Nuestro protocolo proporciona una herramienta novedosa para evaluar el potencial angiogénico de los neutrófilos primarios asociados al tumor in vivo sin la necesidad de utilizar modelos de líneas celulares de neutrófilos artificiales. La inhibición directa de la nicotinamida fosforibosiltransferasa, en breve NAMPT, en neutrófilos asociados al tumor con su posterior transferencia adoptiva a animales portadores de tumores permite la manipulación de neutrófilos sin efectos secundarios tóxicos sistémicos. Demostraremos el potencial terapéutico de los neutrófilos manipulados asociados al tumor anti-angiogénicos después de la transferencia a huéspedes portadores de tumores para el estudio de posibles inmunoterapias basadas en neutrófilos en diferentes modelos de cáncer.
Para configurar un modelo de ratón tumoral alogénico, afeite la piel de 10 de ocho a 12 semanas de edad mujer interferón alfa y beta-receptor subunidad 1 knockout ratones con una afeitadora eléctrica y desinfectar la piel con 70%etanol, luego cargue tres veces 10 a las seis células de melanoma B16F10 por mililitro de PBS en una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de 0,4 por 19 milímetros e inyecte 100 microlitros de la suspensión por vía subcutánea en un flanco trasero en cada afeitado Animal. Para la transferencia neutrófilo-adoptiva, diluir las células de melanoma B16F10 a seis veces 10 a la sexta célula por mililitro de concentración en PBS y neutrófilos diluidos tratados con inhibidor de NAMPT FK866 a seis veces 10 a las quintas células por mililitro de concentración de PBS. Luego, mezcle neutrófilos no tratados o tratados con inhibidores con las células del melanoma en una proporción de neutrófilos a tumores de 1:10 e inyecte por vía subcutánea 100 microlitros de células en hasta cinco ratones por grupo.
Después de las inyecciones, coloque hasta cinco ratones hembra inyectados en una sola jaula y use pinzas para medir la longitud, anchura y profundidad del tumor todos los días durante 14 días. En el día 14 después de la inyección, desinfecte la piel de cada animal inyectado con 70%etanol y use tijeras y fórceps para cosechar los tumores en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga un medio completo sobre hielo. Para secuestrar los tumores para el análisis histológico, sumerja los tumores en un compuesto de temperatura de corte óptimo y congele las muestras en nitrógeno líquido para su almacenamiento a menos 80 grados centígrados.
El día de la seccionamiento, descongele las muestras a menos 20 grados Celsius antes de usar un criotomo para obtener secciones de cinco micrómetros. Después de la fijación en la unión no específica, mancha las secciones del tejido tumoral con los anticuerpos primarios de interés durante una hora a 20 grados Celsius, seguido de tres lavados en PBS. Después del último lavado, manche las células con un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia adecuado en un tinte de tinción nuclear como DAPI durante una hora a 20 grados centígrados protegidos de la luz.
Al final de la incubación, seque los portaobjetos durante 20 minutos a 20 grados Celsius protegidos de la luz antes de montar las muestras con un medio de montaje anhidro, luego cubra cada diapositiva con un resbalón de cubierta y deje que el medio de montaje se seque durante una hora a 37 grados Celsius antes de tomar imágenes de los tejidos por microscopía fluorescencia. Para el aislamiento de neutrófilos asociados al tumor, coloque cinco tumores por pozo en pozos individuales de una placa estéril de seis pozos a medida que se cosechan y use tijeras estériles para picar los tumores en piezas de dos a tres milímetros. A continuación, digiere los fragmentos tumorales con un mililitro de solución de colágenoasa d dnase 1 de dispase durante 45 minutos a 37 grados Centígrados en un 5% de dióxido de carbono con humedad, mezclando las muestras con una jeringa de 10 mililitros cada 15 minutos.
Al final de la incubación, filtre las células a través de coladores de 100 micrómetros en un tubo de 15 mililitros por pozo para eliminar las fibras no digeridos y añadir PBS a un volumen final de 15 mililitros. Recoger las células disociadas por centrifugación y análisis de los glóbulos rojos con un mililitro de tampón de lelisis por tubo. Después de mezclar, combine el contenido de cada tubo en un solo tubo de 15 mililitros, deteniendo la reacción después de dos minutos con 11 mililitros de medio completo de cuatro grados centígrados.
Después de la centrifugación, resuspender el pellet en un mililitro de PBS y bloquear cualquier unión no específica con tres microlitros de anticuerpos Fc-block durante 15 minutos con hielo. Al final de la incubación, etiquete las células con anticuerpos anti-CD11b y Ly6G y cualquier otro anticuerpo de interés, más DAPI, para una incubación de 30 minutos sobre hielo protegido de la luz. Al final de la incubación, lavar las células en 14 mililitros de PBS y resuspender los pellets a una vez 10 a las séptimas células por mililitro de concentración media completa fresca en hielo, a continuación, ordene los neutrófilos CD11b positivos, Ly6G, altos daPI negativos en un clasificador de células activado por fluorescencia de acuerdo con los protocolos de clasificación estándar, comprobando la pureza de los neutrófilos aislados en el citómetro de flujo al final del tipo.
Para la inhibición de neutrófilos asociados al tumor in vitro, la semilla 1,5 veces 10 al quinto neutrófilos clasificados en cada uno de los dos pocillos de una placa inferior en U de 96 pocillos y añadir FK866 a una concentración final de 100 nanomolares en medio completo en un pozo y un volumen igual de medio completo solo al otro pozo. Después de dos horas en la incubadora de cultivo celular, lavar las células dos veces con PBS y resuspender los pellets en PBS a la concentración adecuada para la inyección posterior. Los neutrófilos tratados con inhibidores de NAMPT tienen una capacidad significativamente menor para estimular la formación de ramas aórticas en comparación con las células no tratadas.
Además, la inyección subcutánea de neutrófilos antiangiogénicos tratados con inhibidores induce un deterioro significativo en el crecimiento tumoral en comparación con los ratones inyectados con interferón alfa no tratado y neutrófilos de la subunidad del receptor beta 1 noutphils. El examen histológico de los tumores extraídos confirma además la supresión significativa de la angiogénesis en tumores aislados de ratones tratados con neutrófilos asociados al tumor tratados con inhibidores en comparación con los inyectados con neutrófilos noututidos no tratados. Para evaluar las propiedades de los neutrófilos asociados al tumor tratados con FK866, se pueden realizar PCR cuantitativos y Western Blot para estudiar la activación de las vías intracelulares implicadas en la polarización de neutrófilos.
Dado que los neutrófilos son de corta duración, es necesario realizar todos los pasos lo más rápido posible y mantener a los neutrófilos fríos durante todo el procedimiento. Esta técnica allana el camino para el estudio de los mecanismos intracelulares y los factores involucrados en la regulación de las propiedades angiogénicas y tumorigénicas de los neutrófilos asociados al tumor in vivo.
