אנו מודים חברי המעבדה Ninov להערות על כתב היד, חברי מרכז למתקן דגים, מיקרוסקופיה דרזדן טיפולים משובי (CRTD) לקבלת סיוע טכני. N.N. נתמך על ידי מימון DFG-CRTD, אשכול התמחות TU-דרזדן, קרן מחקר גרמני (DFG) ואל מרכז גרמנית עבור סוכרת מחקר (DZD).

כל ההליכים לרבות נושאים בעלי חיים אושרו על ידי חוק רווחת בעלי חיים, עם אישור של Sachsen Landesdirektion, גרמניה (AZ 24 – 9168.11-1/2013-14, טי12/2016).
1. הכנה
הערה: פרוטוקול זה הוא עבור ex-vivo הדמיה של דג זברה איון העיקרי של Tg הטרנסגניים כפול (ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg (ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 19 דג זברה. בשורה זו מהונדס, האמרגן אינסולין (ins) כוננים תאי בטא ביטוי ספציפי של שני transgenes: nls-Renilla-mKO2, אשר מסמנת את הגרעין של תאי הבטא עם Kusabira monomeric כתום 2 (mKO2) זריחה; GCaMP6s15, אשר פולט קרינה פלואורסצנטית ירוק בתגובה: גידול רמות הסידן תאיים. הביטוי בטא-תא-ספציפי של GCaMP6s מאפשר ללמוד הגלוקוז-התגובה של תאי הבטא ללא הפרעה משינויי סידן המקיף סוגי תאים.
<ol><li>להכין מלאי פיברינוגן טריים (10 mg/mL) על ידי המסת 10 מ ג של פיברינוגן שור תוך 1 מ"ל של Ca2 +/Mg2 +-המכיל תמיסת מאוזנת מלח הנקס (HBSS) בשפופרת צנטרפוגה 1.5 mL. מערבולת נמרצות עד האבקה פיברינוגן מתמוסס לחלוטין. שמור את הפתרון בטמפרטורת החדר למשך לפחות עוד 15 דקות. הערה: המניה יכול להישמר בטמפרטורת החדר במשך 2-3 ח' להשליך המניה אם הפתרון מתחיל פולימריזציה, הופך צמיגה.</li>
	<li>הכן הפתרון עובד פיברינוגן (3.3 mg/mL) על ידי דילול המניה פיברינוגן HBSS בתוך החולוני. לדוגמה, מערבבים 300 µL של פיברינוגן מניות של 600 µL של HBSS להכין µL 900 של הפתרון עובד פיברינוגן.</li>
	<li>להכין תרומבין פתרון (10 U/mL) על ידי המסת 10 יחידות של תרומבין ב 1 מ"ל של HBSS או פוספט buffered תמיסת מלח (PBS). הערה: פתרון זה יכול להיות מוכן מראש, aliquoted 50 חלקים µL, קפוא ב-20 ° C.</li>
	<li>להכין 200 מ"מ תמיסת גלוקוז D על ידי המסת 1.8 g של D-גלוקוז ב- 50 מ ל מים. שמור 4 ° C לאחסון לטווח ארוך.</li>
	<li>להכין 300 מ"מ אשלגן כלורי פתרון על ידי המסת g 1.1 של אשלגן כלורי ב- 50 מ ל מים. שמור 4 ° C לאחסון לטווח ארוך.</li>
	<li>להשיג 35 מ מ קוטר זכוכית-התחתון מנות להרכבה על איים קטנים.</li>
	<li>לנתיחה, הרכבה של איון, להשתמש במיקרוסקופ סטריאו מצויד עם פלורסצנטיות המנורה ואת מסנן אדום קוביה (TRITC: עירור: 532 – 554 ננומטר, פליטה: 570-613 ננומטר; או טקסס-אדום: עירור: 540-580 nm, פליטה: 592 – 667 ננומטר).</li>
	<li>הדמיה זרם סידן בתאי בטא, שימוש מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה (Zeiss LSM 780 או דומה) עם 20 X (0.8 NA) אוויר המטרה ומצוידים בעל לוחית הכלים למטה זכוכית בקוטר 35 מ מ.</li>
	<li>היכונו המתות חסד את דג זברה פתרון 200 מ ג/ליטר של tricaine מתאן סולפונאט (MS222).</li>
	<li>להביא צלחות פטרי 90 מ מ רוברט דג זברה.</li>
</ol>2. דג זברה ראשי איון לנתיחה מכשירי הרכבה
<ol><li>המתת חסד דג באמצעות דגירה ממושך ב- MS222. בשביל זה, להסיר את הדג מן האקווריום באמצעות רשת דיג ובעדינות דגירה אותו בצלוחית המכילה את הפתרון MS222 עד החיה מראה אין תנועה opercular (זימים); בדרך כלל, זה לוקח 5 דק העברת הדג על צלחת פטרי המכילות את הפתרון HBSS עם Ca2 +/Mg2 +.</li>
	<li>
תחת מיקרוסקופ סטריאו מצויידים המנורה פלורסצנטיות, מסנן אדום קוביה, לנתח את העור המכסה את הצד הימני של הבטן של החיה כדי לבודד את הלבלב.
	<ol>
<li>בשביל זה, לחתוך את העור של דג זברה מפי לפין אנאלי באמצעות מלקחיים חדה. לקלף את העור לחתוך כדי לחשוף את הבטן; החיתוך הזה חושף את האיברים הפנימיים. באמצעות פלואורסצנטי אדום את הביטוי mKO2 בתאים-ביתא, לוודא שמיקום איונים בבדיקה חזותית מתחת למיקרוסקופ. במידת הצורך, הסר את אונות הכבד, כפי הם יכולים לכסות את איון, ולכן קשה למצוא. הערה: איון הראשי ממוקם ליד האזור הקדמי של הבטן, בדרך כלל בצד ימין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לנקות את איון הראשי על-ידי בקפידה הסרת הרקמה הסובבת כגון הכבד, adipocytes. לנקוט אמצעי זהירות לא כדי לפגוע או לתקוע את איון; לאחר ניקוי של הרקמה שמסביב, תאים נפרדים על פני איון להיות ניכרת.</li>
	<li>Pipette טיפה 30 µL HBSS במרכז צלחת זכוכית-התחתון. להעביר את איון גזור הזה טיפה.</li>
	<li>לשטוף היטב את איון פעם אחת עם HBSS ופעם אחת עם 30 µL של הפתרון עובד פיברינוגן (3.3 mg/mL). לוודא למנוע ייבוש של איון במהלך השלבים כביסה בגלל כשל לשם כך התוצאה היא מוות של תאים.</li>
	<li>לאט ובעדינות להוסיף 10 µL של הפתרון תרומבין (10 U/mL). להשאיר את איון ואת המנה לא נגעה במשך 15-20 דקות להתבונן כי הירידה פיברינוגן-תרומבין יהפכו צמיגה כמעצמה בשלב זה.</li>
</ol>3. לשעבר Vivo לחיות-הדמיה של GCaMP עוצמת קרינה פלואורסצנטית ב איונים ראשי דג זברה
<ol><li>להוסיף 200 µL של HBSS על העובש ולמקם את המנה בקפידה את המחזיק לוחית מיקרוסקופ קונפוקלי. השתמש מטרה אוויר 20 X, 0.8 NA, עבור הדמיה קונפוקלי. אתר את איון באמצעות האפשרות brightfield.</li>
	<li>באמצעות המסנן עבור פלואורסצנטי אדום כדי להציג את זריחה mKO2 הגרעין בתאים-בטא, להתמקד איון. גרעינים בודדים צריך להיות ברור לעין.</li>
	<li>אתר מטוס הדמיה ברורה על-ידי שינוי ידני של מטוס מוקד של מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לעבור בין עובי איון לאורך ציר z. ודא כי המטוס הדמיה מכיל מספר מספיק (50-100) של תאי הבטא עבור הדמיה, בהירות זריחה mKO2 גרעיני הוא אחיד, במיוחד במרכז של איון.</li>
	<li>להגדיר על רכישת רציפים עבור זריחה GCaMP6s ו- mKO2 באמצעות ההגדרות הבאות ב "בתפריט הגדרה חכם": GCaMP6s, עירור: 488 ננומטר, פליטה: 500-555 ננומטר, שווא-צבע: ירוק (בחר "GFP"); mKO2, עירור: 561 nm (mCherry), פליטה: 570 – 630 ננומטר, שווא-צבע: אדום (בחר "mCherry"). הערה: עם הגדרה זו, הערוץ האדום יתעד את המיקום של גרעיני תאי בטא, בעוד לערוץ הצבע הירוק יהיה שיא עוצמת קרינה פלואורסצנטית GCaMP.</li>
	<li>במצב של"רכישת" הגדר את רזולוציית התמונה 1,024 x 1,024 פיקסלים, מהירות ב-10 ו בממוצע ב- 1. החניך רציפה מקליט על-ידי בחירה באפשרות של "זמן-סדרה", והגדרת "משך" 500 מחזורי, עם-2 s רכישת זמן לכל מסגרת. הערה: מסגרות 50 הראשונים של סדרת הזמן תואמות הפעילות של תאי הביתא-ריכוז גלוקוז 5 מ מ. זוהי התגובה הבסיסית. בטא-תא מגיבה יראה מתמלא, מתמעט בעוצמת פלורסצנטיות ירוק עם הזמן. הבחנו כי כמה (1 – 5%) של תאי הביתא נעים-גלוקוז 5 מ מ.</li>
	<li>
לפקוח עין על מחזור הדמיה. לאחר הראשונה 50 מסגרות, להגדיל את ריכוז הגלוקוז הפתרון המקיף 10 מ מ בלי לעצור את ההקלטה.
	<ol>
<li>ללא perturbing רכישת התמונה, בעדינות פיפטה 5 µL של 200 מ מ D-גלוקוז פתרון על גבי הג'ל מחזיק את איון. לרכוש מסגרות 150-גלוקוז 10 מ מ. הערה: העלייה בריכוז הגלוקוז יגדיל את מספר תאי בטא-עוברת תנודות פלורסנט GCaMP בערוץ ירוק.</li>
		<li>להבטיח הגרעינים של התאים יישארו יציבים במהלך התהליך. אם איון היא רועדת בהרחבה במהלך רכישת ופועלים הגרעינים מהמטוס מוקד, למחוק את הדגימה (במידת הצורך).</li>
		<li>לחכות תקופה מספקת כדי לאפשר פלמור של העובש פיברינוגן-תרומבין על מנת להבטיח את היציבות של דגימות עוקבות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ב 200 מסגרות, להגביר עוד יותר את הריכוז של הפתרון 20 מ מ על ידי בעדינות pipetting µL 10 מ מ 200 תמיסת גלוקוז-D. לרכוש מסגרות 150 עבור ריכוז 20 מ מ.</li>
	<li>אחרי 350 מסגרות, depolarize את איון באמצעות 30 מ מ של אשלגן כלורי. בשביל זה, להוסיף 20 µL של 300 מ מ פתרון מניות אשלגן כלורי. בשלב זה, להתבונן תנודות זריחה GCaMP6s להפסיק ולתקן בעוצמה גבוהה; תאי הבטא שלא הגיבו לגלוקוזה יכול גם להציג עלייה בעוצמת ירוק-זריחה על תוספת אשלגן כלורי.</li>
</ol>4. כימות של GCaMP עקבות קרינה פלואורסצנטית בטא-לתאים בודדים
הערה: כדי לאתר ולכמת את התגובות של בטא-תאים בודדים רמות משתנות של גלוקוז, לכמת את עוצמת קרינה פלואורסצנטית GCaMP עבור כל התקופה הדמיה. כימות מתבצע ברזולוציה הסלולר. לשם כך, השתמש פיג'י20 כדי לחלץ את ערכי העוצמה של זריחה GCaMP תמונות (צעדים 4.1 – 4.6), ואת תוכנת הגיליון האלקטרוני או R21 לבצע ניתוח (שלבים 4.8-4.9).
<ol><li>פתח את קובץ התמונה בפיג'י באמצעות "ארגז הכלים LSM". לשם כך, בחר "תוסף | ארגז הכלים LSM | הצג את ארגז הכלים LSM". בארגז הכלים"LSM", לחץ על "פתח LSM" ובחר את קובץ התמונה. הערה: עבור תבניות אינה נתמכת על ידי "ארגז הכלים LSM", להמיר אותם תחילה על tiff לניתוח.</li>
	<li>לחלץ את התגובות של תאים באמצעות הכלי (ROI) אזור-של-עניין בפיג'י. פתח את 'מנהל רועי"בתפריט ' 'נתח' ' תחת"כלים". צייר באופן ידני את רועי באמצעות "הבחירה בכלי מצולע" הממוקם בסרגל הכלים.</li>
	<li>ציירו רועי בערוץ האדום שבו האטומים תאי בטא גלויים. בחר את רועי כזה כי זה מכסה שטח גדול יותר גרעין של התא כדי לכלול חלק הציטופלסמה של התא. ודא כי המיקום רועי עקבית בין מסגרות ולהתאים את המיקום במידת הצורך.</li>
	<li>להוסיף את ROIs שנבחר למנהל"רועי" על ידי לחיצה על לחצן "הוסף [t]". בחר ולהוסיף ROIs מרובים רועי להשגת נתונים על תאים מרובים.</li>
	<li>לאחר מכן, בתפריט ' 'נתח' ', בחר "קביעת המידות". בחר "צפיפות משולב" לציון החילוץ של עוצמת קרינה פלואורסצנטית הכולל בתוך האזור.</li>
	<li>להעביר לערוץ הצבע הירוק המכיל את זריחה GCaMP ובחר "ריבוי אמצעי" במנהל"רועי". הערה: פעולה זו תספק את המידות העוצמה עבור התאים לאורך כל סדרת הזמן.</li>
	<li>במקרה לתנוחה רועי צריכה תיקון עקב תנועת איון, באופן ידני לקמפל את המידות בעוצמה במסגרות שונות. העתק והדבק את הערכים לגיליון אלקטרוני נפרדים.</li>
	<li>להשיג חותמות הזמן של מסגרות תמונה של "ארגז הכלים LSM". שימוש "להחיל בולים | החלת טי בולים | שם קובץ | לטיפוסים textfile"כדי להשיג את חותמות זמן. שמור חותמות זמן שימוש באפשרות "שמור בשם", או להעתיק אותם לתוך הגיליון האלקטרוני.</li>
	<li>בעת קימפול את ערכי העוצמה של כל התאים, לבצע את ניתוח תא אחד בכל פעם או באופן אוטומטי (לדוגמה, שימוש בנוסחאות Excel או R).</li>
	<li>
לנתח תאים בודדים בשני שלבים.
	<ol>
<li>בשלב הראשון, לחשב את עוצמת קרינה פלואורסצנטית מעל לקו הבסיס. לשם כך, לחשב את עוצמת ניאון בסיסית (F0) כממוצע של עוצמות קרינה פלואורסצנטית עבור מסגרות קודם 50 (גלוקוז 5 מ מ). ואז מהמסיכה הבסיס (F0) בזמן-הסדרה כולה (F-F0). הערה: כמה תאים באפשרותך להציג ברור תנודות GCaMP תחת הבסיס גלוקוז, אשר בדרך כלל ממשיכים בעקבות גירוי עם ריכוזים גבוהים יותר. עבור תאים כאלה, זה רק ניתן לאמוד F0 על ידי לקיחת עוצמת אכזרי של המסגרות הראשוני שבו התאים הראו ירידה זריחה.</li>
		<li>בשלב השני של הניתוח, לקבל את עוצמת קרינה פלואורסצנטית GCaMP סופית על-ידי נרמול עוצמת קרינה פלואורסצנטית. הערה: זה מבוצע כדי להסיר את ההבדלים בין איים קטנים של בעלי חיים שונים. איים בודדים להציג רמות משתנות של פליטת קרינה פלואורסצנטית על גירוי גלוקוז.</li>
		<li>לנרמל את עוצמת קרינה פלואורסצנטית חילוק זה עם הערך הגבוה ביותר בעוצמה. בשביל זה, לחשב את עוצמת שיא (Fמקסימום – F0) או חילוק הערכים הבסיסיים המופחת באינטנסיביות שיא להניב את עוצמת קרינה פלואורסצנטית GCaMP הסופי (F-F0) / (Fמקסימום – F0).</li>
	</ol>
</li>
	<li>למחוק את התאים לא מוצג שינוי בעוצמת בעקבות גירוי אשלגן כלורי, כפי שהם עשויים להיות לא בריא או פגום.</li>
	<li>לביצוע הניתוח (שלבים 4.9-4.10) ב- R, להשתמש בסקריפט R (plotcelltrace. R) מסופק עם כתב היד הזה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kahn, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+contributions+of+insulin+resistance+and+beta-cell+dysfunction+to+the+pathophysiology+of+Type+2+diabetes.">The relative contributions of insulin resistance and beta-cell dysfunction to the pathophysiology of Type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 46 (1), 3-19 (2003).</li><li>Ogurtsova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDF+Diabetes+Atlas:+Global+estimates+for+the+prevalence+of+diabetes+for+2015+and+2040.">IDF Diabetes Atlas: Global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and 2040.</a> Diabetes Res Clin Pract. 128, 40-50 (2017).</li><li>Pipeleers, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+pancreatic+beta-cell+population.">Heterogeneity in pancreatic beta-cell population.</a> Diabetes. 41 (7), 777-781 (1992).</li><li>MacDonald, P. E., Joseph, J. W., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-sensing+mechanisms+in+pancreatic+beta-cells.">Glucose-sensing mechanisms in pancreatic beta-cells.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 360 (1464), 2211-2225 (2005).</li><li>Hellman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+induces+oscillatory+Ca2++signalling+and+insulin+release+in+human+pancreatic+beta+cells.">Glucose induces oscillatory Ca2+ signalling and insulin release in human pancreatic beta cells.</a> Diabetologia. 37, S11-S20 (1994).</li><li>Bergsten, P., Grapengiesser, E., Gylfe, E., Tengholm, A., Hellman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+oscillations+of+cytoplasmic+Ca2++and+insulin+release+in+glucose-stimulated+pancreatic+islets.">Synchronous oscillations of cytoplasmic Ca2+ and insulin release in glucose-stimulated pancreatic islets.</a> J Biol Chem. 269 (12), 8749-8753 (1994).</li><li>Wollheim, C. B., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+cytosolic+free+Ca2++and+insulin+release+in+an+insulin-secreting+cell+line.">Correlation between cytosolic free Ca2+ and insulin release in an insulin-secreting cell line.</a> J Biol Chem. 259 (4), 2262-2267 (1984).</li><li>Pace, C. S., Price, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+responses+of+pancreatic+islet+cells+to+secretory+stimuli.">Electrical responses of pancreatic islet cells to secretory stimuli.</a> Biochem Biophys Res Commun. 46 (4), 1557-1563 (1972).</li><li>Ohara-Imaizumi, M., Nakamichi, Y., Tanaka, T., Ishida, H., Nagamatsu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+exocytosis+of+single+insulin+secretory+granules+with+evanescent+wave+microscopy:+distinct+behavior+of+granule+motion+in+biphasic+insulin+release.">Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with evanescent wave microscopy: distinct behavior of granule motion in biphasic insulin release.</a> J Biol Chem. 277 (6), 3805-3808 (2002).</li><li>Soria, B., Martin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+calcium+oscillations+and+insulin+release+in+pancreatic+islets+of+Langerhans.">Cytosolic calcium oscillations and insulin release in pancreatic islets of Langerhans.</a> Diabetes Metab. 24 (1), 37-40 (1998).</li><li>Kenty, J. H. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+pancreatic+islet+function+at+the+single+cell+level+by+calcium+influx+with+associated+marker+expression.">Testing pancreatic islet function at the single cell level by calcium influx with associated marker expression.</a> PLoS One. 10 (4), e0122044 (2015).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-sensitive+fluorescent+dyes+and+intracellular+Ca2++imaging.">Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 83-99 (2013).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+quiescent+and+proliferative+pancreatic+beta-cells+identified+by+HOTcre+mediated+labeling.">Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 14896-14901 (2009).</li><li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase.">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).</li><li>Singh, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+developmental+histories+of+beta-cells+generate+functional+and+proliferative+heterogeneity+during+islet+growth.">Different developmental histories of beta-cells generate functional and proliferative heterogeneity during islet growth.</a> Nat Commun. 8 (1), 664 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676 (2012).</li><li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A Language and Environment for Statistical Computing. , (2016).</li><li>Friedman, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolving+autoimmune+microenvironment+regulates+the+quality+of+effector+T+cell+restimulation+and+function.">An evolving autoimmune microenvironment regulates the quality of effector T cell restimulation and function.</a> Proc Natl Acad Sci. 111 (25), 9223-9228 (2014).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+&#946;-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature &#946;-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+&#946;+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of &#946; cells.</a> Nat Commun. 7, 11756 (2016).</li><li>Johnston, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+Cell+Hubs+Dictate+Pancreatic+Islet+Responses+to+Glucose.">Beta Cell Hubs Dictate Pancreatic Islet Responses to Glucose.</a> Cell Metab. 24 (3), 389-401 (2016).</li></ol>

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן אנחנו מדגימים טכניקה עבור כימות של תאי בטא תגובתיות גלוקוז ברזולוציה תא בודד. זה התאפשר על ידי ניטור ריכוז הסידן תאיים באמצעות מחוון בקידוד גנטית סידן, GCaMP6s. פעילות תאי בטא היא הלכוד שמחוץ על ידי הרכבה של איון בתבנית פיברינוגן-תרומבין. שלב קריטי של הפרוטוקול הוא היציבות של העובש. מספיק זמן צריך להינתן עבור פיברינוגן להמיס הפתרון HBSS. בלי זה, כייר לא פולימריזציה מספיק כדי לספק יציבות במהלך הפגישה הדמיה. איון הוטענו פיברינוגן-תרומבין עובש, שקוע בתוך התא תרבות המדיה יכול להישאר בר קיימא לשבוע לפחות (נתונים לא מוצג). חלופות כייר פיברינוגן-תרומבין, כגון agarose נמוך-להמיס, יכול להיות מנוצל כדי לטעון את איון22. פרמטר קריטי נוסף הוא ניתוח איון. במהלך שלב זה, רקמות המקיפים את איון צריך להיות מוסר ללא ופצעו או תוקע איון. . הקרע מיומן מגיע עם תרגול.
מגבלה של פרוטוקול הדמיה הוא צמצום למישור קונאפוקלית אחד של איון. זה נעשה כדי ללכוד את הדינמיקה של סידן זרם בתוך ביתא-תאים בודדים. Z-מחסנית דרך כל עובי איון מוביל נמוך הדמיה מהירויות, לאבדן קשר מתנדנדות תאים בודדים. מגבלה זו יכולים להשתפר תוך שימוש באמצעים מהירים קונאפוקלית-הדמיה כגון מיקרוסקופ ספינינג-דיסק, כדי לאפשר את הדינמיקה סידן בממדים-3. גבול נוסף יהיה ויוו סידן הדמיה12. הטבע שקוף של דג זברה העובר או השימוש של פיגמנט-פחות זנים של דג זברה מבוגרים23 היתה לפתוח את האפשרות ויוו הדמיה בעתיד.
ההדמיה של פעילות תאי בטא ברזולוציה גבוהה יכולות מאפשר לחקור את הטרוגניות פונקציונלי בין ביתא-תאים בודדים. גישה זו יכולה לסייע לשפוך אור על קיומו של תאי בטא תת אוכלוסיות. לאחרונה, מחקרים רבים הראו קיומה של תת אוכלוסיות של תאי הבטא נומינלית הומוגנית24,25,26. Ex-vivo הדמיה ניתן לשלב עם כתבים גנטית כדי לאפיין מתגובה של תת-האוכלוסייה גלוקוז. בנוסף, שילוב של הגדרת הדמיה עם גירוי תרופתי יכול לאפשר להקרנה של תרכובות יכול לשפר את הפונקציונליות של תאי בטא.
לסיכום, הטכניקה המובאת כאן מאפשר כימות והשוואה בין התגובה גלוקוז בטא-לתאים בודדים. הוא מספק חלון ישירה לתוך תאי בטא פונקציונליות, פרמטר חשוב בהתפתחות סוכרת.

הגלוקוז בדם שלנו נשמר בטווח צר, בעיקר בזכות הפונקציה בלבלב האנדוקרינית. תפקיד האנדוקרינית הלבלב מתבצע על ידי איי לנגרהנס, אשר מכילים תאים מפריש הורמון. הורמון האינסולין-תאי הבטא אחראים הפחתת רמות הגלוקוז בדם לאחר ארוחה המכילה פחמימות. הפרשת האינסולין לקוי של תאי בטא יכול לגרום סוכרת1, אשר מאופיין על ידי מתמשכת הגלוקוז בדם גבוהה. סוג 1 וסוכרת מסוג 2, אשר פוגעת כיום יותר מ- 400 מיליון אנשים ברחבי העולם, מוביל התחלואה והתמותה2. על ידי חוקר את הגורמים המולקולריים וסביבתיים שתורמים בתפקוד תאי בטא, אנחנו יבין טוב יותר איך לפתח סוכרת מסוג 2 מתחיל ולא מתקדמת. בנוסף, היכולת להבדיל תאי גזע אנושי לתוך תאי הבטא פונקציונלי במבחנה יכול לספק מקור של בטא-תאים חדשים תא-החלפת טיפולים בסוכרת מסוג 1. לשם כך, חשוב ללמוד ההבשלה מודל גנטי אורגניזמים ותפקוד תאי בטא כדי להשיג את הידע הדרוש לייצור תאי הבטא פונקציונלי בקערה.
תאי בטא פונקציונליות ניתן לנטר באותה רמת שלמה-איון מאת לכימות הסכום הכולל של אינסולין מופרש בתגובה גלוקוז-גירוי. גישה זו מצטברת מחקרים של איון כקבוצה אחת של תאים ללא הבחנה המאפיינים הבודדים של התא. עם זאת, ניתוח הנתונים של גלוקוז תגובות של בטא-תאים בודדים גילה מגוון המאפיינים הפונקציונליים של תאי ביתא-ואת הנוכחות של הטרוגניות3. כדי להעריך את הפונקציה של בטא-תאים בודדים, זה אפשרי לעקוב אחר שינויים תאיים להוביל הפרשת אינסולין4. הפרשת האינסולין קודם כניסה של גלוקוז לתוך תאי הבטא. גלוקוזה זה מזין תאי הבטא עובר מטבוליזם במהירות ל ATP. ריכוז גבוה של ATP תאיים להקטין את ההסתברות פתוח של תעלות יונים של אשלגן תלויית ATP המוביל אל תאי בטא דפולריזציה. דפולריזציה פתיחת תעלות היונים מתח רגיש סידן ומגביר את הסידן תאיים. בתורו, הסידן מפעיל אקסוציטוזה של אינסולין, אשר מופץ במחזור הדם, מוריד את רמות הגלוקוז על ידי קידום גלוקוז-ניצול5,6,7.
מספר אסטרטגיות הוחלו לחקור את תפקוד תאי הבטא, כולל ניטור של פוטנציאל הממברנה8, פריט חזותי ישיר של אינסולין-שלפוחית אקסוציטוזה9, כימות של Ca תאיים2 + זרם כמדד גלוקוז-תגובתיות10. ביניהם, הדמיה של Ca תאיים2 + מספק את היתרון של הניתוח בתאים בודדים מרובים בתוך אותו איון11,12, המאפשר השוואה ישירה של הגלוקוז-התגובה בין למעלה-קנה מידה בטא-תאים בודדים. Ca תאיים2 + ריכוז ניתן לנטר בעזרת צבעי פלורסנט סידן רגיש13 או סידן מקודד גנטית אינדיקטורים (GECIs)14. ואילו סידן-מחוון צבע חוסר סוג התא ירידה לפרטים, GECIs יכול להתבטא סוג תא מסוים על ידי היזמים ספציפיים. בנוסף, הדור החדש של GECIs, כגון GCaMP6, מספק יחס אות לרעש טוב יותר יחד עם מהר טמפורלית dynamics15. כאן נתאר את התועלת של הדור החדש של GECIs, ב GCaMP6s מסוים, כדי להמחיש סידן בתאי בטא ברזולוציה תא בודד. אנו מיישמים שיטה זו כדי איון העיקרי דג זברה כמודל שלנו להתמקד. במהלך התפתחות עובריים, ביתא-תאים איון הראשי מקורן מהראש, הלבלב הגחוני / ניצנים16. איון העיקרי הינו ממוקם במיקום האנטומי סטריאוטיפי בתוך הלבלב דג זברה, המאפשרת בידוד וזיהוי קל שלה. בטא-תאים איון העיקרי נחוצים גלוקוז-תקנה, כפי אבלציה הגנטי שלהם מוביל היפרגליקמיה17,18. יתר על כן, הביתא-תאים אלה הופכים גלוקוז מגיב במהלך התפתחות מוקדמת של דג זברה19. פרוטוקול זה ניתן להחיל גם על הדמיה איונים המשני, המהווים בשלבים עובריים פוסט. הפרוטוקול מאפשר תמונה תאי בטא- ex-vivo, בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות ותחת ריכוזי גלוקוז מוגדרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="79">
			<td height="79" style="height:79px;width:276px;">Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">By request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">495015-0001-000</td>
			<td style="width:291px;">SteREO Discovery.V8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Fluorescence lamp</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">423013-9010-000</td>
			<td style="width:291px;">Illuminator HXP 120 V</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Red Filter Cube</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">000000-1114-462&#160;</td>
			<td style="width:291px;">Filter set 45 HQ TexasRed</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">LSM 780</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine fibrinogen</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td>F8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBSS (Hanks&#39; Balanced Salt solution)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">35 mm diameter glass-bottom dishes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>150680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tricaine methane sulfonate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">E10521&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:344px;">11445-12</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">R, version 3.2.4</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">RStudio</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">https://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">plotcelltrace.R</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">A custom script provided with the manuscript</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of beta-cell function using single-cell resolution calcium imaging in zebrafish islets

בתאי בטא בלבלב להגיב הגדלת ריכוזים של גלוקוז בדם על ידי הפרשת הורמון ה אינסולין. תפקוד תאי בטא-מוביל היפרגליקמיה השלכות חמורות, סכנת חיים. הבנת איך תאי הבטא פועלים בתנאים פיזיולוגיים, איזה גורמים גנטיים וסביבתיים עלול לגרום שלהם לקוי עלול להוביל אפשרויות טיפול טובות יותר עבור חולי סוכרת. היכולת למדוד את רמות הסידן בתאים-בטא מהווה אינדיקטור חשוב של תפקוד תאי בטא, כמו זרם של שחרור אינסולין גורמים מפעילים של יונים של סידן. כאן נתאר פרוטוקול עבור ניטור זרם סידן מגורה-גלוקוז בתאים-דג זברה בטא באמצעות GCaMP6s, חיישן מקודדים גנטית של סידן. השיטה מאפשרת ניטור הדינמיקות סידן תאיים עם רזולוציה תא בודד ב- לשעבר vivo רכוב איונים. הגלוקוז-התגובה של תאי הבטא בתוך איון אותו ניתן ללכוד בו זמנית תחת ריכוזי גלוקוז שונים, אשר מצביע על הנוכחות של הטרוגניות פונקציונלי בין דג זברה בטא-תאים. יתר על כן, השיטה מספקת הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית ברזולוציה גבוהה, אשר חושף את מהות מתנדנדות זרם סידן על גירוי גלוקוז. הגישה שלנו פתיחת הדלתות כדי להשתמש את דג זברה כמודל כדי לחקור את התרומה של גורמים גנטיים וסביבתיים אל תאי בטא ותפקוד לקוי.

באמצעות פרוטוקול המתואר לעיל, התגובות גלוקוז של תאי-ביתא איון של דג שלאחר ההפריה (dpf) 45 ימים נותחו. בשביל זה, איון העיקרי היה גזור מחיה לאללה, רכוב ב כייר פיברינוגן-תרומבין בצלחת זכוכית-התחתון. איון היה שקוע HBSS המכילה גלוקוז 5 מ מ. ריכוז גלוקוז היה גדל באופן הדרגתיים 10 מ מ, 20 מ מ. התגובות של תאי ביתא-הגדלת ריכוז הגלוקוז נרשמו. לבסוף, תאי בטא-היו depolarized באמצעות 30 מ מ אשלגן כלורי (איור 1). דפולריזציה אשלגן כלורי באמצעות גורם סידן ערך בטא-תאים בריאים.
פיג'י באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים, את עוצמת קרינה פלואורסצנטית GCaMP6s של בטא-תאים בודדים מופק ואת מנורמל (איור 2). כפי שניתן לראות מהעקבות בעוצמה פלורסצנטיות, ביתא-תאים בודדים להציג תנודות GCaMP6s זריחה על גירוי גלוקוז, אשר עוצר על גירוי אשלגן כלורי. הטכניקה מספק פתרון הסלולר הגלוקוז-ההיענות של הבטא-התא ואת חלון לתוך הפונקציונליות שלהם.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig1.jpg"> איור 1: Ex-vivo לחיות-הדמיה של זרם סידן באמצעות GCaMP6s בתאים-דג זברה בטא- איון הראשי של Tg(ins:nls-Renilla-mKO2); Tg(ins:GCaMP6s) דג זברה (45 dpf) היה רכוב של פיברינוגן-תרומבין עובש, מודגרות עם גלוקוז 5 מ מ (הבסיס). תאי בטא-תוויות עם גרעיני סמן אדום, ואילו GCaMP6s הוא נוכח לערוץ הצבע הירוק. איון הייתה מאולצת עם רמפה-גלוקוז המורכב הדגירה רציפים עם 10 מ מ, 20 מ מ D-גלוקוז, depolarized באמצעות התוספת של 30 מ מ. אשלגן כלורי. ראשי חץ לסמן פעילות אשר נותחו בטא-תאים בודדים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57851/57851fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig2.jpg"> איור 2: מנורמל GCaMP6s קרינה פלואורסצנטית בעוצמה מעקב אחרי בטא-לתאים בודדים. מנורמל GCaMP6s קרינה פלואורסצנטית בעוצמה-מעקב עבור הבטא-התאים המסומנים ראשי חץ באיור1. ציר ה-x מציין את הזמן בשניות. בחלק העליון, ברים מתארים את ריכוז הגלוקוז, אשלגן כלורי במדיום HBSS. ציר ה-y מציין את עוצמת קרינה פלואורסצנטית מנורמל במהלך סדרת הזמן. בשביל זה, עוצמת בסיסית (F0) מחושבת עוצמת רשע בתקופת דגירה של גלוקוז 5 מ מ. זה יופחת מתוך נתוני זמן-סדרה שלמה (F - F0). הבסיס בעוצמה מעל זה מנורמל מאת העוצמה המקסימלית המוצגים על-ידי התא (F - F0) / (Fמקסימום- F0). המעקב מנורמל מראה מענה מתנדנדות של תאי ביתא-גלוקוז, אשר מייצבת כאשר התאים הם depolarized עם 30 מ מ אשלגן כלורי. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57851/57851fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets at JoVE.com

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

תאי בטא פונקציונליות חשוב הומאוסטזיס הגלוקוז בדם, אשר מוערך ברזולוציה תא בודד באמצעות כתב גנטית מקודד עבור זרם סידן.

ניתוח של תפקוד תאי בטא באמצעות הדמיה הסידן בתא יחיד ברזולוציה איונים דג זברה

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

analysis-beta-cell-function-using-single-cell-resolution-calcium

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K Views.  TU Dresden. תאי בטא פונקציונליות חשוב הומאוסטזיס הגלוקוז בדם, אשר מוערך ברזולוציה תא בודד באמצעות כתב גנטית מקודד עבור זרם סידן.

Video: Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

שימוש בתגובה optokinetic ללמוד לתפקד החזותי של דג הזברה

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

מהירה ויעילה דג הזברה Genotyping באמצעות PCR עם רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

ניתוח של הרכב נפרון ותפקוד בכליות דג הזברה למבוגר

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

הערכה של תפקוד כליה דג הזברה באמצעות assay עמילות פלורסנט

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

פרוטוקול מעוקב מדמיין ביטוי החלבון ברזולוציה תא יחיד תכשירים לעור הר שלם

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

פרוטוקול אוטומאטי ומהיר עבור שריר סיבי ניתוח אוכלוסיית חתכי שריר עכברוש באמצעות שרשרת השרירן כבד אימונוהיסטוכימיה

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...