将操纵的肿瘤相关中性粒细胞转移到肿瘤携带小鼠中,以研究其血管生成潜力在Vivo

我们的协议为评估体内肿瘤相关原发性嗜中性粒细胞的血管生成潜力提供了一种新颖的工具，而无需使用人工嗜中性粒细胞系模型。直接抑制烟酰胺磷脂基转酶， 不久 NAMPT， 在肿瘤相关的嗜中性粒细胞与随后的收养转移到肿瘤轴承动物允许操作嗜中性粒细胞没有系统性的毒性副作用.我们将展示纵的抗血管原性肿瘤相关嗜中性粒细胞在转移到肿瘤承载宿主后的治疗潜力，以研究不同癌症模型中潜在的中性粒细胞基免疫疗法。

要建立同源肿瘤小鼠模型，剃光10个8至12周大雌性干扰素α和β受体亚单位1淘汰小鼠的皮肤用电剃须刀，用70%乙醇消毒皮肤， 然后将每毫升 PBS 的 6 个 B16F10 黑色素瘤细胞加载三倍至 6 个 B16F10 PBS，用 0.4 倍 19 毫米针装入一毫升注射器中，并在后侧翼下皮上注入 100 微升悬浮液，每次剃光动物。对于嗜中性粒细胞的收养转移，将B16F10黑色素瘤细胞稀释至PBS中每毫升浓度6倍至第六细胞，稀释使用NAMPT抑制剂FK866治疗的嗜中性粒细胞，将PBS浓度每毫升的6倍10至第5细胞稀释。然后，以1:10的中性粒细胞与肿瘤比将未经治疗或抑制剂治疗的嗜中性粒细胞与黑色素瘤细胞混合，皮下将100微升细胞注射到每组多达5只小鼠体内。

注射后，将多达5只注射的雌性小鼠放在一个笼中，并在14天内每天使用卡钳测量肿瘤的长度、宽度和深度。注射后第14天，用70%乙醇对每个注射动物的皮肤进行消毒，用剪刀和钳子将肿瘤收获到含有冰上完整介质的50毫升锥形管中。将肿瘤分段进行组织分析，将肿瘤淹没在最佳切温化合物中，将样品冷冻在液氮中，储存在零下80摄氏度。

在分切当天，将样品解冻至零下20摄氏度，然后使用低温仪获得5微米分段。固定非特异性结合后，用感兴趣的主要抗体在20摄氏度下染色一小时，随后在PBS中洗涤三次。最后一次洗涤后，在DAPI等核染色染料中用适当的荧光结合二次抗体染色细胞，在20摄氏度的温度下进行一小时。

在孵化结束时，在20摄氏度下干燥滑梯20分钟，然后用无水安装介质安装样品，然后用盖板盖住每个幻灯片，让安装介质在37摄氏度下干燥1小时，然后用荧光显微镜对组织进行成像。对于肿瘤相关的嗜中性粒细胞分离，将每口5个肿瘤放入无菌六井板的单个孔中，然后用无菌剪刀将肿瘤切成两到三毫米。接下来，在37摄氏度下消化肿瘤片段，用1毫升的脱发胶酶d dnase 1溶液在5%的二氧化碳中，在37摄氏度下45分钟，每15分钟用10毫升注射器混合样品。

在孵育结束时，通过100微米滤株将细胞过滤成每井一个15毫升的管子，以去除未消化的纤维，并将PBS添加到15毫升的最终体积中。通过离心收集分离的细胞，用每管一毫升的解压缓冲液来解压红血球。混合后，将每个管中的内容物组合成一个15毫升的管子，两分钟后停止反应，用11毫升的完全4摄氏度的中等温度。

离心后，将颗粒重新在PBS的一毫升中重新下水，并阻断任何非特异性结合，与三微升的Fc-block抗体在冰上15分钟。在孵化结束时，用抗CD11b和Ly6G抗体和任何其他感兴趣的抗体，加上DAPI，在防光的冰上进行30分钟的孵育。在孵育结束时，用14毫升PBS洗涤细胞，然后以每毫升新鲜完全中等浓度的10倍重新将颗粒重新给第七个细胞， 然后根据标准分拣协议对荧光激活细胞分拣器上的 CD11b 阳性、Ly6G、高 DAPI 阴性嗜中性粒细胞进行排序，在该排序结束时检查流式细胞仪上分离的中性粒细胞的纯度。

对于体外肿瘤相关的嗜中性粒细胞抑制，种子1.5倍10至第五排序的嗜中性粒细胞进入两个孔的96孔U底板和添加FK866到最终浓度100纳米摩尔在完整的介质到一个井和相等体积的完整介质单独到另一个井。在细胞培养培养箱中两小时后，用PBS清洗细胞两次，并在PBS中以适当的浓度重新注入颗粒，以便随后注射。与未经治疗的细胞相比，NAMPT抑制剂治疗的嗜中性粒细胞具有显著降低的刺激大院分支形成的能力。

此外，与注射未经治疗的干扰素α和β受体亚单位1淘汰嗜中性粒细胞的小鼠相比，抑制剂治疗的抗血管性嗜中性粒细胞的皮下注射会导致肿瘤生长的显著损伤。对提取的肿瘤进行组织学检查，进一步证实，与注射未经治疗的核缔中性粒细胞相比，从接受抑制剂治疗的肿瘤相关嗜中性粒细胞治疗的小鼠中分离出的肿瘤中，血管发生作用显著。为了评估FK866治疗的肿瘤相关嗜中性粒细胞的特性，可以进行定量PCR和西叶虫研究与中性粒细胞极化有关的细胞内通路活化。

由于嗜中性粒细胞是短暂的，因此有必要尽快执行所有步骤，并在整个过程中保持嗜中性粒细胞的寒冷。该技术为研究体内肿瘤相关嗜中性粒细胞的血管生成和肿瘤生成特性的细胞内机制和因素的研究铺平了道路。