אנו מודים לחברים של מעבדות Blaschke, גרינוולד, וWittwer לקבלת ייעוץ וסיוע טכני. עבודה זו נתמכת על ידי קרן PCMC, NIH R01 MH092256 וDP2 MH100008, והמצעד הפרוטות קרן # מענק מחקר 1-FY13-425, לJLB.

1. ה-DNA הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר תמוגה-DNA: 50 מ&quot;מ KCl, 10 מ&quot;מ טריס-HCl pH 8.3, 0.3% Tween 20, NP40 0.3%. להוסיף טרי proteinase K לריכוז סופי של 1 מ&quot;ג / מיליליטר ביום של שימוש 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף רקמות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקליפ סנפיר דגים הבוגר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי דגים: מניחים את הדג ב0.004% MS-222 פתרון (tricaine). חכה עד שתנועת זימים מאטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הדג על ערימה של 5-10 Kimwipes ולחתוך חתיכה קטנה של סנפיר הזנב, על 2-3 מ&quot;מ, בסכין גילוח סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות למקום הדגים במכל שכותרתו עם מים טריים להתאוששות; לתייג גם את המכל וצינור מקביל שיכיל את הקליפ הסנפיר בזהירות. להחליף את המים ולהאכיל את הדגים כל יום אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרים את הקליפ הסנפיר עם קצה פיפטה סטרילית ולהעביר אותו לתוך צינור מלא ב100 מאגר תמוגה DNA μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את קצה פיפטה, וזורקים את סכין הגילוח לתוך מיכל חד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקליפ זנב עובר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עוברים ל0.004% MS-222 פתרון (tricaine). לחכות 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי חתיכה של זנב עם מלקחיים תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הזנב לתוך צינור שכותרתו מלא ב30 מאגר תמוגה DNA μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות הכניס את העובר לתוך צינור המכיל 100 paraformaldehyde μl 4%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות לייבל עם עוברים וצינורות הזנב המקביל שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הצינורות עם עוברים על 4 מעלות צלזיוס למשך לילה קיבעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את המלקחיים באמצעות מים מילי-Q וKimwipes בין כל עובר כדי למזער את הזיהום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל עוברים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עוברים ל0.004% MS-222 פתרון (tricaine). לחכות 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 1-5 עובר בצינור מלא ב100 מאגר תמוגה DNA μl. Dechorionation אינו הכרחי. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיכול ה-DNA דגירה צינורות עם (קליפים סנפיר או זנב או עוברים) רקמה על 55 מעלות צלזיוסעבור 4 שעות עד 12 הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית proteinase K צינורות חום ל-C ° 95 15 12 דקות. ה-DNA צריך לשמש עבור PCR באופן מיידי, או מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים. </li></ol> 2. PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Primers עיצוב באופן ידני או על ידי תוכנת עיצוב פריימר (למשל Lightscanner פריימר עיצוב תוכנת Biofire). מוצרי ה-PCR לHRMA הם בדרך כלל 50-200 נ&quot;ב; מוצרי ה-PCR לגילוי SNP צריכים להיות, בדרך כלל 50-80 נ&quot;ב קטן יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבצע תגובת PCR בצלחת 96 היטב או 384 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 10 μl נפח כולל: 4 תמהיל μl LightScanner מאסטר (0.1 U חם להתחיל תקי-AB פולימראז, חיץ, 0.2 dNTPs מ&quot;מ, כלוריד 2 מ&quot;מ מגנזיום, ו1x צבע מחייב גדילי הדנ&quot;א כפול ניאון); 5 pmol כל צבע יסוד, ותבנית הדנ&quot;א הגנומי μl 1 חולץ מסנפיר זנב מבוגר או 3 הדנ&quot;א הגנומי μl מזנב עוברי 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות כיסוי עם 30 שמן מינרלי μl. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את הצלחת עם חותם דבק אופטי שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל את תנאי תנאים טיפוסיים רכיבה על אופניים PCR הם 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו30 מחזורים של 10 שניות ב 95 מעלות צלזיוס, 25 שניות ב 60 ° C, 30 שניות ב72 מעלות צלזיוס, שהסתיימו עם 95 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות ומקוררות 15 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות PCR חנות ב 4 מעלות צלזיוס או להמשיך ישירות לHRMA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר המוצר ה-PCR שלנו על ידי ניתוח של הגודל שלה באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose במהלך אופטימיזציה ראשונית של ה-PCR, ואם הצביע, על ידי רצף של המוצר ה-PCR. </li></ol></li></ol> 3. HRMA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות חום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת במערכת ניתוח להמיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנה (LightScanner תוכנה התקשר-IT 2.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות חום 60-95 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור קובץ אחסון נתונים חדש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח נתונים HRMA (איור 2). שלבים מרובים של ניתוח הם אפשריים. אנחנו מראים את הסט הנפוץ ביותר של m נתוניםanipulations. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת משנה לחץ על כרטיסיית משנה. בחר את הבארות עם דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נורמליזציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה לנרמל בפנל השמאלי. לחסל את שונות הקרינה, מיקום באופן ידני כפול הקו המקביל בטרום (ראשוני) ואזורים שלאחר להמיס (סופי) כפי שמודגם (איור 2C, ראשי חץ) ולנרמל את אותות premelt וקרינה שלאחר להמיס של כל הדגימות ל1 ו 0 , בהתאמה 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המיקום של הקווים כך שהאזור להמיס הוא בתחום שבין לפני ואחרי להמיס הקווים, אך לא נבחר. באופן כללי, מינימלי הנמוך יותר ויותר מקסימום (והמינימום עליון ועליון מקס) צריכים להיות ממוקמים קווי טמפרטורה כ 1 ° C לגזרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עמדות טמפרטורה לנורמליזציה כאלה שיש להם את כל הדגימות (100%) הקרינה המרבית או מלאה לאזור premelt והמינימום או לא (0%) הקרינה לאזור שלאחר להמיס (כמיטב possible). נורמליזציה צריכה לגרום לקו כמעט אופקי בקרינה המרבית של 1 המשתרעת עד לנקודה שנמסה ולאחר מכן קו כמעט אופקי מהנקודה להמיס בקרינה המינימלית של 0; לא צריכה להיות רמות הקרינה מעל 1 או מתחת 0 . לדוגמא, באיור 2C, לנרמל את קימורי premelting באמצעות טווחי טמפרטורה של 79-80 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבוץ / קיבוץ באשכולות להבחין גנוטיפים המבוססים על טמפרטורת ההתכה שלהם (איור 2 ג, קופסא ירוקה). בחר קיבוץ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר Autogroup מרשימת בחירת התקנים תחת סעיף הקיבוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר רגיל או גבוה להתכת פרופילים עם מעברים בודדים או מעברים מרובים בהתאמה מרשימת בחירת הרגישות תחת סעיף הקיבוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Compute בחרקבוצות תחת סעיף הקיבוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לתפריט הקובץ ולחץ על השמירה כדי לשמור את התוצאות. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Sander, J. D., Cade, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs.">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).</li><li>Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+gene+targeting+in+zebrafish+using+customized+TALENs.">Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).</li><li>Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+melting+analysis+(HRMA):+more+than+just+sequence+variant+screening.">High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening.</a> Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).</li><li>Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+methods+for+generating+and+detecting+locus-specific+mutations+induced+with+TALENs+in+the+zebrafish+genome.">Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), (2012).</li><li>Liew, M., Pryor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+of+single-nucleotide+polymorphisms+by+high-resolution+melting+of+small+amplicons.">Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons.</a> Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).</li><li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V+Amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping:+cross-platform+comparison+of+instruments+and+dyes.">V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes.</a> Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).</li><li>Carrillo, J., Mart&#237;nez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+melting+analysis+for+the+identification+of+novel+mutations+in+DKC1+and+TERT+genes+in+patients+with+dyskeratosis+congenita.">High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita.</a> Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).</li><li>Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+melt+analysis+(HRMA);+a+viable+alternative+to+agarose+gel+electrophoresis+for+mouse+genotyping.">High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping.</a> PloS one. 7 (9), (2012).</li><li>Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIK3CA+hotspot+mutation+scanning+by+a+novel+and+highly+sensitive+high-resolution+small+amplicon+melting+analysis+method.">PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method.</a> J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).</li><li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants.">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li><li>Xing, L., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+foxP2+zinc+finger+nuclease+mutant+has+normal+axon+pathfinding.">Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding.</a> PloS one. 7 (8), (2012).</li><li>Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+High+Resolution+Melting+analysis+as+an+alternate+tool+to+screen+for+risk+alleles+associated+with+small+kidneys+in+Indian+newborns.">Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns.</a> BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).</li><li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V+Expanded+instrument+comparison+of+amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping.">V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping.</a> Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).</li><li>Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Genotyping+by+Amplicon+Melting+Analysis+Using+LCGreen.">High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen.</a> Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).</li><li>Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+closed-tube+methylation-sensitive+high+resolution+melting+assay+(MS-HRMA)+for+the+semi-quantitative+determination+of+CST6+promoter+methylation+in+clinical+samples.">A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples.</a> BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).</li><li>Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+two+broad-range+PCR+assays+for+pathogen+detection+in+positive-blood-culture+bottles:+PCR-high-resolution+melting+analysis+versus+PCR-mass+spectrometry.">Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry.</a> J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

PCR בשילוב עם HRMA הוא טכנולוגיה רבת עוצמה לגנוטיפ דג הזברה. היתרונות של גישה זו הם המהירות שלו, חוסן, ורגישות לזיהוי מוטציות אפילו נקודה. כל הפרוטוקול, מניתוח כדי להמס עקומת סנפיר קליפ, יכול להתבצע תוך פחות משמונה שעות על ידי אדם אחד. בנוסף, הטכניקה היא נוחה להקרנת תפוקה גבוהה; אינו מחייבת את השימוש במתיל בethidium; ואטום לכל PCR וצעדי ניתוח אשר מסייע למזער את בעיות זיהום. צעד קריטי לטכניקה זו הוא amplicon PCR ועיצוב פריימר. אורך אופייני עבור מוצרי ה-PCR בHRMA הוא 50-200 נ&quot;ב. amplicons קצרה להגביר את הרגישות והם אידיאליים לאיתור שינויי נוקלאוטיד יחיד. אם להמס-עקומות של מיני מוצר ה-PCR קשור קשר הדוק לא ניתן להבחין בקלות, oligonucleotide קטן משלים SNP וחסם בסוף &quot;3 יכול להיכלל בתגובת PCR (Lunaprobes; בדיקהים). הבדיקות מופקות על ידי PCR אסימטרי באמצעות ריכוז של קדימה שונה והפוכה פריימרים, עם חוסם C3 3 &#39;כדי למנוע הארכת בדיקה בHRMA PCR שלאחר מכן. הבדיקה לאחר מכן נכללה בתגובת HRMA ה-PCR. HRMA אז מתרחש עם החללית, שבו החללית סימטרית נקשר למוצר ה-PCR ומייצרת דופלקסים חללית-יעד עם להמיס עקומות שונות שניתן להשתמש בם כדי להבחין בין אללים. מספר חברות מציעות מערכות ניתוח להמיס עקומה. אלה כוללים את Biofire Lightscanner, רוש LightcyclerVR 480 וQiagen Rotor-Gene ש כמה צבעי ניאון, ה-DNA מחייבת זמינים, כוללים LC הירוק PLUS וSYT09 EvaGreen. יש איזו וריאציה ברגישות בזיהוי מוטציה המבוססת על צבעי ניאון שונים ומכונות להמס עקומה 8,15. Nonsaturating צבעים, למשל, SYBR הירוק אני, אינו מתאים למרבית יישומי HRMA: בריכוזים גבוהים, SYBR הירוק אני inhibits הפעילות של פולימראז ה-DNA, ובריכוזים נמוכים יותר, SYBR ירוק אני לא יכול בדיוק למדוד התנהגות היתוך בשל חלוקה מחדש שלה מאזורים נמסו בחזרה לאזורים של dsDNA 16. באופן כללי פלטפורמות Real Time PCR הקיימות ביותר מסוגלות preforming HRMA באמצעות תוכנת חבילת ההרחבה ולצבוע DNA ניאון דור שני מחייבת. אמנם פרטים טכניים של התוכנה והרצף של צעדים ניסיוניים להשתנות מעט בין פלטפורמות, המושגים המדעיים הכוללים זהים במהותם. המעבדה ואחרים שלנו הוכיחו שHRMA ניתן להשתמש בשני דג הזברה העוברית ובוגרים כדי לזהות transgenes, ומוטציות הנגרמות על ידי ZFNs וTALENs 6,12,13. HRMA נעשה שימוש כדי לגלות פולימורפיזם ב6,12 דג הזברה. המעבדה שלנו משתמשת HRMA גם לסינון ראשוני של מוטציות הנגרמות Talen כמו גם למיון של קווים הוקמו (TSQ וJLB, לא פורסם). applicat הפוטנציאלי אחריונים שיכולים להיות מיושמים על דג הזברה כוללים HRMA מתילציה רגישה (ms-HRMA) 17, כימות של עותק מספר גרסאות 5; וזיהוי הפתוגן בvivariums 18.

דג הזברה (Danio rerio) היא מערכת מודל חוליות בשימוש נרחבת למחקרים של פיתוח ומודלים מחלה. לאחרונה, טכנולוגיות מהונדסים ומוטציה רבות פותחו עבור דג הזברה. טכניקות transgenesis מהירה, בדרך כלל מבוססות על מערכת transposon Tol2 1, כבר בשילוב עם אפשרויות שיבוט משופרות להרכבת קטע DNA מספר 2. nucleases אבץ האצבע (ZFNs) וnucleases השעתוק כמו activator-מפעיל (TALENs) שימשו למקד לוקוסים בשני תאים סומטיים וgermline ב3,4 דג הזברה. טכניקות אלו יעילות יכולות ליצור בעלי חיים מהונדסים גנטי, עם יצירת מוטציה בתדירות גבוהה וניבט קו תמסורת 3,4. למרות ההתפתחויות הללו, טכניקות גנוטיפ מסורתיות בדג הזברה להגביל את העצמה המלאה של הכלים mutagenesis וtransgenesis. PCR ואחריו ג&#39;ל אלקטרופורזה, לעתים בשילוב עם restrictioעיכול אנזים n, נעשה שימוש נרחב כדי לזהות שינוי הגנום, אבל הוא גוזל זמן ופחות רגיש לזהות הוספות קטנות או מחיקות. יש מבחני הבדיקה TaqMan עלויות ראשוניות גבוהות ודורשים אופטימיזציה זהירה. רצף של מוצרי ה-PCR יכול לקחת כמה ימים ולא מעשי להקרנה בקנה מידה גדולה. ניתוח פולימורפיזם בר הגבלת אורך (RFLP) יכול רק להפלות SNPs המשפיע על מגוון מצומצם של אתרי הכרת אנזים הגבלה. ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה (HRMA), שיטת ניתוח סגור צינור שלאחר PCR, היא שיטה שפותחה לאחרונה, כי הוא מהיר, רגיש, זול, ונוח להקרנת מספר גדול של דגימות. HRMA יכול לשמש כדי לזהות SNPs, מוטציות, וtransgenes 5-7. HRMA מבוסס על denaturation תרמית של DNAs פעמיים תקועים, ויש לו כל amplicon PCR דיסוציאציה ייחודית (להמס) אופיינית 5. יכולה להיות מופלים לדגימות לא בשלo ההרכב שלהם שונה נוקלאוטיד, תוכן GC, או האורך, בדרך כלל בשילוב עם צבע פלואורסצנטי שרק נקשר גדילי הדנ&quot;א כפול 8. לפיכך, HRMA יכול להבחין גנוטיפים שונים בהתבסס על המאפיינים להמיס עקומה השונות. בגלל HRMA משתמש ריאגנטים עלות נמוכה והוא תהליך שלאחר PCR בשלב יחיד, ניתן להשתמש בו לאסטרטגיות תפוקה גבוהה. HRMA הוא הורסות, כך שלאחר ניתוח amplicons PCR יכולה לשמש ליישומים אחרים. HRMA הוחל באורגניזמים רבים ומערכות, כוללים שורות תאים, עכברים ובני אדם 9-11. לאחרונה השימוש בו כבר תאר בדג זברה כדי לזהות מוטציות הנגרמות על ידי nucleases אצבע אבץ (ZFNs) וTALENs 6,12,13. במאמר זה, אנו מתארים כיצד לבצע HRMA PCR מבוסס בדג זברה עוברית ובוגרת (איור 1). פרוטוקול זה מתאים לאיתור SNPs, transgenes, ומוטציות, ובכלל זה siשינויי ngle בסיס זוג, הוספות או השמטות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">100 Reaction LightScanner Master Mix</td>
			<td style="width:145px;">BioFire</td>
			<td style="width:141px;">HRLS-ASY-0002</td>
			<td style="width:157px;">www.biofiredx.com</td>
			<td style="width:167px;">Store at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad Laboratories</td>
			<td style="width:141px;">HSP9665</td>
			<td>www.bio-rad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Microseal &#39;B&#39; Adhesive Seals</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad Laboratories</td>
			<td style="width:141px;">MSB1001</td>
			<td>www.bio-rad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">96-Well LightScanner Instrument</td>
			<td style="width:145px;">BioFire</td>
			<td style="width:141px;">LSCN-ASY-0040</td>
			<td>www.biofiredx.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">LightScanner Software with Call-IT 2.0</td>
			<td style="width:145px;">BioFire</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>www.biofiredx.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">High-Resolution Melting Analysis 2.0</td>
			<td style="width:145px;">BioFire</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>www.biofiredx.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">LightScanner Primer Design Software</td>
			<td style="width:145px;">BioFire</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>www.biofiredx.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Vector NTI Software</td>
			<td style="width:145px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>www.invitrogen.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Tricaine</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and efficient zebrafish genotyping using pcr with high-resolution melt analysis

דג הזברה היא מודל למערכת בעלי חוליות רבת עוצמה ללימוד פיתוח, דוגמנות מחלה, וביצוע הקרנת סמים. לאחרונה מגוון רחב של כלים גנטיים הוכנסו, כולל אסטרטגיות רבות לגרימת מוטציות ויצירת קווים מהונדסים. עם זאת, הקרנה בקנה מידה גדולה היא מוגבלת על ידי שיטות גנוטיפ מסורתיות, אשר גוזל זמן ועבודה אינטנסיבית. כאן אנו מתארים טכניקה לנתח גנוטיפים דג הזברה על ידי PCR בשילוב עם ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה (HRMA). גישה זו היא מהירה, רגישה, ולא יקרה, עם סיכון נמוך יותר של חפצי זיהום. Genotyping ידי PCR עם HRMA יכולה לשמש לעוברים או דגים בוגרים, לרבות בפרוטוקולי הקרנת תפוקה גבוהה.

הפרוטוקול ניתן לבצע במהלך יום אחד או פרוד בשלבים על פני כמה ימים (תרשים זרימה של עבודה מוצג באיור 1). מיצוי DNA אחריו להמיס וניתוח של amplicons ה-PCR. הטמפרטורות ללהמס של amplicon תלוי בגודל וGC-התוכן, אבל בדרך כלל מתחילות וטמפרטורות סוף 50 ˚ C ו 95 ˚ C מתאימות (2A דמויות ו2B). ברגע שלהמס מתבצע, הניתוח של העקומות להמיס הקרינה בדרך כלל דורש נורמליזציה של הווריאציה של עקומות מדגם השונות, תוך שימוש מראש ובאזורים שלאחר להמיס כתקנים (איור 2 ג). זה משפר את ההשוואה של תוצאות ממדגמים שונים שבווריאציה של הקרינה קשורה לשינויים ניסיוניים קטין. כל זוג של קווי טמפרטורה לנורמליזציה צריך להיות ממוקם כ 1 ˚ מלבד C (איור 2C, ראשי חץ).; הקבצה של תוצאות הנתונים מיוצגת בשתי דרכים שונות: גרף עליון שמציג פרופילים עקום להמיס, וגרף תחתון המציג עלילת הבדל תוסף בהשוואה למדגם התייחסות (איור 2 ד). ניתוח HRMA יכול לשמש כדי לזהות מוטציות (3A דמויות ו3B) או transgenes (איור 3 ג). באיור 3 א, שתי מוטציות שונות בגן eif2b5 מוצגות (עקומות אדומות וכחולה באיור 3 א) על ידי הפחתת נתוני הקרינה המנורמלת של מדגם wild-type. זה לא משנה שגנוטיפ נבחר להתייחסות. הבדלים עדינים יותר או מבלבל בלהמס עקומות ניתן להבחין באמצעות עלילת הבדל תוסף. באיור 3 ב, דוגמא של ארבעה גנוטיפים שונים באוסף יחיד של עוברים מוצגות. <img alt="איור 1" fo:content-width = &quot;5in&quot; עבור: src = /&gt; &quot;/ files/ftp_upload/51138/51138fig1highres.jpg&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/51138/51138fig1.jpg&quot; src איור 1. קווי המתאר של פרוטוקול לHRMA של הדנ&quot;א הגנומי דג הזברה מבוססת ה-PCR. מיצוי DNA מהרקמה שלמה (סנפיר-קליפ או עובר) ואחריו ההגברה PCR בנוכחות של צבע מחייב גדילי הדנ&quot;א כפול ניאון. Amplicon PCR הוא מפוגל ואות הקרינה נרשמה, ואחריו ניתוח להמיס עקומה, כדי לזהות amplicon ו / או להבדיל גנוטיפים. <img alt="איור 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51138/51138fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51138/51138fig2.jpg" /> איור 2. תמונות מסך של תוכנה לבצע HRMA ולנתח את התוצאות.. צילום מסך של תוכנת LightScanner;. תיבה צהובה מוגדלת ב&quot; B &quot;B. מוגדל תצוגה של אזור התאגרף ב&quot; &quot;. הגדרת התחלה והסיום טמפ מוצגות (חיצים). C. מקם את premelt וקווים שלאחר להמיס במקביל לנורמליזציה (ראשי חץ). שים לב לשונות הקרינה באזורים לפני ואחרי הכור (תיבה אדומה). גרף תחתון (קופסא ירוקה) מראה להמיס עקומות נגזרות ממגרשי נתונים הגולמיים הבאים נורמליזציה. ד. מראה גרף עליון להמס פרופילים עקום אחרי קיבוץ אוטומטי; גנוטיפים שונים באים לידי ביטוי בצבעים שונים (תיבה אדומה). גרף תחתון (קופסא ירוקה) מראה את עקומת הבדל הקרינה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51138/51138fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51138/51138fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51138/51138fig3.jpg" /> איור 3. שימוש במשאבי אנוש. MA לזהות מוטציות וtransgenes עקומות הבדל הקרינה מוצגות; שינוי בקרינה (ציר y) לטמפרטורה (ציר x) מוצג.. HRMA היה משמש לאיתור דגים שנשאו מוטציות בגן eif2b5. סוג בר מוצג באפור (חץ). צבעי אדום והכחולים מייצגים את שתי מוטציות eif2b5 שונות, אושר על ידי רצף של המוצר ה-PCR. ב &#39;. ארבעה אללים מוטנטים FOXP2 שונים מזוהים עם HRMA. zc82 / + (מחיקה נ&quot;ב 8), ירוקה:: zc83 / + (מחיקה נ&quot;ב 17), כחול: אדום zc82/zc83 (8bp מחיקת deletion/17bp), אפור:. zc83/zc83 (הומוזיגוטים מחיקת 17bp) C. דגי Gal4 מהונדסים (עקומות אפורות) ניתן להבחין מסוג בר (עקומת חום, חץ). שים לב כי לגילוי transgene, נורמליזציה לא צריכה להיות מבוצעת. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51138/51138fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis at JoVE.com

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

PCR בשילוב עם ניתוח ברזולוציה גבוהה להמיס (HRMA) הוא הוכיח כשיטת מהירה ויעילה לגנוטיפ דג הזברה.

מהירה ויעילה דג הזברה Genotyping באמצעות PCR עם רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

rapid-efficient-zebrafish-genotyping-using-pcr-with-high-resolution

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

22.1K Views.  University of Utah School of Medicine.  PCR בשילוב עם ניתוח ברזולוציה גבוהה להמיס (HRMA) הוא הוכיח כשיטת מהירה ויעילה לגנוטיפ דג הזברה. 

Video: Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is determined. Conventional preparation of tissues for PCR-ready DNA often take several hours to days, depending on the tissue sample. The genotype of the sample may thus be delayed for several days, which is not an option for many different types of experiments. Here we demonstrate the complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit. First, we demonstrate the fifteen-minute extraction of DNA from the tissue sample. Then, we demonstrate the real time read-out of the PCR amplification of the sample, which allows for the identification of a positive sample as it is being amplified. Together, the rapid extraction and real-time readout allow for a prompt identification of genotype of a variety different types of tissues through the reliable method of PCR.

The complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, is done in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

Genotyping מהיר של רקמות באמצעות עכבר חלץ-N-Amp רקמות סיגמא של ערכת ה-PCR

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable concentration level. But the design of conventional PCR thermocycling hardware, predominantly based on massive metal heating blocks whose temperature is regulated by thermoelectric heaters, severely limits the achievable reaction speed1. Considerable electrical power is also required to repeatedly heat and cool the reagent mixture, limiting the ability to deploy these instruments in a portable format.
Thermal convection has emerged as a promising alternative thermocycling approach that has the potential to overcome these limitations2-9. Convective flows are an everyday occurrence in a diverse array of settings ranging from the Earth's atmosphere, oceans, and interior, to decorative and colorful lava lamps. Fluid motion is initiated in the same way in each case: a buoyancy driven instability arises when a confined volume of fluid is subjected to a spatial temperature gradient. These same phenomena offer an attractive way to perform PCR thermocycling. By applying a static temperature gradient across an appropriately designed reactor geometry, a continuous circulatory flow can be established that will repeatedly transport PCR reagents through temperature zones associated with the denaturing, annealing, and extension stages of the reaction (Figure 1). Thermocycling can therefore be actuated in a pseudo-isothermal manner by simply holding two opposing surfaces at fixed temperatures, completely eliminating the need to repeatedly heat and cool the instrument.
One of the main challenges facing design of convective thermocyclers is the need to precisely control the spatial velocity and temperature distributions within the reactor to ensure that the reagents sequentially occupy the correct temperature zones for a sufficient period of time10,11. Here we describe results of our efforts to probe the full 3-D velocity and temperature distributions in microscale convective thermocyclers12. Unexpectedly, we have discovered a subset of complex flow trajectories that are highly favorable for PCR due to a synergistic combination of (1) continuous exchange among flow paths that provides an enhanced opportunity for reagents to sample the full range of optimal temperature profiles, and (2) increased time spent within the extension temperature zone the rate limiting step of PCR. Extremely rapid DNA amplification times (under 10 min) are achievable in reactors designed to generate these flows.

We describe a novel method to perform DNA replication via the polymerase chain reaction (PCR). Thermal convection is harnessed to continuously shuttle reagents between denaturing, annealing, and extension conditions by maintaining opposing surfaces of the reactor at constant temperature. This inherently simple design promises to make rapid PCR more accessible.

ראפיד PCR Thermocycling באמצעות הסעה תרמית Microscale

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

PCR מבוסס genotyping שיטה להבחין בין זנים wild-type ו נוי של Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

שימוש ברזולוציה גבוהה טומוגרפיה ממוחשבת כדי להמחיש את המבנה התל ממדים ופונקציה של הצמח vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

ראפיד ניתוח וחקירה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...