תודה מיוחדת לד&quot;ר קלייר מ ווטרמן עבור חונכות ודיונים, מישל ביירד ומייק דוידסון למתן רבים של מבנים cDNA פלורסנט המשמש במחקרים אלה, ועם קתרין אפלגייט Gaudenz Danuser לפיתוח תוכנת ניתוח MT plusTipTracker. עבודה זו נתמכה, בין השאר, על ידי מענק קא&quot;מ מן הריאות הלאומי ללב ודם (NHLBI) לבין המכון הלאומי לבריאות (NIH). (גרנט: 4K22HL113069).

The authors declare that they have no competing financial interests.

שימוש HUVECs בניסויי מורפולוגיה והגירה. Live- תא הדמיה של דינמיקת צמיחת MT שכותרתו EB3 בתוך HUVECs דורשת תנאי תרבית תאים מתאימים לשחזור כדי למדוד ולהעריך שינויים בצמיחת MT ומורפולוגיה HUVEC, כך שהם יכולים להיות מוקצים אז אל קיו איתות ECM. HUVECs מייצגים מודל מצוין לחקר צורת התא ואת תנועתיות. הם מאוד מקובלים transfection עם cDNAs fluorescently שכותרתו, הם מפגינים מורפולוגיות דרמטיות בתגובה הוא רמזי איתות מסיסים ופיסיים, והם שומרים על היכולת לארגן את עצמם לתוך צינורות כלי דם כאשר ספקו תנאי תרבית תאים מתאימים 65-70. בתרביות תאים ראשוניים, כגון HUVECs, מצריכה טיפול וניטור קפדני של מספר מעבר התא על מנת להבטיח את התאים בריאים וכי הם יתנהגו באופן רגיל בזמן ניסויים. לדוגמא, בעת ביצוע ניסויים חוקרים את cytoskeleטון ו / או מורפולוגיה תא, HUVECs לא אמור לשמש לניסויים מעבר למעבר תרבית תאים עשירית, כפי HUVECs בדרך כלל מתחילה להציג מורפולוגיות לא אחידות סביב המעבר כשנים-עשר עד חמישה-עשר. צפיפות תאים גם רגולטור חשוב לבריאות ושגשוגם HUVEC. חקירות הסתעפות HUVEC (ראה פרוטוקול 10.1-10.4, לעיל) להשתמש תרבויות צפיפות תאים נמוכות יחסית על מנת לספק את תאי מרחב פיזי כדי אינטראקציה עם ECM שלהם להאריך בליטות קנים. לעומת זאת, במחקרי גירת פצע קצה (ראה פרוטוקול 10.5-10.8), HUVECs הוא תרבות בשכבה לפני הפציעה. כפי HUVECs כזה, פצע קצה להציג מורפולוגיה יחסית un קנים, להאריך המובילים בליטות בקצה, ולהציג אינטראקציות תאי תאים עם השכנים המיידיים שלהם כפי שהם נודדים לתוך הפצע. אזהרות ואת היתרונות של Dynamics מעקב MT In Living HUVECs. ספינינג מיקרוסקופיה דיסק היא גישה מצוינתלבחון השערות ניסיוניות הדורשים בהירות התמונה confocal עם הזמן ברזולוציה גבוהה. עם מודול מצלמת הליזר המתאים, גישה מיקרוסקופיה זו רגישה קרינת פליטה נמוכה והוא יכול לסייע photobleaching מופחת לעומת סוגים אחרים של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חשוב לציין, גישה זו גם מתאימה גם עבור בינוני עד הדמית זמן ברזולוציה גבוהה כפי שנדרש להפקה מדידות מקיפות של דינמיקת צמיחת MT בגישת תיוג EB3, במגוון סוגי תאים שונים. בעוד המתודולוגיה EB3 של תיוג גדל MT פלוס קצוות יש יתרונות ברורים על פני שיטות אחרות של MTS תיוג פלורסנטי, יש לה גם חסרונות ייחודיים. לדוגמא, קיים יחס של מערך MT שאינו צומח באופן פעיל בכל זמן נתון, כולל הוא את האוכלוסייה של MTS פירוק ואוכלוסיית סטאבילה, MTS הלא דינמי 71-74. EB3 לא לתייג שני אלה אוכלוסיות של MTS וולכן התרומה של שתי אוכלוסיות אלה לא יכללו בניתוח נתוני הניסוי. מתודולוגיות אלטרנטיבי לבחינת מערך MT כולו התמקד ביטוי טובולין שכותרתו פלורסנטי, אשר משלב לתוך כל האוכלוסיות של MTS ומאפשר זיהוי של גדל, מתכווץ, ואת סטאבילה MTS. עם זאת, בגלל צפיפות גבוהה יחסית של המערך MT סמוך למרכז התא צמוד למרכז בארגון microtubule (MTOC), תיוג מערך MT כולו יוצר חיסרון בביצוע ניתוח התמונה של הקצוות MT שאינם ליד התא בפריפריה 75-77. ניסויים באמצעות שיתוף תיוג שני צבעים של MTS עם טובולין פלורסנט EB3 פלורסנט בתאים חיים חשפו, איכותית, כי הרוב המכריע של MTS שכותרתו טובולין הם גם שכותרתו EB3 78. בנוסף, לא היתה שיטה יעילה של מעקב אוטומטי של MTS שכותרתו עם טובולין ניאון. משמעות הדבר היא כי אוסף נתוניםtion ומדידות של דינמיקת MT בתאים המבטאים טובולין פלורסנט דורשים מעקב ביד של MTS פרט, תהליך שהוא לשגיאה ומייגעת. כתוצאה מכך, ניתוח חישובית אוטומטי של MTS EB3 שכותרתו הפך המתודולוגיה המועדף למדידת דינמיקת MT כפי שהוא יכול להיות מיושם על ניסויי דינמיקת MT פני סוגי תאים רבים בתוך מגוון רחב של משטרים הניסיונות 35,79. קישור Dynamics צמיחה MT כדי HUVEC מורפולוגיה וההגירה. מנקודת המבט של חוקר cytoskeletal, אחד הסתגלות שימושית מאוד של ניתוח המעקב אוטומטי plusTipTracker היא היכולת למדוד ולהעריך הוא שינויי תא ואזוריים בדינמיקת צמיחת MT. דרישת תא להפוך מקוטב היא תנאי מוקדם הכרחי נדידת תאים כיוונית. כרמזי איתות כזה, מקוטב כבר ידועים עוד גורמי נהיגת מפתח עבור נדידת תאים כיוונית 30,31,51,54,56,80,81 </sup&gt;. לדוגמא, מולקולות מסיסות איתות כגון VEGF לגרום פילמור יקטין וצמיחת MT כלפי קיו VEGF בסוגי תאי אנדותל 2,82-87. בנוסף, בתגובה אינטראקציות פיזי עם ECM (למשל, ציות ממדיות mechanosensing), HUVECs לווסת הדינמיקה MT שלהם על ידי מקומי ויסות מפות כדי לקדם צמיחה MT בתוך מתארך בליטות הקנים, וזה משמש כדי להנחות הגירה HUVEC בכיוון של קיו 5,31,88. לפיכך, קיטוב בתגובה לאותות איתות תאיים מדגיש את הצורך בהערכה ניסיונית של שינויי נקודות בדינמיקת cytoskeletal. Live- תא הדמיה סימולטני של דינמיקת צמיחת MT (בגישת EB3) ואת נדידת תאי HUVEC קשה מאוד לבצע בגלל MTs לגדול על ציר זמן של שניות, תוך שינויים במורפולוגיה תא והגירה כיוונית להתרחש בקנה מידת זמן של שעות. עם זאת הוא לגבי התהליכים הם אינטימי לינקהד. יתר על כן, רציפה, הדמיה מהירה של EB3 שכותרתו fluorescently על ציר הזמן השני מוביל photobleaching של האות EB3. ניסיונות להתגבר על בעיה זו על ידי ביצוע סדרת הדמיה קצרה EB3 (סדרת רכישה 1-2 דקות) כל 30 דקות הצליחו, אבל יכול להיות מושלם רק במספר קטן של ECS כי היה ביטוי אופטימלי של EB3 וכי לא להציג לרעה אפקטים תאורת לייזר חזר 5. גישה חלופית המאפשרת פרשנויות של איך דינמיקת צמיחת MT לתרום שינויים במורפולוגיה תא והגירה היא אזור plusTipTracker של העניין (ROI) כלי 35 (ראה פרוטוקול 6.6). מתודולוגיה זו מאפשרת לצמיחת MT התא כולו עוקבת להיות תת-מחולק לאזורים המוגדרים על ידי משתמש, שממנו מסלולי צמיחת MT אז יכולים להיות מופקים ונותחו. לדוגמה, השוואות של &quot;מסועפת&quot; לעומת אזורים &quot;הלא-קנים&quot; של התא חשפו כי MTS לגדול יותר שלנחות ועוד בהתמדה בתוך אזורים מסועפים לעומת הפריפריה של התאים הלא-קני 5. בשנת HUVECs פצע קצה מקוטב, השוואות של קצה המובילה ונגררת דינמיקת צמיחת MT הקצה גילו כי פירוק MT-induced MCAK מעוכב במיוחד בתוך הקצה המוביל, אבל לא נגרר לקצה. ערכה אזורית מובילים ונגרר דינמיקת צמיחת MT יתרון HUVECs להביע Rac1 ו / או מוטציות זירחון של MCAK עוד עולה כי הפעלת נגרמת Rac1 של אורורה-קינאז ספציפי מקומי מעכב פעילות MCAK בתוך הקצה המוביל לנהוג קיטוב HUVEC והגירה כיוונית 31. לכן, השילוב של מעקב אוטומטי של דינמיקת צמיחת MT וערכה האזורית של דינמיקת צמיחת MT בתוך בליטות קנים ו / או את הקצה המוביל של פצע קצה HUVECs אפשר לנו לקשר דינמיקת צמיחת MT מורפולוגיה וגירת HUVEC. הפרוטוקולים המתוארים הם designeד לספק מתודולוגיה פשוטה מאוד דיר בדרך כלל לתרבות HUVEC וחקירת ניסיוני. עם זאת, חלק ניכר מן פרטי הפרוטוקול הם מורכבים זמן רב, אשר, בתורו, מספק הזדמנות עבור שגיאות או קשיים בניהול המתודולוגיה הניסיון. למרות שזה היה ניסיון לטפל בבעיות פוטנציאליות ברחבי הפרוטוקול, כאן מסופק ולפתור בעיות נוספות, מפורטות של בעיות פוטנציאליות שניתנות פחות נפוצים או מקוצר אחרת כפי שמציין בתוך פרוטוקול המתודולוגיה. הקשורים coverslips ציפוי עם מצעים polyacrylamide (פרוטוקול 2.2), בעיה נפוצה הנשאלת היא האופי המורכב של הפעלת coverslips זכוכית, צימוד polyacrylamide אל הזכוכית, הפעלת polyacrylamide, ולאחר מכן צימוד ECM אל polyacrylamide. אחת במיוחד צעד קשה ובעייתי פוטנציאלי הוא culturing HUVECs על ג&#39;ל פיברונקטין / polyacrylamide הבא חשיפה של פוליהcoverslips מצופה crylamide עד 2 מ&quot;מ sulfo-SANPAH (שלב 2.2.2.6, לעיל). זה קריטי להצלחת culturing HUVECs על מצעים אלה כי sulfo-SANPAH יוסר לחלוטין ממערכת ניסיוני הבאה נטיית ECM. זה יכול להיות מושג בצורה הטובה ביותר על ידי שטיפה עם DDH 2 O ו דוגרים coverslips DDH 2 O על שייקר לילה. אם תאים בתרבית על ECMS polyacrylamide אינם שורדים, או אם הכדאיות הוא פחות מהצפוי, עלה וחזר לשטיפת sulfo-SANPAH לאחר נטיה כדי פיברונקטין (שלב 2.2.2.9) מומלץ פוטנציאל להקל על בעיה זו. קשור לפרוטוקול 3 (transfection cDNA ותרבות HUVEC על coverslip), השפעה גדולה על ההצלחה של הליך electroporation היא הטיפול של HUVECs היא במהלך trypsinization של התאים כדי להסיר אותם מבקבוק הפלסטיק, ובעקבות הסיום את electroporation (שלבים 3.3-3.4, לעיל). זה קריטי כדי אכפתמלא לפקח על HUVECs בעוד טריפסין, ולא יעלה את הזמן הדרוש עבור התאים &quot;עיגול לטובה&quot; על פני השטח של הבקבוק (בדרך כלל 1-2 דקות). זמן מופרז טריפסין הוא הגורם העיקרי למוות HUVEC, אשר בדרך כלל אינה ממומשת עד תאים מצופה על coverslips מצופה פיברונקטין (שלב 3.4) ולאחר מכן מצליחים לצרף המצע. חשיבות דומה, HUVECs (ורוב סוגי תאים ראשוניים) לא מסתדרים היטב כאשר מושעה • לפרקי זמן ממושכים למאגר electroporation. במהלך ניסויים בקנה מידה גדול יותר, למשל, כאשר המשתמש הינו חמש או יותר תנאים המחייבים electroporation, עדיף לשמור על התאים pelleted ב צינורות בודדים (1 צינור לכל transfection) כדי לערבב אותם, אחד-על-א-זמן , למאגר electroporation מיד לפני electroporation. גישה זו מקטינה זמן הדגירה חיץ electroporation והישרדות HUVEC מוגדל. בנוסף, הצלה מיידית בתקשורת התרבות השלמה היא גם crelectroporation הבא itical. עיכובי הצלת דקה אחת או יותר electroporation הבא יכולים לגרום סף המוות מוחלט HUVEC ובכך יש להימנע. assay נדידת תאים קשור (פרוטוקול 9), הטכניקה של culturing HUVECs בצפיפות גבוהה מאוד תלויה שינוי קריטי (כמתואר בשלב 9.2) של המתודולוגיה תרבית תאים המסורתית HUVEC (המתואר פרוטוקול 3) הדורש ייבוש של coverslip מצופה פיברונקטין על מנת לאפשר תרבות HUVEC לתוך שטח קטן מאוד של coverslip. פעמים רבות, אם coverslip לא יבש לחלוטין או אם ציפוי מראש של coverslip עם פיברונקטין (שלבים 2.1 או 2.2) היה לא יעיל, התאים המכילים התקשורת כי מושם על coverslip תאבד מתח הפנים שלה ולהרחיב את הקצוות של coverslip, ובכך להפחית את הצפיפות של תאים על coverslip. שיטה אחת כדי לפתור בעיה זו פוטנציאל היא לשאוב את התקשורת מן coverslip ולאחר מכןמקום coverslip (עדיין בצלחת 35mm שלה) לחלק האחורי של ארון הבטיחות הביולוגי למשך 5-10 דקות. הסתגלות זו יכולה לסייע כדי לאפשר את זרימת האוויר בתוך ארון לסייע בייבוש המנה. אם כל נוזל גלוי נשאר על coverslip לאחר ייבוש באוויר, לשאוב כתמים נוזליים ושוב ולאפשר לאוויר יבש למשך 5-10 דקות נוספות בקבינט בטיחות ביולוגית. חשוב לציין כי אין דרך למנוע זאת בעיה פוטנציאלית לחלוטין, אבל זה הופך להיות פחות בעיה עם תרגול חוזר של הפרוטוקול. זהו גם המלצה לפתרון בעיות אשר בעת הכנת coverslips עבור assay נדידת תאים (או כל assay, בכלל), כדי להכין coverslips נוסף ויש HUVECs נוסף מוכן ללכת במקרה של בעיות לאורך הדרך. עם שיקולים אלה לפתרון בעיות בחשבון, זה חשוב גם להדגיש את התועלת של פרוטוקולים דנו והשלכותיהם במחקר ביולוגיה של התא בעתיד. תחולת אל polyacrהגישה ylamide הוא רחב יריעה, וכוללת לא רק מחקרים דו מימדי ההתקשרות התא ECM (כמתואר לעיל), אלא גם חקירות תלת מימדי 5. יישום זה הוא קריטי להגדלת הבנתנו כיצד HUVECs להסדיר צורת תא והגירה בסביבות פיסיולוגיות אמורים לספק לחוקרי הבנה בסיסית של איך מורפולוגיים שינויים מתואמים עם שינויי cytoskeletal. בעוד הפרוטוקולים המתואר כאן מתמקדים מדידות של דינמיקת צמיחת MT, רוב הפרוטוקולים יכול וצריך להיות מותאם למדידה מספר רב של היבטים למדידה מיקרוסקופית אחרים של אינטראקציות התא-ECM. עם כל כבוד דינמיקת MT, ישנם רבים מפות, כולל לפחות 14 משפחות של kinesins 89, כל אחד עם תפקיד פוטנציאלי בתרומה הקוטבית HUVEC והגירה מכוונת, וכל אחד מהם יכולים להיחקר באמצעות הפרוטוקולים שהוצגו. חקירות עתידיות במקרה בוסימפוני יכוון אירוסי תא ECM ב רגיל לעומת מדינות חולות. פרוטוקולים HUVEC המוצגים כאן הם החלים על חקירות של תהליכים ההומיאוסטטית וסקולרית נורמלי, כמו גם מדינות מחלה כולל מחלות לב, רטינופתיה, גידולים סרטניים וגרורות, עד כמה שם. Conjugating בעליל מצעי ECMS ו polyacrylamide שקופים ציות נוח עם מחקרים מיקרוסקופים יאפשר ללימודי אירוסי התא ECM כך אנגיוגנזה וסקולרית תא האנדותל יכולה להיות במעקב עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. אלו סוגים של גישות ניסיוניות כבר החלו לחשוף הבדלים חשובים בכושר תא האנדותל, קוטביות, הגירה, ואת ההשפעות של פרוטאינים המווסתים תהליכים אלה 5,31,90. מאמצי עתיד צריכים לשאוף לזהות כיצד השילוב של ציות ECM ו- ממדי mechanosensing עשוי לשמש לחלבונים שליטים מקומית כי למקד ולהסדיר דינמיקת cytoskeletal.

אנגיוגנזה מופעלת על ידי רמזי איתות תאיים המקדמים בתאי האנדותל (EC) לקטב, נודדים עם ייחוד כיוונית, ויוצרים כלי דם חדשים ברקמות הדורשים אספקת דם. גורמים תורמים חשבו לנהוג אנגיוגנזה הם אותות מן מטריקס (ECM). בתגובה רמזים פיזיים, ECS להאריך סניפים חדשים עם ייחוד כיוונית להנחות כיווני תנועה במבנה של 1,2 רשת כלי הדם. הארכיטקטורה של מורפולוגיה הסתעפות EC מוגדרת על ידי רגולציה מקומית של שלד תא microtubule (MT) בצורה מתואמת עם הסדרת contractility acto-שרירן 3. על מנת סניפים EC להיווצר, שרירן-II חייב להיות downregulated מקומית, וכתוצאה מכך בליטות קרום מקומי 4. באותו הזמן באותו המקום בתוך התא, דינמיקת צמיחת MT הופכת שונה וכתוצאה מכך צמיחת MT איטית ומתמשכת לקידום ענף אלוןgation ויציבות 5. תקנה cytoskeletal מתואמת זו מאפשרת ECS לקטב המורפולוגיה שלהם כדי להקל על ההגירה כיוונית. ההתפתחות המינית של מורפולוגיה תא מקוטבת דורשת MT המקוטב הרכבה 6. בעת העברת לתאי האפיתל, MTS לגדול לאט במיוחד בהתמדה בחוד החנית של התא 7-9; בעוד בנוירונים, בייזום ההתארכות של אקסונים או דנדריטים דורשים כי MTS הם לא רק בהווה, אלא כי הם דינמיים עוברים תהליכי ההרכבה ופירוק 10-15. בדרך זו, שליטה מקומית של דינמיקת צמיחת MT מקובעת את הארכיטקטורה של התא ומאפשרת שיפוץ מהיר של מורפולוגיה תאים כמו ECS לנווט ECM שלהם. דינמיקת צמיחת MT מוסדרת על ידי משפחות של חלבוני מנוע מולקולריים וחלבונים לא מנועים, כינת חלבונים הקשורים microtubule או microtubule מתנגש חלבונים (להלן Referred כדי כמפות). מפות ניתן להפעיל באופן מקומי או מומת, בדרך כלל באמצעות איתות מפלי יזם בממשק התא ECM 16,17. ברגע פעיל, מפות פונקציה על ידי קשירה של MT ושינוי קינטיקה של הרכבה ופירוק MT; ובכך תפקוד מקומי להסדיר דינמיקת MT כדי לקדם צורת תא קוטבי 18-20. Mitotic centromere Associated Kinesin (MCAK) היא מפה המשפחה Kinesin-13 הנקשרת הקצוות וזוגות MT הידרוליזה ATP כדי פירוק MT 21-23. תפקיד פונקציונלי זה של MCAK ידוע להיות קריטי בתוך 24-28 ציר mitotic, כמו גם במהלך שלבי 29,30. בתוך השלבים ECS, פירוק MT בתיווך MCAK מוסדר על ידי זרחון המושרה אורורה-A המקומי של MCAK בתגובה לפצוע קצה הפעלה מושרה של GTPase Rac1 הקטן. התוצאה של מפל איתות לכך היא עיכוב של MCAK בחוד החנית של ECS, כשהתוצאה היא צמיחה MT מקוטב כלפי leading קצה ופירוק MT-induced MCAK בקצה המאסף של נודדות 31 ECS. מתודולוגיות מסורתית למדידת הדינמיקה צמיחה MT בדרך כלל השתמשו ביד מעקב של טובולין fluorescently שכותרתו או או, ולאחרונה, שכותרתו fluorescently חלבון מחייב MT סוף 1 או 3 (EB1 או EB3, בהתאמה). הגישה טובולין פלורסנט יש את היתרון של תיוג מערך MT כולו. עם זאת, משום שרוב סוגי תאי mitotic לשמור על מערך רדיאלי של MTS במהלך השלבים 8,32,33, MTS ליד centrosome מאוד צפוף, וכתוצאה מכך, מעקב צמיחת MT ופירוק עם טובולין ניאון בדרך כלל מוגבל לציוד ההיקפי אזורים של התא. המגבלות האלה, ניצול של חלבוני EB-שכותרתו fluorescently (EB1 או EB3) כבר הגישה הנפוצה יותר למדידת דינמיקת MT. בגלל EBS רק התווית הפלוס בסיום הגדילה של MTS, הם מופיעים כמו קטנים (1-3 מיקרומטר), ניאון בהיר לבואts, ובכך לספק סמן להבחין בקלות של פילמור MT עם קרינת רקע מוגבלת מאוד 34-37. בעוד העובדה תווית EBS רק קבוצת משנה של מערך MT מייצגת כוח עיקרי של גישת EB, הוא גם ממחיש מגבלה אחת חשובה, כי MTS שאינו צומח לא מסומן על ידי גישת EB3. עם זאת, היכולת למדוד ולעקוב אחר שביטי EB3 לאורך זמן וכדי להמחיש צמיחת MT בתוך האזורים הסלולר תת לעשות אידיאלי גישה זו עבור יישומים הדורשים ערכה אזורית של ארגון MT. מגבלה קריטית נוספת של מתודולוגיות מסורתית דינמיקת צמיחת MT מדידה כבר ערכות נתונים גדולות מאוד והזמן הדרוש לניתוח נתונים. מגבלה זו נובעת מהצורך למעקב יד של מאה שביטי EB ברזולוציה גבוהה בזמן. יתר על כן, מדידות אלה צריכות להיעשות מספר משמעותי סטטיסטי של תאים וגם בצעו תחת מגוון מלא experimeתנאי פתיחות opening סגירות closures. לאחרונה, האילוצים הללו הוכרעו באמצעות טכניקות ניתוח חישובית מכוונת ספציפית שביטים מעקב EB3 באמצעות מיקרוסקופ זמן לשגות בתאים חיים 35. כאשר נעשה שימוש כראוי, גישה חישובית זה משמש הוא להגביל את הפוטנציאל לטעויות אנושות הקשורים מעקב יד מעבר למתן שיטת תפוקה גבוהה של מדידת פילמור MT. ניתוח חישובית של דינמיקת MT באמצעות חבילת תוכנה מבוססת Matlab, plusTipTracker, מאפשר למדידות של צמיחת MT על ידי מעקב אחר שביטי EB3 שכותרתו fluorescently 5,31,35,38. בנוסף, תוכנת plusTipTracker מאפשרת חישובים של אירועי אסון MT (פירוק aka) מבוסס על העלמות שביטי EB3 בתוך מסלול MT גדל, ומאפשרת משנה הסלולר (aka אזורי) ניתוח של דינמיקת צמיחת MT בתוך אזורים המוגדר על ידי משתמש של עניין . עבור המחקרים שלנו, דינמיקת צמיחת MT הושוותה בתוךאזורים מסועפים לעומת אזורים שאינם קנים, או בתוך מובילים לעומת נגרר קצות תא. פלט נתונים מתוכנת plusTipTracker יכול לשמש גם כדי ליצור שכבות מסלול בצבעים עבור תאים בודדים ואזורי משנה הסלולר. כאן אנו מתארים את המתודולוגיה ששימשה לחקור את התפקיד של MCAK בויסות הדינמיקה צמיחה MT והתרומה של MT depolymerase זה להסדרת EC הסתעפות מורפולוגיה והגירה כיוונית. הגישה שלנו השתמשה שורת תאים ראשונית אדם טבורי הווריד לתאי אנדותל (HUVECs), אשר בקלות תרבותית נוחים מאוד, transfection החולף נגרמת electroporation של cDNA פלסמיד. לאחר מכן השתמשו ברזולוציה גבוהה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות של HUVECs טרנספקציה עם סיום MT חלבון מחייב 3 (EB3) ו mitotic centromere Associated Kinesin (MCAK) cDNA -specific בונה כדי לבדוק את ההשפעות על הדינמיקה MT טרנספקציה HUVECs. PlusTipTracker מבוסס ניתוח תמונה חישובית של EB3MT בתוספת הקצוות -labeled היה למדוד מהירויות צמיחת MT ו גלגולי צמיחת MT בתמונות זמן לשגות, למדוד ולהשוות השפעות של מניפולציות ניסיון על דינמיקת צמיחת MT. מתודולוגיה זו מאפשרת לחקר דינמיקת MT וזיהוי כיצד רגולציה מקומית של דינמיקת MT בתוך אזורי משנה הסלולר תורמת לתהליכי angiogenic של הסתעפות והגירת EC. טכניקות אלו חלות על חקירות של כל MAP כי יכול להיות מתויג fluorescently והביע בתאים חיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aurora A Inhibitor I</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethyloxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>99462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti&#8211;mouse IgG immunoprecipitation beads</td>
			<td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td>
			<td>88-1688-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti&#8211;rabbit IgG immunoprecipitation beads</td>
			<td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td>
			<td>88-7788-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET455/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET525/36m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET525/36m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET605/70m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET605/70m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET700/75m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET700/75m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>RPI Products</td>
			<td>A30075-100.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clara cooled charge-coupled device camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>77026010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 donkey anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyelight 649 goat anti-rat</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>112-496-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-MV SingleQuot Supply &#38; Growth Factors (contents shown below)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum 25 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine brain extract 2.0 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/mL, 10,000 ug Strep/mL)&#160; 10.0 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic shutter</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>77016099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S80026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT Protease inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-78425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP goat anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-036-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP goat anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-036-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8006-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon TiE</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>ASI Technologies</td>
			<td>MS-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>CS70330-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Aurora A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab130156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GAPDH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MCAK</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin (DM1A)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3873S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS310000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector Kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VACA-1003</td>
			<td>Contains the electroporation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000IU Pen/mL,10,000ug Strep/mL)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>91670249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum jelly</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2021854-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plusTipTracker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti&#8211;pT288&#8211;Aurora A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti&#8211;&#945;-tubulin</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA78G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>678-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk&#160;</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Yokagawa CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution time-lapse imaging and automated analysis of microtubule dynamics in living human umbilical vein endothelial cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells at JoVE.com

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

high-resolution-time-lapse-imaging-automated-analysis-microtubule

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K Views.  University of the Sciences in Philadelphia. Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed. 

Video: High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

בידוד של האדם תאים עורק טבורי האנדותל (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

ניתוח כמותי של הגירה אקראית של תאים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were first identified in adult human peripheral blood by Asahara et al. in 1997 2 bringing an infusion of new hypotheses and strategies for vascular regeneration and repair. EPCs are rare but normal components of circulating blood that home to sites of blood vessel formation or vascular remodeling, and facilitate either postnatal vasculogenesis, angiogenesis, or arteriogenesis largely via paracrine stimulation of existing vessel wall derived cells3. No specific marker to identify an EPC has been identified, and at present the state of the field is to understand that numerous cell types including proangiogenic hematopoietic stem and progenitor cells, circulating angiogenic cells, Tie2+ monocytes, myeloid progenitor cells, tumor associated macrophages, and M2 activated macrophages participate in stimulating the angiogenic process in a variety of preclinical animal model systems and in human subjects in numerous disease states4, 5. Endothelial colony forming cells (ECFCs) are rare circulating viable endothelial cells characterized by robust clonal proliferative potential, secondary and tertiary colony forming ability upon replating, and ability to form intrinsic in vivo vessels upon transplantation into immunodeficient mice6-8. While ECFCs have been successfully isolated from the peripheral blood of healthy adult subjects, umbilical cord blood (CB) of healthy newborn infants, and vessel wall of numerous human arterial and venous vessels 6-9, CB possesses the highest frequency of ECFCs7 that display the most robust clonal proliferative potential and form durable and functional blood vessels in vivo8, 10-13. While the derivation of ECFC from adult peripheral blood has been presented14, 15, here we describe the methodologies for the derivation, cloning, expansion, and in vitro as well as in vivo characterization of ECFCs from the human umbilical CB.

Endothelial colony forming cells (ECFCs) are circulating endothelial cells with robust clonal proliferative potential that display intrinsic in vivo vessel forming ability. Phenotypic and functional characterization of outgrowth endothelial cells derived from CB are important to identify and isolate bona fide ECFCs for potential clinical application in repairing damaged tissues.

אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאים מושבה אנדותל יוצרי נגזר דם טבורי האדם קורד

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

רכישת זמן לשגות סרטים הקרינה של שמרים להנץ וניתוח Dynamics תא בודד באמצעות שתלי

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

ניתוח של סטרס חמצוני בעוברי דג הזברה

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים לזמן-מיקרוסקופ תאורה מובנה לפקיעה

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...