ואז למיין את CD11b חיובי, Ly6G, נויטרופילים גבוהים DAPI שלילי על סדרן תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות על פי פרוטוקולי מיון סטנדרטיים, בדיקת הטוהר של נויטרופילים מבודדים על ציטרומטר זרימה בסוף הסוג.
עבור עיכוב נויטרופילים הקשורים לגידול במבחנה, זרע 1.5 פעמים 10 כדי נויטרופילים ממוינים החמישי לתוך כל אחת משתי בארות של צלחת U-bottom 96-well ולהוסיף FK866 לריכוז סופי של 100 ננומולר במדיום שלם לתוך באר אחת ונפח שווה של מדיום שלם לבד לתוך באר אחרת. לאחר שעתיים באינקובטור תרבות התא, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ו resuspend כדורי PBS בריכוז המתאים עבור הזריקה הבאה. מעכבי NAMPT שטופלו נויטרופילים יש ירידה משמעותית ביכולת לעורר היווצרות ענף aortic בהשוואה לתאים מטופלים.
בנוסף, הזריקה התת עורית של נויטרופילים אנטי אנגיוגניים שטופלו במעכבים גורמת לפגיעה משמעותית בצמיחת הגידול בהשוואה לעכברים שהוזרקו עם אלפא אינטרפרון לא מטופל ו יחידת משנה של קולטן בטא 1 נויטרופילים נוקאאוט. בדיקה היסטולוגית של הגידולים שחולצו מאשרת עוד יותר את הדיכוי המשמעותי של אנגיוגנזה בגידולים מבודדים מעכבים שטופלו בנויטרופילים הקשורים לגידולים שטופלו במעכבים בהשוואה לאלה שהוזרקו לנויטרופילים נוקאאוט לא מטופלים. כדי להעריך את המאפיינים של FK866-מטופלים גידול הקשורים נויטרופילים, PCR כמותי כתם המערבי יכול להתבצע כדי לחקור את ההפעלה של מסלולים תאיים מעורבים קיטוב נויטרופילים.
מאז נויטרופילים הם קצרי מועד, יש צורך לבצע את כל השלבים מהר ככל האפשר כדי לשמור על נויטרופילים קר במהלך ההליך כולו. טכניקה זו סוללת את הדרך לחקר המנגנונים והגורמים תאיים המעורבים בוויסות תכונות אנגיוגניות וגידוליות של נויטרופילים הקשורים לגידול ב- vivo.
