<ol>
	<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Wolman, M., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+genetics+in+larval+zebrafish:+learning+from+the+young.">Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young.</a> Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).</li><li>Lawson, N. D., Wolfe, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+genetic+approaches+for+the+analysis+of+vertebrate+development+in+the+zebrafish.">Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish.</a> Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).</li><li>Arkhipova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+regulation+of+the+hb9/mnx1+beta-cell+progenitor+specific+enhancer+in+zebrafish.">Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish.</a> Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Chitramuthu, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+embryonic+expression+of+zebrafish+PCSK5+co-orthologues:+functional+assessment+during+lateral+line+development.">Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development.</a> Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).</li><li>Liao, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCL/Tal-1+transcription+factor+acts+downstream+of+cloche+to+specify+hematopoietic+and+vascular+progenitors+in+zebrafish.">SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish.</a> Genes Dev. 12, 621-626 (1998).</li><li>Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W., Zon, L. I., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloche,+an+early+acting+zebrafish+gene,+is+required+by+both+the+endothelial+and+hematopoietic+lineages.">Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages.</a> Development. 121, 3141-3150 (1995).</li><li>Detrich, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraembryonic+hematopoietic+cell+migration+during+vertebrate+development.">Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).</li><li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+gene+cloche+acts+upstream+of+a+flk-1+homologue+to+regulate+endothelial+cell+differentiation.">The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation.</a> Development. , 124-381 (1997).</li><li>Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functionally+conserved+homolog+of+the+Drosophila+segment+polarity+gene+hh+is+expressed+in+tissues+with+polarizing+activity+in+zebrafish+embryos.">A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos.</a> Cell. 75, 1431-1444 (1993).</li><li>Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+expression+of+three+zebrafish+genes+related+to+distal-less:+part+of+a+homeobox+gene+code+for+the+head.">Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head.</a> J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).</li><li>Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=casanova+plays+an+early+and+essential+role+in+endoderm+formation+in+zebrafish.">casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish.</a> Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).</li><li>Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+PDX-1+structure,+function,+and+expression+in+zebrafish.">Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish.</a> Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).</li><li>Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+trout+insulin+promoter:+implications+for+fish+as+a+favorable+model+of+pancreas+development.">Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development.</a> FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).</li><li>Biemar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas+development+in+zebrafish:+early+dispersed+appearance+of+endocrine+hormone+expressing+cells+and+their+convergence+to+form+the+definitive+islet.">Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet.</a> Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).</li><li>Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+zebrafish+snail1+gene+and+its+expression+in+wild-type,+spadetail+and+no+tail+mutant+embryos.">Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos.</a> Development. 119, 1203-1215 (1993).</li><li>Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+progranulin+gene+family+and+antisense+transcripts.">The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts.</a> BMC Genomics. 6, 156 (2005).</li><li>Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+zebrafish+and+knockdown+technology+to+define+proprotein+convertase+activity.">Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity.</a> Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo.">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

פיתחנו שיטות משופרות כדי להמחיש RNA עם רזולוציה גבוהה. בנהלי הכלאה באתר מתבצעים באמצעות סלי מחוייט פשוטים עם תחתית נקבובית (איור 1). עוברים מעובדים פתרונות RNase ללא שימוש בצלחות 6 גם בטמפרטורת חדר בתנאים סטריליים. סלי עוברים להפריד עשויים מצינורות Eppendorf בצבעים שונים. סלסלות עם או בלי שפה משמשות להתמצאות קלה ולזהות את העוברים בתוך הסל כמקביל לבדיקה מסוימת. Prehybridization על 65 מעלות צלזיוס וכלאה על 70 מעלות צלזיוס עם 50% לפוראמיד deionized נמצא להיות חשוב במיוחד כדי לקבל אותות ברזולוציה גבוהות. בנוסף דוגרים עוברים פעמיים עם חיץ טריס אלקליין במשך 15 דקות שוטף PBST הודעה לאחר דגירה עם נוגדן אנטי לחפור ולפני הדגירה ובנוכחותו של BCIPNBT מקל את המראה של אותות ברורים באיכות גבוהה. בידיים שלנו שחווינו שpermeabilization ותיקון של עוברים לזמן אופטימלי וכלאה על 70 מעלות צלזיוס היו מאוד קריטיים בקבלת אותות ברורים. permeabilization לקוי מופק אותות רקע גבוהים. permeabilization המורחב או תיקון לקוי גרם להשפלה של עוברים ואילו תיקון מורחב עכבות זיהוי אות. ההכלאה בין 55-60 מעלות צלזיוס גם הפיק את אותות רקע גבוהים (איור 7). הבדיקה התחושה תזהה אות לAS תמליל אם הגן של עניין מקודד antisense (AS) תעתיקים. לאחר התגובה מכתים היא עצר הצבת עוברים במתנול למשך 30 דקות או יותר, ממירה את האות לצבע סגול אמיתי, ומסירה את הכתמים שאינם ספציפיים. ניתן לאחסן את עוברים קבועים בחושך בלהפסיק פתרון על 4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים. את היתרונות וdisadvantages מאחל רצון הוא טכניקה יעילה כדי לאפיין גם את הביטוי של הזמן ומרחב של גני המטרה במהלך embryogenesis ושלבי זחל. פרוטוקול זה גם מאפשר הדמיה של ביטוי RNA של שני גנים או שיתוף לוקליזציה של RNA וביטוי חלבון באותו הזמן באמצעות שינויים מתאימים בהתאם למטרות הניסוי. פרוטוקול ברזולוציה גבוה זה יכול לשמש כדי לזהות ביטוי RNA ברקמות רבות וסוגי תאים. זה יכול לשמש לצורך זיהוי של מיני RNA שפע נמוכים מאוד עם אותות רקע מינימאליים. עם זאת, כדי להמחיש ביטוי מדויק של הגנים בתוך תאים פנימיים של רקמות דורש הכלאה באתר באמצעות קטעי רקמה.

דג הזברה (Danio rerio) התפתחה כמודל חיה רב עוצמה לפיתוח המחקר של החולייתנים, מחלות, התנהגות, ובשימוש בסמים ההקרנה 1-3. ניתן להשיג עוברי דג הזברה במספרים גדולים ממעבר אחד. הפריה והתפתחות מתרחשת ברחם לשעבר ואת העוברים הברורים אופטי לפתח במהירות. אירועי התפתחות קריטיים מתרחשים במהלך 48 שעות הראשונה לאחר ההפריה (hpf). זה כולל את המראה של האיבר primordia וייזום של cytodifferentiation. ניתן להשיג מציאה או על ביטוי של חלבונים באמצעות microinjection של עוברים עם antisense morpholino (MO) oligonucleotides או mRNA בהתאמה בשלב תא אחד או שניים (0.75 hpf). משאלתו של עוברי דג הזברה מאפשרת המחקר של ביטוי מרחב ובזמן של גנים ספציפיים של עניין. יישום של טכניקת המאחלים בעקבות microinjection של עוברים עם mRNA או MO ליותר מ-exprESS או רמות חלבון ספציפיות מציאה מגלה רגולציה ההפרש של גנים אחרים. שינויים בדפוסי ביטוי גנים יכולים להיות מתואמים עם שינויים פנוטיפי ולחשוף את הפונקציה של גני המטרה במהלך organogenesis מוקדם. מאז ניתן להכין בדיקות ומאוחסנות מראש, ניתן ליישם את טכניקת ש כדי לחשוף דפוסי ביטוי גנים לפחות 20 גנים בכל פעם, באמצעות צלחות שש היטב וסלים בהתאמה אישיות.

<table><tbody><tr><td>Taq Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>10342053</td><td></td></tr><tr><td>TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO</td><td>Invitrogen</td><td>K4650-01</td><td></td></tr><tr><td>HQ Mini Plasmid Purification Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-01</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Roche</td><td>11 685 660 001</td><td></td></tr><tr><td>Not1 and HindIII Restriction Enzymes</td><td>Invitrogen</td><td>15441-025, 15207-012</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Saturated Phenol, ultrapure</td><td>Invitrogen</td><td>15513039</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>C607-1</td><td>Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood.</td></tr><tr><td>RNase-free DNAse I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>Prepare small aliquots and store at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Roche</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5)</td><td>Fisher</td><td>50-751-7355</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Commercial alcohols</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)</td><td>Sigma</td><td>40718-25ML</td><td>DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M (pH 8.0)</td><td>Fisher</td><td>50-751-7404</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Salt</td><td>Aquarium Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher</td><td>FL-03-0900</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>Prepare and store at -20&amp;deg;C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask.</td></tr><tr><td>Phenylthiocarbomide (PTC)</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A947-4</td><td></td></tr><tr><td>Dumont (Watchmaker&amp;rsquo;s) Forceps pattern no. 5</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Six-well Cell Culture Cluster</td><td>Sarstedt</td><td>83.1839</td><td></td></tr><tr><td>Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes</td><td>In-house preparation</td><td></td><td>To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of&amp;nbsp;the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical&amp;nbsp;hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used.</td></tr><tr><td>Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20)</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Anhydride</td><td>Sigma</td><td>242845</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine</td><td>Sigma</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Formamide, high purity grade</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>AG501-X8 Resin</td><td>Bio Rad</td><td>142-6424</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid monohydrate</td><td>Sigma</td><td>C0706-500G</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium Salt</td><td>Sigma</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Saline-sodium Citrate Buffer (SSC)</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>tRNA from bakers yeast type X</td><td>Sigma</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S640-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>S25403</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole Hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide&lt;br/&gt; anhydrous (DMF)</td><td>Sigma</td><td>227056</td><td>Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles.</td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP)</td><td>Sigma</td><td>N6639</td><td>Protect this solution from light.</td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazolium (NBT)</td><td>Sigma</td><td>840W</td><td>Protect this solution from light.</td></tr><tr><td>Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments</td><td>Roche</td><td>1093274910</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>96-well cell culture plates</td><td>Sarstedt</td><td>83.1835</td><td></td></tr><tr><td>Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2</td><td>ZIRC</td><td>Tg(mnx1:GFP)ml2</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean</td><td>Aquarium Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

high resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function

מאמר זה מתמקד בכל הר הכלאה באתרו (לוואי) של עוברי דג הזברה. הטכנולוגיה מאפשרת מאחלי ההערכה של ביטוי גנים הן במונחים של חלוקת רקמה ושלב התפתחותי. פרוטוקולים מתוארים לשימוש ברצון של עוברי דג הזברה באמצעות בדיקות RNA antisense שכותרתו עם digoxigenin. בדיקות נוצרות על ידי שילוב של נוקלאוטידים digoxigenin צמודים באמצעות שעתוק במבחנה של תבניות גנטיות שכבר משובטות ולינארית. את chorions של עוברים שנקטפו בשלבי התפתחות הוגדרו יוסרו לפני דגירה עם בדיקות ספציפיות. בעקבות הליך כביסה כדי להסיר את החללית עודפת, עוברים מודגרת עם נוגדן אנטי digoxigenin מצומדות עם phosphatase אלקליין. על ידי שימוש במצע chromogenic לphosphatase אלקליין, ניתן להעריך ביטוי ספציפי גן. בהתאם לרמה של ביטוי גני ההליך כולו יכול להסתיים תוך 2-3 ימים.

באמצעות הפרוטוקול עם 50 עוברים לסל (לגן / לתנאי ניסוי) דפוס הביטוי של גן שניתן להשיג בניסוי אחד. כמעט כל העוברים מראים דפוסי ביטוי דומים לגן מסוים. דוגמאות מייצגות של במכתים הכלאה באתר מוצגות איורים 3-6. riboprobes השכל ונגד התחושה היו מסונתז מcDNAs המתאים לPC5.1, PC5.2 6, 7, 8,9 SCL/tal-1 Gata-1, FLK / kdrl 10, 11 שש, dlx2 12, fkd7 / Foxa1 13, 14,15 אינסולין, וטריפסין 16 נבנו על ידי הגברת קטע של ה-mRNA באורך מלא באמצעות DNA פולימראז תקי, ומשובטים לתוך pCRII-TOPO (Invitrogen). האותנטיות של amplicons הבודדים אושרה על ידי רצף. לאחר האימות של הנטייה השיבוט, riboprobes antisense המקביל היו מסונתזתוך שימוש בפרוטוקולים 17 עם שינויי 18,19 כפי שמתואר כאן או באמצעות SP6 או polymerases RNA T7. צעדים מעורבים בכל הר הכלאה באתר מומחשים בקצרה באיור 2. כתמים סגול נצפו לאחר הכלאה עם riboprobe עניין מייצגים גם את השפע ואת האתרים של ביטוי של גן מסוים. למשל PC5.1 מראה ביטוי מאוד דיסקרטי בחלק הקדמי והאחורי של שלפוחית ​​otic וprimordium קו הרוחב ב24hpf והוא מאוד מקומי בתוך neuromasts קו הצד הקדמי והאחורי של 72 hpf (איור 3). בניגוד PC5.2 מופעים ביטוי בכל מקום בתוך מערכת העצבים המרכזית עם הממד האזורי ברור בתוך somites, שלפוחית ​​otic וצינור pronephric וזוכה לביטוי בכבד ובמעי בגיל 96 hpf (איור 4). העדרו של ביטוי גנים בעת שימוש riboprobes תחושת בהתאמה משמש כביקורת שלילית. ( <strאונג&gt; איורים 3 ב ו -4). ניתוח ביטוי של סמני דם הראה מכתים של SCL/tal-1 בתוך תאי הגולגולת בין שתי המדינות ובמסת תאי ביניים (ICM). למרות שהצביעה עבור Gata-1 גם הוא ראה בתוך ICM דפוס הביטוי הוא שונה. הביטוי של FLK / kdrl נצפה במוח האחורי, כלי עיקריים ובינמיגזרי ובICM (איור 5). מכתים שלשישה נצפה בnotochord (איור 5). הביטוי של dlx2 ב34 hpf הוא מקומי ב telencephalon, diencephalon, ההיפותלמוס וקשתות ectomesenchymal גולגולת וביטוי fkd7/foxa1 ב24 hpf הוא ראה בעיקר בצלחת הרצפה וhypochord. דפוסי ביטוי של סמני הלבלב הראו מכתים אינסולין בלבלב האנדוקרינית וטריפסין בלבלב אקסוקרינית (איור 6). תוצאות אלו מראות דפוס ביטוי עם רזולוציה גבוהה מייצגת את ההצלחה של הפרוטוקול המפורטיםלצורך זיהוי של הביטוי של שני גנים שכיחים גבוהים ונמוכים. עבור תמונות בהירות נוספות שניתן לנקוט באמצעות מיקרוסקופ confocal לאחר ההרכבה את העוברים בשקופית 20 מיקרוסקופית. חלק מהדוגמות לתוצאות שהתקבלו כאשר הניסוי נערך בתנאים תת אופטימליים במהלך אופטימיזציה של הפרוטוקול מוצג באיור 7. אות רקע גבוהה עם ביטוי ירוד ששש הייתה שם לב תחת permeabilization בינוני הכלאה בין 55-60 ° C. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50644/50644fig1large.jpg" src="/files/ftp_upload/50644/50644fig1.jpg" width="500px" /> איור 1. הכנה ושימוש בEppendorf-ניילון סלי רשת למחזיקים מבוימים עוברים. אחד גם יכול להחזיק שישה סלי רשת Eppendorf-ניילון. התמונה מראה את הצלחות סטריליות 6 גם מכילות שישה סלי רשת Eppendorf-ניילוןמשמש לדילולים רצופים של מתנול בPBS. <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50644/50644fig2large.jpg" src="/files/ftp_upload/50644/50644fig2.jpg" width="500px" /> איור 2. תרשים מראה מעורבים בכל ההר בטכניקת הכלאה באתרו את הצעדים. לאחר תיקון מבוים יכולים להיות מאוחסנים בעוברי מתנול ב -20 ° C עד שימוש. יכולות להיות מסונתזת בדיקות מראש ונשמרו ב -80 ° C. בדיקות אחסון בaliquots הקטנים מומלצת אם הם לשימוש לאורך תקופות ארוכות. באופן כללי כל הר בניסויי הכלאה באתרו ניתן להשלים ב 3 או 4 ימים. התגובה מכתימה לגנים חלשים לידי ביטוי תיקח עד 16 שעות בטמפרטורת חדר או יותר כאשר תגובת מכתים נעשית על 4 מעלות צלזיוס <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50644/50644fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בF הגדול יותר</a><html> igure. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50644/50644fig3large.jpg" src="/files/ftp_upload/50644/50644fig3.jpg" width="500px" /> איור 3. הביטוי של PC5.1 ידי כל ההר בניתוחי הכלאה באתר בוצע באמצעות 24 hpf ו72 hpf עוברים מבוימים. () תצוגה לרוחב של 24 עוברי hpf להראות ביטוי מאוד דיסקרטי של PC5.1 בתוך קדמי ו חלק אחורי של שלפוחית ​​otic וprimordium קו רוחב באמצעות riboprobe antisense PC5.1. ב 72 מכתים ספציפי hpf נצפה בתוך neuromasts קו הצד הקדמי ואת אחורי. (ב) היעדרות של ביטוי גנים באמצעות תחושת riboprobe PC5.1 משמשת כביקורת שלילית. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50644/50644fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <html> gether.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50644/50644fig4large.jpg" src="/files/ftp_upload/50644/50644fig4.jpg" width="500px" /> איור 4. בגיל 24 ו 96 hpf כל ההר hpf בניתוחי הכלאה באתרו של PC5.2 בוצע באמצעות PC5.2 riboprobes תחושה אנטי ותחושה. (א) תצוגה לרוחב של 24 עוברי hpf להראות ביטוי בכל מקום בתוך מערכת העצבים המרכזית, somites שלפוחית ​​otic וצינור pronephric. מכתים ספציפי בכבד ובמעיים נראה בגיל 96 hpf באמצעות riboprobe antisense PC5.2. (ב) היעדרות של ביטוי גנים באמצעות תחושת riboprobe PC5.2 משמשת כביקורת שלילית. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50644/50644fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> oad/50644/50644fig5.jpg &quot;width =&quot; 500px &quot;/&gt; . איור 5 Whole-Mount בניתוחי הכלאה באתרו ב 24 hpf באמצעות SCL/tal-1 riboprobe הראה מכתים בתוך תאי הגולגולת בין שתי המדינות ובמסת תאי ביניים (ICM); Gata-1 מכתים riboprobe נתפס בICM; FLK ביטוי / kdrl במוח האחורי, העיקרי, וכלי מיגזריות ובICM. מכתים שלשישה נצפה בnotochord. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50644/50644fig6large.jpg" src="/files/ftp_upload/50644/50644fig6.jpg" width="500px" /> . איור 6 Whole-Mount בניתוחי הכלאה באתר ב34 hpf באמצעות dlx2 riboprobe חשף ביטוי של dlx2 בtelencephalon, diencephalon, ההיפותלמוס, וקשתות ectomesenchymal גולגולת; ביטוי fkd7/foxa1 ב24 hpf הוא ראה בעיקר בעמ &#39;הרצפהמאוחר וhypochord; מכתים אינסולין הוא ציין בלבלב האנדוקרינית וביטוי טריפסין בלבלב אקסוקרינית. <img alt="איור 7" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50644/50644fig7large.jpg" src="/files/ftp_upload/50644/50644fig7.jpg" width="500px" /> permeabilization הולם איור 7. וטמפרטורת הכלאה המתאימה הם קריטיים לאותות ברורים בכלאה באתרו. Whole-Mount בניתוחי הכלאה באתרו ב 24 hpf ו48 hpf באמצעות riboprobe ששש גילה ביטוי בתוך notochord וfloorplate ללא אות רקע, כאשר עובר הם permeabilized ידי עיכול proteinase K עבור 12-15 דקות והכלאה על 70 ° C. דפוסי ביטוי שלמים ואותות רקע גבוהים נצפו כשאת העוברים היו נתונים לעיכול בינוני (טיפול 5 דקות proteinase K) או הכלאה בטמפרטורה נמוכה (60 מעלות צלזיוס). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50644/50644fig7large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function at JoVE.com

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

דג הזברה, דגים טרופיים קטנים, הפכה לדגם פופולרי ללימוד תפקוד גן במהלך התפתחות מחלה וחוליות. הביטוי של הזמן ומרחב של גני המטרה יכול להיקבע על ידי<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה. הפרוטוקול המשופר שלנו מאפשר זיהוי של תמלילי שפע נמוכים עם אות רקע הלא ספציפית נמוכה.

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

high-resolution-whole-mount-situ-hybridization-within-zebrafish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

22.1K Views.  Royal Victoria Hospital. דג הזברה, דגים טרופיים קטנים, הפכה לדגם פופולרי ללימוד תפקוד גן במהלך התפתחות מחלה וחוליות. הביטוי של הזמן ומרחב של גני המטרה יכול להיקבע על ידי באתר הכלאה. הפרוטוקול המשופר שלנו מאפשר זיהוי של תמלילי שפע נמוכים עם אות רקע הלא ספציפית נמוכה.

Video: High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development of all vertebrates. The kinetics and location of signals - even within single cells - in the developing embryo complements the identification of important developmental genes. Immunostaining techniques are described that have been shown to define the kinetics of intracellular and whole animal signals in structures as small as primary cilia. The techniques for fixing, imaging and processing images using a laser-scanning confocal compound microscope can be completed in as few as 36 hr.
Zebrafish (Danio rerio) is a desirable organism for investigators who seek to conduct studies in a vertebrate species that is affordable and relevant to human disease. Genetic knockouts or knockdowns must be confirmed by the loss of the actual protein product. Such confirmation of protein loss can be achieved using the techniques described here. Clues into signaling pathways can also be deciphered by using antibodies that are reactive with proteins that have been post-translationally modified by phosphorylation. Preserving and optimizing the phosphorylated state of an epitope is therefore critical to this determination and is accomplished by this protocol.
This study describes techniques to fix embryos during the first 72 hr of development and co-localize a variety of relevant epitopes with cilia in the Kupffer&#39;s Vesicle (KV), the kidney and the inner ear. These techniques are straightforward, do not require dissection and can be completed in a relatively short period of time. Projecting confocal image stacks into a single image is a useful means of presenting these data.

Techniques are described to immunostain phospho-epitopes in whole zebrafish embryos and then conduct two-color fluorescent confocal localization in cellular structures as small as primary cilia. The techniques for fixing and imaging can define the location and kinetics of the appearance or activation of specific proteins.

Phospho-אפיטופים Immunostaining באיברים ריסי של עוברי דג הזברה שלמים הר

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development ...

Chemistry

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Developmental Biology

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

כתמים וכימות של היברידיזציה באתרו בתוך דג זברה

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at 2 days post fertilization. Consisting of only two nephrons, the pronephros serves as the sole kidney during larval life until more renal function is required due to the increasing body mass. To cope with this higher demand, the mesonephros (adult kidney) begins to form during metamorphosis. The new primary nephrons fuse to the pronephros and form connected lumens. Then, secondary nephrons fuse to primary ones (and so on) to create a branching network in the mesonephros. The vast majority of research is focused on the pronephros due to the ease of using embryos. Thus, there is a need to develop techniques to study older and larger larvae and juvenile fish to better understand mesonephros development. Here, an in situ hybridization protocol for gene expression analysis is optimized for probe penetration, washing of probes and antibodies, and bleaching of pigments to better visualize the mesonephros. The Tg(lhx1a-EGFP) transgenic line is used to label progenitor cells and the distal tubules of nascent nephrons. This protocol fills a gap in mesonephros research. It is a crucial model for understanding how new kidney tissues form and integrate with existing nephrons and provide insights into regenerative therapies.

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish is an important model for understanding kidney development. Here, an in situ hybridization protocol is optimized to detect gene expression in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development.

בסיטו הכלאה בזחלי זברה וצעירים במהלך פיתוח מסונפרוס

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

שימוש הר שלם באתרו הכלאה קישור לביולוגיה מולקולרית האורגניזם

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a model for human diseases. Gene function study is based on the detection of gene expression patterns. Although immunohistochemistry offers a powerful way to assay protein expression, the limited number of commercially available antibodies in zebrafish restricts the application of costaining. In situ hybridization is widely used in zebrafish embryos to detect mRNA expression. This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish embryo sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. Immunohistochemistry and the imaging of a single cryosection were performed after in situ hybridization. The protocol is helpful to unravel the expression pattern of two genes, first by in situ transcript detection and then by immunohistochemistry against a protein in the same section.

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry of zebrafish embryonic sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. It is useful to detect the expression patterns of two genes in zebrafish if there is a paucity of antibodies.

ב Situ הכלאה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בעוברי דגי זברה Cryosectioned

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

הר שלם ברזולוציה גבוהה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video