يوفر بروتوكولنا أداة جديدة لتقييم الإمكانات الوعائية للعدّيات الأولية المرتبطة بالورم في الجسم الحي دون الحاجة إلى استخدام نماذج خط خلايا العدلات الاصطناعية. تثبيط مباشر من الفوسفورية نيكوتيناميد نيستروليففيراز, قريبا NAMPT, في العدلات المرتبطة بالورم مع نقلها بالتبني في وقت لاحق إلى الحيوانات الحاملة للورم يسمح التلاعب العدلات دون آثار جانبية سامة النظامية. سوف نبرهن على الإمكانات العلاجية للعديات المرتبطة بالورم المضاد للأوعية العصبية بعد نقلها إلى مضيفين يحملون الورم لدراسة العلاجات المناعية المحتملة المستندة إلى العدلات في نماذج السرطان المختلفة.
لإعداد نموذج فأر ورم مسبب للحساسية ، حلق الجلد من 10 إلى 12 أسبوعًا من العمر إناث إنترفيرون ألفا وبيتا مستقبلات فرعية 1 فئران بالضربة القاضية مع ماكينة حلاقة كهربائية وتطهير الجلد بالإيثانول بنسبة 70٪ ، ثم تحميل ثلاث مرات 10 إلى الخلايا الست B16F10 سرطان الجلد في المليلتر من برنامج تلفزيوني في حقنة ملليلتر واحدة مجهزة بإبرة 0.4 من 19 ملليمتر وحقن 100 ميكرولترات من التعليق تحت الجلد على الجناح الخلفي في كل حلق الحيوان. لنقل العدلات بالتبني، تمييع خلايا الورم الميلانيني B16F10 إلى ست مرات 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر تركيز في PBS وتمييع العدلات تعامل مع مثبطات NAMPT FK866 إلى ست مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من تركيز PBS. ثم، مزيج العدلات غير المعالجة أو المثبطة المعالجة مع خلايا سرطان الجلد في نسبة العدلات إلى الورم من 1:10 وحقن تحت الجلد 100 ميكرولترات من الخلايا في ما يصل إلى خمسة فئران لكل مجموعة.
بعد الحقن، ضع ما يصل إلى خمسة فئران أنثى تم حقنها في قفص واحد واستخدم الفرجر لقياس طول الورم وعرضه وعمقه كل يوم لمدة 14 يومًا. في اليوم 14 بعد الحقن، وتطهير الجلد من كل حقن مع 70٪ الإيثانول واستخدام مقص ملقط لحصاد الأورام في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر تحتوي على متوسطة كاملة على الجليد. لقسم الأورام للتحليل النسيجي، غمر الأورام في مجمع درجة حرارة القطع الأمثل وتجميد العينات في النيتروجين السائل للتخزين عند ناقص 80 درجة مئوية.
في يوم اقسام، ذوبان العينات إلى ناقص 20 درجة مئوية قبل استخدام cryotome للحصول على خمسة ميكرومتر أقسام. بعد التثبيت في الربط غير محددة، وصمة عار أقسام أنسجة الورم مع الأجسام المضادة الأولية من الفائدة لمدة ساعة واحدة في 20 درجة مئوية، تليها ثلاثة يغسل في برنامج تلفزيوني. بعد الغسيل الأخير، وصمة عار الخلايا مع جسم مضاد ثانوي مترافق fluorescence المناسبة في صبغة تلطيخ نووي مثل DAPI لمدة ساعة واحدة في 20 درجة مئوية محمية من الضوء.
في نهاية الحضانة، يجف الشرائح لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية محمية من الضوء قبل تركيب العينات مع وسيط تصاعد لا يئي، ثم تغطية كل شريحة مع زلة غطاء والسماح لوسيلة تصاعد لتجف لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية قبل تصوير الأنسجة عن طريق المجهر الفلوري. لعزلة العدلات المرتبطة بالورم، ضع خمسة أورام في البئر في آبار فردية من لوحة ستة آبار معقمة حيث يتم حصادها واستخدام مقص معقمة لرمز الأورام إلى قطعتين إلى ثلاثة ملليمترات. بعد ذلك، هضم شظايا الورم مع ملليلتر واحد من الكولاجيناز د dnase 1 حل لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الرطوبة، وخلط العينات مع حقنة 10 ملليلتر كل 15 دقيقة.
في نهاية الحضانة، تصفية الخلايا من خلال 100 ميكرومتر مصافي في أنبوب واحد 15 ملليلتر في بئر لإزالة الألياف غير مهضومة وإضافة برنامج تلفزيوني إلى حجم النهائي من 15 ملليلتر. جمع الخلايا المتفككة عن طريق الطرد المركزي وlyse خلايا الدم الحمراء مع ملليلتر واحد من عازلة تحلل في الأنبوب الواحد. بعد الاختلاط ، والجمع بين محتويات كل أنبوب في أنبوب واحد 15 ملليلتر ، ووقف رد الفعل بعد دقيقتين مع 11 ملليلتر من المتوسط أربع درجات مئوية كاملة.
بعد الطرد المركزي، resuspend بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني ومنع أي ربط غير محددة مع ثلاثة microliters من الأجسام المضادة FC-كتلة لمدة 15 دقيقة على الجليد. في نهاية الحضانة، وتسمية الخلايا مع المضادة لـ CD11b و Ly6G الأجسام المضادة وأية أجسام مضادة أخرى ذات أهمية، بالإضافة إلى DAPI، لاحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد المحمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا في 14 ملليلتر من برنامج تلفزيوني وإعادة تعليق الكريات في مرة واحدة 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر من تركيز متوسط كامل جديد على الجليد، ثم فرز CD11b إيجابية، Ly6G، العدلات DAPI-السلبية عالية على فارز الخلية المطهرة الفلورية وفقا لبروتوكولات الفرز القياسية، والتحقق من نقاء العدلات المعزولة على جهاز قياس تدفق في نهاية هذا النوع.
لتثبيط العدلات المرتبطة بالورم في المختبر، بذور 1.5 مرات 10 إلى العدلات الخامسة المرتبة في كل من بئرين من لوحة U-القاع 96-well وإضافة FK866 إلى تركيز نهائي من 100 نانوموللار في المتوسط الكامل في بئر واحد وحجم متساو من المتوسط الكامل وحده إلى بئر أخرى. بعد ساعتين في حاضنة ثقافة الخلية، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وإعادة تعليق الكريات في برنامج تلفزيوني في التركيز المناسب للحقن اللاحقة. إن العدلات المعالجة في مثبطات NAMPT لديها قدرة متناقصة بشكل كبير لتحفيز تكوين الفرع الأبهري مقارنة بالخلايا غير المعالجة.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن الحقن تحت الجلد من العدلات المضادة للأنجيوجينية المعالجة بالمثبطات تحفز ضعفًا كبيرًا في نمو الورم مقارنة بالفئران التي يتم حقنها مع الإنترفيرون ألفا غير المعالجة و subunit 1 بالضربة القاضية. الفحص النسيجي للأورام المستخرجة يؤكد كذلك قمع كبير من تولد الأوعية في الأورام المعزولة من الفئران المعالجة مع العدلات المرتبطة بالورم المعالجة بالمثبطات مقارنة بتلك التي حقنت مع العدلات خروج المغلوب غير المعالجة. لتقييم خصائص العدلات المرتبطة بالورم المعالجة FK866 ، يمكن إجراء PCR الكمي وBlot الغربي لدراسة تنشيط المسارات داخل الخلايا المشاركة في استقطاب العدلات.
منذ العدلات قصيرة الأجل، فمن الضروري لأداء جميع الخطوات في أسرع وقت ممكن، والحفاظ على العدلات الباردة خلال العملية بأكملها. هذه التقنية تمهد الطريق لدراسة الآليات والعوامل داخل الخلايا المشاركة في تنظيم خصائص الأوعية الدموية والأورام من العدلات المرتبطة بالورم في الجسم الحي.
