ברצוננו להודות למרכז גנטיקה Caenorhabditis זנים, מדעי הטבע, המועצה מחקר הנדסי (NSERC), קרן קנדה עבור חדשנות (CFI) למימון. ברצוננו להודות ד ר ליזהן חן (החוג למערכות תא ו אנטומיה, UT בריאות סן אנטוניו) עבור המאפשר שימוש בלתי מוגבל של מתקני המעבדה שלה עבור כל הניסויים C. elegans , כמו גם ד ר וואנג Exing (מנהל שותף, מתקן הדמיה אופטית UT בריאות סן אנטוניו) לקבלת סיוע עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. אנחנו רוצים גם תודה ד ר מירון איגנטיוס למתן תמיכה ועידוד כדי להקל את. הצילומים.

1. כתם, תמונה lysosomes מעיים
<ol><li>זרע הצמיחה נמטודות מדיה (NGM) צלחות עם OP50
	<ol>
<li>הכינו צלחות NGM לפי הפרוטוקול המומלץ19 ולאפשר את הצלחות סגור להתייבש במשך יומיים בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לחסן OP50 חיידקים לתוך ציר מרק לוריא (LB) סטרילי ולגדול בתוך אמבט מים או חממה חזק ב 37 מעלות צלזיוס למשך 36 שעות או עד OD היא בין 0.2 0.4. הימנע משימוש תרבות חיידקי עם יתר > 1 או OD < 0.2.</li>
		<li>לאחר הצלחות NGM יבש, מקום טיפה (~ 30 µL) OP50 inoculum במרכז הצלחת, ולאחר מכן התפשטה הירידה לתוך תיקון בערך זה 2 ס"מ על 2 ס"מ בגודל. הערה: כל inoculum OP50 הנותרים ניתן לאחסן ב 4 ° C עבור עד חודש.</li>
		<li>היפוך הלוחות OP50 ברגע inoculum יבש (בערך 10 או 15 דקות) ולאחר מכן דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 36 שעות.</li>
		<li>לאחר 36 ה', להסיר את הלוחות מן החממה החנות ב 4 ° C עד לשימוש בעתיד. הערה: הלוחות צריך להיות טוב עבור חודש אחד עד 4 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>שכשהם cDCFDA כדי OP50
	<ol>
<li>כדי להשלים את cDCFDA על גבי לוחות OP50, להכין מלאי עבודה של 10 מ מ cDCFDA ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד). שמור את הפתרון cDCFDA מוגן מפני אור וחנות ב-20 ° C לשימוש מאוחר יותר.</li>
		<li>הנח בעדינות µL 100 בפתרון cDCFDA 10 מ מ על גבי המשטח של התיקון OP50 2 ס"מ x 2-ס מ, כך התיקון כולו מכוסה בצורה אחידה cDCFDA. הערה: חשוב מאוד כי התיקון כולו של OP50 מכוסה cDCFDA. אם נדרש, השתמש µL עד 150 של cDCFDA על כל צלחת. . זה גם הכרחי כי הפתרון cDCFDA לא להרחיב מעבר לגבולות התיקון OP50, מאז כל cDCFDA שזורם מתוך התיקון OP50 לא ישולבו לתוך האוכל, והתוצאה מכתימים בעוצמה מופחתת.</li>
		<li>למקם את הצלחות OP50 בקופסה כהה על גבי ספסל עד כל הפתרון cDCFDA נספג לתוך התיקון חיידקי (בדרך כלל כ- 25-30 דקות).</li>
	</ol></li>
	<li>צביעת תולעים באמצעות cDCFDA
	<ol>
<li>ברגע cDCFDA יש חילחלו לחלוטין את התיקון OP50, במקום לא יותר מ-20 תולעים לכל צלחת, דגירה הלוחות הפוכה ב 20 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 14 h. הערה: מומלץ למקם את הצלחות cDCFDA בתיבה אטומה כדי למזער את החשיפה לאור.</li>
		<li>כדי לשלוט על צריכת ההבדלים בין ניסויים, לנרמל את אותות cDCFDA, (מומלץ) כתם משותף עם 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) ( difluoro) בורון (2.5 µL של פתרון טרי 1 מ מ), צבע אמין חלש acidotropic אשר הוא שאינו משתנה במידה רבה על הספקטרום pH חומצי (ראה טבלה של חומרים עבור שמות נפוצים של ריאגנטים). הערה: אינו מכתים תולעים בשביל פחות מ 14 h, מאז זה עשוי לספק עוצמת מוכתמים cDCFDA לקוי ולתת פרשנות שווא של lysosomal pH.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת שקופיות מיקרוסקופ
	<ol>
<li>במקום שתי רצועות מקבילים של תיוג הקלטת כ 3 ס מ זו מזו על משטח שטוח חלקה, כגון מראה (איור 1).</li>
		<li>מעיל השטח של המראה עם ספריי דוחה מים, תנגבי את הנוזל העודף.</li>
		<li>להמיס agarose 2% (מומס מזוקקים H2O) במיקרוגל עד נוזלי לגמרי, ואז תעברו במהירות הירידה עם מגלשת מיקרוסקופ, כך לשקופית ניצב הרצועות של מקום טיפת µL 50 agarose בין שתי רצועות של נייר דבק הקלטת. לאחר agarose התחזק, ויוצרים כרית מעגליות מתחת למגלשה, נהפוך את השקופית ולהוסיף 10-15 µL של אזיד הנתרן 5 מ מ (נאן3) על גבי משטח agarose. הערה: נאן3 הוא מעכב ציטוכרום C כי כאשר נעשה שימוש בריכוזים נמוכים, הפיכה anesthetizes תולעים, כך שהם לא יזוז במהלך דימות.</li>
		<li>לבחור תולעים מהצלחת OP50 בתוספת cDCFDA, ומעבירים אותם אל צלחת NGM נקי ללא כל OP50. לאפשר את התולעים לנוע לכמה שניות לאפשר רוב OP50 להסיר פני השטח של התולעים, ולאחר מכן להעביר את התולעים כדי לרפד את agarose המכיל אזיד הנתרן 5 מ מ.</li>
		<li>מיד לכסות את משטח agarose עם מכסה. הקפד הנח בעדינות בתגית כיסוי מבלי להחיל מדי לחץ, שכן התוצאה יכולה להיות תולעים מתפוצץ. הערה: חיידקים OP50 בתוספת cDCFDA לזרוח כאשר visualized באמצעות מיקרוסקופ, ולכן חשוב לנקות את התולעים הטובה ביותר ככל האפשר לפני שמניחים אותם על משטח agarose המכיל אזיד הנתרן. אם מכינים יותר מ 6 זנים של C. elegans (כולל N2, פראי סוג הבקרה), רצוי להכין את הדגימות בקבוצות של 6, על מנת להבטיח כי התולעים לא להתייבש על משטח agarose. ב זנים מסוימים, הפות מתחילה להיקרע לאחר תקופות זמן בעקבות לחץ הרכב מכסה, לכן חשוב לתכנן בהתאם.</li>
	</ol></li>
	<li>מיקרוסקופיה קונפוקלית הערה: כמה מיקרוסקופים יש תכונה מובנית באופן אוטומטי מגביר את עוצמת קרינה פלואורסצנטית כדי לפצות על רמות מגוונות של זריחה. מיקרוסקופים כזה עשוי שלא לפעול היטב עבור הדמיה תולעים מוכתם cDCFDA, מאז הם מטבעם יאריכו את עוצמת קרינה פלואורסצנטית דגימות.<ol>
<li>לבצע הדמיה-מיקרוסקופ קונפוקלי הרגיל באמצעות עירור/פליטה אורכי גל מוגדר 488/530 ננומטר עבור cDCFDA. תמונות מטוס יחיד (לא Z-ערימות) של המעי lysosomes ולהשתמש רק lysosomes כי הם בפוקוס (עוצמת האות המקסימלי) על כימות עוצמת. הערה: אולי בגלל הבדלי צבע זמינות, lysosomes של תאי המעי האחורי ישירות אל הלוע לשמור על cDCFDA מכתים בעוצמה ללא התחשבות גנוטיפ או גיל, ומכאן להקפיד להימנע הדמיה lysosomes בתאים אלה.</li>
		<li>תמונה של השקופית המכילה 2 בן יום פראי סוג ש-n2 תולעים קודם. תוך כדי כך, להתאים את הפרמטרים הדמיה קונאפוקלית כגון עוצמת הלייזר, חריר, הצמצם כדי להבטיח כי cDCFDA מכתים בעוצמה הוא לא רווי. הערה: לאחר קביעת הגדרות אלה, אינם משנים אותם למשך כל ההדמיה ליום הזה.</li>
		<li>לכידת תמונות 1024 x 1024 פיקסלים של מטוס בודד של המעי (3 עד 4 תמונות לכל תולעת) באמצעות 60 X עדשת הגדלה. הערה: ספקטרום הפליטה cDCFDA בעיר וורמס תניב לשיא בולט יחיד-520 nm בד בבד עם שלה פלורסצנטיות דווח על הספקטרום20, המספקת הבדיקה אות מסוים כי הוא נבדל autofluorescence מעיים (איור 3).</li>
		<li>לייצא תמונת raw קונאפוקלית (קבצי. .lsm) .tiff קבצים לכל ערוץ.</li>
		<li>לאחר מכן, פתח ImageJ ולחץ על קובץ | פתח כדי לפתוח את קובץ התמונה כדי ניתן לכמת. לאחר טעינת התמונה, להשתמש בכלי בחירת צורת אליפסה ב ImageJ כדי לבחור אזור בעל עניין (ROI).</li>
		<li>לאחר מכן, לחץ על נתח | מדד לכמת את עוצמת קרינה פלואורסצנטית עבור זה רועי. בחר 4 – 5 lysosomes בפוקוס שונה לכל תמונה, לחשב את עוצמת קרינה פלואורסצנטית היחסי הממוצע של כל אזור בעל עניין (ROI).</li>
		<li>עבור כל תמונה, למדוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רקע באזור המעי בין lysosomes. להחסיר את ערכי העוצמה של קרינה פלואורסצנטית רקע מ ערכי העוצמה של זריחה lysosomal.</li>
		<li>בסך הכל, לאסוף את הערכים הבודדים בסביבות 30 עד 50 מנורמלת עבור עוצמת cDCFDA (בעלי חיים 6 עד 10) עבור כל זן נבדק. השתמש בערכים אלה כדי להתוות מגרש משערה ותיבת באמצעות תוכנה סטטיסטית המתאים. הערה: צביעת יכול להשתנות במידה ניכרת בהתאם גורמים כמו טמפרטורה, זמן הדגירה, הבריאות/עידן הכוללת של בעלי חיים כך השוואות עוצמת קרינה פלואורסצנטית הרלוונטיים רק בתוך דגימות בתהליך הניסוי מכתימים אותה. לכן חשוב לעבד את הפקדים בכל ניסוי מוכתמים. לחשב הבדלים סטטיסטיים (t-בדיקות) באמצעות תוכנה סטטיסטית המתאים.</li>
		<li>כל תמונה זנים מאותו הניסוי (מוכתם באותו יום) ברצף, מקפיד לא לשנות הפרמטרים הדמיה.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+aging+and+failure+to+segregate+damaged+proteins+in+Sir2+mutants.">Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants.</a> Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).</li><li>Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+for+the+avoidance+of+neurodegeneration.">Autophagy for the avoidance of neurodegeneration.</a> Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).</li><li>Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+intracellular+protein-degradation+pathways+in+neurodegeneration.">The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration.</a> Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).</li><li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity.">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).</li><li>Cuervo, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+aging:+the+importance+of+maintaining+&amp;#34;clean&amp;#34;+cells.">Autophagy and aging: the importance of maintaining &amp;#34;clean&amp;#34; cells.</a> Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).</li><li>Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+identifying+effectors+of+alpha-synuclein+misfolding+and+dopaminergic+cell+death+associated+with+Parkinson's+disease.">Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson's disease.</a> Methods. 53 (3), 220-225 (2011).</li><li>Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+amyloid+formation,+and+neurodegeneration:+a+critical+role+for+molecular+chaperones?.">Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones?.</a> Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).</li><li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decline+in+chaperone-mediated+autophagy.">Age-related decline in chaperone-mediated autophagy.</a> J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).</li><li>Tonoki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+evidence+linking+age-dependent+attenuation+of+the+26S+proteasome+with+the+aging+process.">Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process.</a> Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).</li><li>Squier, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+protein+aggregation+during+biological+aging.">Oxidative stress and protein aggregation during biological aging.</a> Exp Gerontol. 36 (9), 1539-1550 (2001).</li><li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+enhance+autophagy+and+reduce+toxicity+in+Huntington's+disease+models.">Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington's disease models.</a> Nat Chem Biol. 3 (6), 331-338 (2007).</li><li>Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+cellular+and+molecular+mechanisms.">Autophagy: cellular and molecular mechanisms.</a> J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).</li><li>Boya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+function+and+dysfunction:+mechanism+and+disease.">Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease.</a> Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).</li><li>Kim, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-aging+treatments+slow+propagation+of+synucleinopathy+by+restoring+lysosomal+function.">Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function.</a> Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).</li><li>Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+membrane+permeabilization+in+Parkinson+disease.">Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease.</a> Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).</li><li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+intracellular+proteolytic+systems+change+with+age?.">How do intracellular proteolytic systems change with age?.</a> Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).</li><li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+lysosomes+get+old.">When lysosomes get old.</a> Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).</li><li>Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=btn1,+the+Schizosaccharomyces+pombe+homologue+of+the+human+Batten+disease+gene+CLN3,+regulates+vacuole+homeostasis.">btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+vacuolar+pH+in+yeast+and+identification+of+acidification-defective+mutants.">Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).</li><li>Pringle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+methods+for+yeast.">Fluorescence microscopy methods for yeast.</a> Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).</li><li>Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Lysosomal+Function+by+the+DAF-16+Forkhead+Transcription+Factor+Couples+Reproduction+to+Aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 207 (1), 83-101 (2017).</li><li>Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+lysosomal+acidification-The+emerging+role+of+v-ATPase+in+aging+and+neurodegenerative+disease.">Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease.</a> Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).</li><li>Kang, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screening+identifies+ATM+as+a+target+for+alleviating+senescence.">Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence.</a> Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).</li><li>Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+formation+reduces+levels+of+mutant+huntingtin+and+the+risk+of+neuronal+death.">Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death.</a> Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).</li><li>Brunk, U. T., Terman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial-lysosomal+axis+theory+of+aging:+accumulation+of+damaged+mitochondria+as+a+result+of+imperfect+autophagocytosis.">The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis.</a> Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).</li><li>Gerland, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autolysosomes+accumulate+during+in+vitro+CD8++T-lymphocyte+aging+and+may+participate+in+induced+death+sensitization+of+senescent+cells.">Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells.</a> Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).</li><li>Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+analysis+of+differential+protein+expression+and+oxidative+modification+of+specific+proteins+in+the+brains+of+old+mice.">Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice.</a> Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).</li><li>Yin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+basis+of+lipofuscin,+ceroid,+and+age+pigment-like+fluorophores.">Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores.</a> Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).</li><li>Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reduction+in+intestinal+cell+pHi+due+to+loss+of+the+Caenorhabditis+elegans+Na+/H++exchanger+NHX-2+increases+life+span.">A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).</li><li>Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+lumenal+chloride+in+the+lysosome+is+critical+for+lysosome+function.">High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function.</a> Elife. 6, (2017).</li></ol>

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

מגוון רחב של אירועים תאית ומולקולרית לתרום הזדקנות, מושפע תכונות היסטוריית החיים וגורמים גנטיים. המחקר האחרון שלנו22 מרמז כי מחזור הרבייה ממלא תפקיד חשוב בשליטה על הכושר של סומא באמצעות ויסות lysosomal pH dynamics. הראנו שאת proteolysis lysosomal בתיווך הוא קידם בעוד חיות להתרבות באופן פעיל על ידי קולטנים upregulation של v-ATPase שעתוק, אשר בתורו מבטיח lysosomes חומצי. עם סיום רבייה, טיפות הביטוי v-ATPase, lysosomes alkalinize, אגרגטים חלבון להצטבר בתאים אלה.
הפרעות שפוגעים lysosomal acidification הוכחו להיגרם על-ידי פעילות שונה v-ATPase, בדחייה של הפונקציה v-ATPase במוח גם הוצע מושתתות מחלות ניווניות שונות23. התוצאות שלנו עוד תומכים בהשערה כי תפקוד לקוי v-ATPase הוא בין הגורמים של הזדקנות ביולוגית הסלולר, הזדקנות24.
אחד cytological סימן ההיכר של הזדקנות תאים הוא היווצרות פרוגרסיבי של חלבונים misfolded של צבור הישן תאים1,25,26,27,28,29. כמו post-reproductive C. elegans, חלבון דומה אגרגטים מצויים לומן lysosomal של המנוח מעבר מידע יונקים תרבותי תאים27,29. מאז lysosomes מסוף נקודת הקצה של הנתיב autophagic, זה מתקבל על הדעת כי זרם רציף של חלבונים פגומים ו organelles לתוך alkalinized lysosomes תוצאות נפילת פונקציונלי lysosomes אלה, אשר מוביל לשני אירועים במורד הזרם כי בסופו של דבר לתרום הזדקנות ביולוגית הסלולר.
הפרוטוקול המתואר כאן תוכנן לייצר הערכה לשחזור ופשוט של החומציות היחסית lysosomes מעיים של חיים C. elegans. בגלל טווח pH צר (4.5 – 5) נדרש אלה organelles עבור proteolysis תקין, מעודן מגבירה ב- pH יש השלכות דרמטיות על הומאוסטזיס הסלולר ורקמות17. קרינה פלואורסצנטית מאפיינים של pka נמוך של cDCFDA מאפשר את צבען ללכוד שינויים בשבועיים – חומציות החלון הזה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית pH18. הריכוז של cDCFDA מומלץ עבור צביעת lysosomes מוטבה כדי לספק את המדידה האפשרי הטוב ביותר של שינויים ב- pH lysosomal בהתבסס על פרמטרים ההדמיה שלנו ומערכת הדמיה. למרות זאת, התוצאות של cDCFDA מכתים עשויות להשתנות עבור משתמשי קצה שונים בהתבסס על כיוונון הדמיה שלהם בכל מקום כזה lysosomal pH שינויים שאולי לא במדויק להשתקף בדפוס מכתימים cDCFDA. אם זה קורה, דרך הפעולה הטובה ביותר תהיה להשתמש משתנה ריכוז cDCFDA (10 עד 100 מ מ) כדי לקבוע ריכוז אופטימלי הדמיה וריאציות ב- worms פראי סוג N2-יום 2 ופוסט יום 8 L4. ריכוז cDCFDA האידיאלי הוא זה כתמים lysosomes של צעירים (יום 2 פוסט L4) תולעים ביעילות מבלי להיות רווי אלא מראה על עוצמת מכתימים ירד לתולעים (יום 8 פוסט L4) הישן.
אחת המגבלות של טכניקת צביעת cDCFDA היא זמן הדגירה הארוכה שלו. כאשר תולעים מודגרת בנקודת זמן מסוימת, ניתן לאבחן את התוצאות רק לאחר ~ 24 h. זה יהיה יעיל יותר לפתח זן של C. elegans המספקת הבדיקה בזמן אמת של lysosomal pH, ככל הנראה באמצעות fluorophore pH רגיש מתויג כדי חלבון הממברנה lysosomal.
אמנם קיימים כמה טכניקות שונות להערכת pH במעי של C. elegans, רוב שיטות אלה או להעריך את ה-pH של המעי כמו כל30, או דורשות הזרקה לתוך חלל הגוף, וזה זמן רב מסורבלת31. cDCFDA בקלות יכול להיות מיושם עבור מסכי גנטי בקנה מידה גדול באמצעות ספריות RNAi האכלה כדי לחפש מוטנטים C. elegans את הצג משתנה pH lysosomal או פיזיולוגיה. ההיבטים הקריטיים רק של שיטה זו הן ריכוז cDCFDA בשימוש ולהיות בטוח לכלול צעיר (יום 2 פוסט L4) N2 זן בקרת תקן ביצוע עבור קביעת תצורה של הדמיה קונאפוקלית במהלך כל ההפעלה.
כדי להבין טוב יותר את התרומה של pH lysosomal כדי הזדקנות, יהיה חשוב לנתח את מנגנוני הרגולציה מאחורי השינויים הדינמיים בשבועיים – חומציות lysosomal בתגובה תשומות הסלולר וסביבתיים שונים. cDCFDA מכתים עשוי לשמש אסטרטגיה אחת כדי להרחיב את המחקר הזה C. elegans.

המראה של אגרגטים חלבון מקובל להיות סימן היכר של הזדקנות התאים האיקריוטים1,2,3, היווצרות אשר נחשבת בקרב הנהגים עיקרון של הזדקנות ביולוגית הסלולר4 , 5 , 6 , 7. גדל ראיות כי כמו תאים גיל, פירוק חלבון פגום, מובילה לעלייה צבירת חלבון. נפילת proteolysis ב הזדקנות תאים כרוך ליקוי autophagy8 , כמו גם חלבון בתיווך פרוטאוזום השפלה9. לבסוף, חמצון החלבון בלתי הפיך הוא גדל בתאים הישנים, בהמשך ופוגע קטבוליזם חלבון10.
Autophagy. בהתחלה חשבו להיות תהליך לא בררניים עבור השפלה בכמות גדולה של חלבונים פגומים, אבל מחקרים אחרונים הראו ש-autophagy הזה הוא סלקטיבי מאוד קטבוליזם של אגרגטים חלבון לקוי organelles שאינם נוטה השפלה באמצעות מנגנוני אישור11האחרים חלבון. במהלך התהליך של autophagy, חלבונים פגומים, צבורים הן מבודדות לתוך שלפוחית כפול-הממברנה קרא את autophagosome. ואז, autophagosome הזה בין עם organelles חומצי בשם lysosomes, אשר מוביל השפלה של מטענים autophagosome12. Lysosomes מייצגים את מובילים של הנתיב autophagic ולהשתתף תהליכים תאיים שונים כגון תיקון קרום, בקרת גנים ברמת השעתוק חישה מזין; הדגשת תפקידם מרוכזת של הומאוסטזיס הסלולר (שבתוך הפניה למעורר 13). מספר מחקרים הראו אסוציאציה בין תלויי-גיל ירידה בתפקוד lysosomal הפרעות ניווניות שונות13. באופן עקבי, שחזור פונקציה lysosomal בתאים בוגרים יכולים לעכב את התחלתה של זיקנה פנוטיפים14,15. מחקרים של ההרכב של הסביבה שבה התרחשה intralumen מראים כי קריסת פונקציית lysosomal תאים בוגרים אינה עקב ירידה בייצור של פרוטאזות lysosomal16. לחלופין, שהוא הוצע כי אובדן intralysosomal חומציות, דרישה קריטי של פעילותה אנזימטיות, עשויה ביסוד ירידה בתיווך ליזוזום proteolysis17. כדי שתוכל לחקור את השערה זו, זה חיוני לפתח נוגדנים ופרוטוקולים כדי לחקור דינאמי לשינויים lysosomal pH של תאים חיים בצורה עקבית לשכפול.
המעי של C. elegans הוא הרקמה חילוף החומרים העיקריים בעיר וורמס וזה מווסת קריטי של הומאוסטזיס מערכתית ואת תוחלת החיים. פיתחנו מבחני להעריך את השינויים בהחומציות של לומן של lysosomes מעיים של תולעים כדי לקבוע כיצד בתיווך ליזוזום proteolysis תורמת להזדקנות. למרות fluorophores pH רגיש שימשו בעבר C . elegans כדי לסמן lysosomes מעיים, לא עוד היה מאמץ כדי לבסס פרוטוקול מוצלח שיכול לזהות עליות קטנות ב- lysosomal pH ויוו18. כאן, אנו מספקים פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות אובדן של חומציות lysosomal בתאים מעיים של C. elegans באמצעות פרוטוקול האכלה פשוטה ונוחה המשלבת של pH רגיש fluorophore (cDCFDA) למזון OP50.

<table><tbody><tr><td>OP50 (&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50</td></tr><tr><td>5(6)-carboxy-2&amp;rsquo;,7&amp;rsquo;-dichlorofluorescein diacetate&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>C369</td><td>Commonly known as cDCFDA</td></tr><tr><td>9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#039;H-2,2&#039;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron</td><td>ThermoFisher</td><td>L7528</td><td>Commonly known as Lysotracker Red</td></tr><tr><td>Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>LB Broth powder</td><td>ThermoFisher</td><td>22700041</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Sigma</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>S71604</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol powder</td><td>Sigma</td><td>C3045&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>K3PO4</td><td>Sigma</td><td>P5629</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slips</td><td>ThermoFisher</td><td>3406</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mirror or other smooth flat surface</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessing lysosomal alkalinization in the intestine of live caenorhabditis elegans

תולעים נימיות Caenorhabditis elegans (C. elegans) היא מערכת מודל זה נעשה שימוש נרחב ללמוד אריכות ימים מסלולים התפתחותית. מחקרים כאלה מתבצעים על ידי השקיפות של החיה, היכולת להעביר ולהפוך מבחני גנטי, הקלות היחסית ביצירת החלבונים fluorescently שכותרתו, השימוש של צבעי פלורסנט, זה גם יכול להיות microinjected לתוך המוקדמת העובר או שולבו אוכל שלה (e. coli זן OP50) כדי להדביק תווית organelles הסלולר (למשל 9-diethylamino-5 שעות-benzo (א) phenoxazine-5-1 ו (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). כאן, אנו מציגים את השימוש ה-pH רגיש הפלורסנט זה כתמים lysosomes מעיים, מתן של הבדיקה חזותית של שינויים דינמיים, פיזיולוגיים של חומציות lysosomal תולעים בשידור חי. פרוטוקול זה לא למדוד lysosomal pH, אבל מעדיף שואפת להקים שיטה אמינה של הערכת פיזיולוגיים וריאציות הרלוונטיים ב lysosomal חומציות. cDCFDA הוא תרכובת תא-permeant המרת ניאון fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) על הידרוליזה על ידי תאיים esterases. פרוטונציה בתוך lysosomes מבצע השמנה cDCF ב organelles האלה, איפה זה מצטבר. עקב pKa שלה נמוכה של 4.8, צבע זה שימש חיישן ה-pH של שמרים. כאן נתאר את השימוש cDCFDA כתוספת מזון כדי להעריך את החומציות במעיים lysosomes ב C. elegans. טכניקה זו מאפשרת איתור lysosomes alkalinizing בבעלי חיים, , יש מגוון רחב של יישומים ניסיונית כולל מחקרים על הזדקנות autophagy, lysosomal להן.

cDCFDA כתמים lysosomes באופן תלוי-pH, ומאפשרת שלה נמוך pKa, ספיגת מוכן לתוך lysosomes של חיישן ה-pH אידיאלי21. cDCFDA מכתים בעוצמה הוא ביחס הפוך ל18,lysosomal pH (קרי מכתימים בעוצמה מתגבר ככל pH יורדת)22. cDCFDA אותות חלשים באופן עקבי lysosomes של בעלי החיים מטופלים עם 20 מ מ כלורוקין, מעכב של lysosomal acidification, וכן תולעים של v-ATPase, החלבונים על הקרום של lysosomes הנדרשת עבור ייבוא פרוטון22 . אלה הם פקדים חשוב להשתמש בעת הערכת רמות היחסי של cDCFDA מכתים רקע גנטי או טיפולים אחרים.
אנו מוצאים גם ללא תופעות עבירה של חשיפה cDCFDA על הכושר או פוריות שטופלו תולעים (נתונים לא מוצג). באמצעות פרוטוקול זה, זיהינו אובדן אנדוגני של חומציות lysosomes של post-reproductive פראי סוג התולעים. כפי שמוצג באיור 3, האות זריחה cDCFDA הוא עמיד ב lysosomes של יאנג (2 יום פוסט L4) מתרבה C. elegans, המסמלת acidified lysosomes. עוצמת מכתימים מפחית במידה ניכרת על alkalinization של lysosomes, כפי שנצפתה הישן (8 ימים פוסט L4) תולעים גם כמו תולעים איפה זרם פרוטון לתוך אלה organelles מצטמצם (דרך נוקאאוט של גנים vha קידוד subunits v-ATPase). באמצעות שיטה זו, הבחנו לאובדן פיזיולוגיים של חומציות lysosomal במעי של בעלי חיים post-reproductive (תרשים איור 2, קרינה פלואורסצנטית תמונות באיור 3). CDCFDA מופחת אות במעיים של יום 8 (post-L4) תולעים הצביע על alkalinized lysosomes של ליקוי אפשריים בשחרור מהמכס חלבון. זהו למעשה המקרה, כפי החיות האלה באופן משמעותי לצבור אגרגטים חלבון בתוך lysosomes בגיל הזה שלב החיים22. כדי לאמת את תפקיד של לומן דה-acidification בתהליך זה, אנחנו שיתוף צבעונית צעיר, מתרבה חיות היה התרוקן ידי RNAi של שני רכיבים מרכזיים של v-ATPase משאבת מכונות (VHA-2 ו- VHA-8), לכן מומלץ כראוי שתייבא הפרוטונים לתוך lysosomes. כצפוי, vha-2 ו- vha-8 חיות RNAi, אפילו בשלב הרבייה, הראה cDCFDA מופחת קרינה פלואורסצנטית אותות דומות לאלה של תולעים post-reproductive פראי סוג בקנה אחד עם alkalinized lysosomes (איור 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57414/57414fig1.jpg"> איור 1: הכנת שקופיות מיקרוסקופ. צעד אחר צעד שרטוט פשוט מציג את השלבים כדי להיות בעקבות הכנת שקופיות מיקרוסקופ.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57414/57414fig2.jpg"> איור 2: שימוש רגיש pH צבעים כדי לחקור חומציות lysosomes מעיים של C. elegans. דיאגרמה המציגה את הדפוסים של עוצמת קרינה פלואורסצנטית cDCFDA מעיים (יום 2) ושל תולעים שלאחר הרבייה (יום 8). הדיאגרמות העליון להראות תולעים שלמות. הקופסאות הנתונים ייצגו התחתון הגדלה, מוקרן דיאגרמות של האזור פיתול, לומן מעיים במרכז. Lysosomes מתוארים שלפוחית בגדלים בציטופלסמה של תאי המעי. השוואת דיאגרמות סכמטית אלה עם איור 3 תמונות.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57414/57414fig3.jpg"> איור 3: צביעת תמונות cDCFDA. נציג תמונות מראה יום 2 יום 8 (פוסט L4) C. elegans מעיים lysosomes (N2 פראי סוג) מוכתם cDCFDA, כמו גם lysosomes מעיים של תולעים RNAi vha-2 ו- vha-8 מוכתם cDCFDA (בקרת חיובי). vha-2 ו- vha-8 קדד subunits של ATPase vacuolar (vATPase), משאבת הפרוטונים רירית קרום lysosomal כי הוא אחראי על לחומצי לומן lysosomal.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

מדריך צעד אחר צעד כדי לחקור אובדן של חומציות lysosomal במעי של C. elegans באמצעות לצבוע חיוני רגיש pH 5 (6) - carboxy - 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

הערכת Alkalinization Lysosomal ב המעי של חיים Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

assessing-lysosomal-alkalinization-intestine-live-caenorhabditis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

5.9K Views.  University of Saskatchewan. מדריך צעד אחר צעד כדי לחקור אובדן של חומציות lysosomal במעי של C. elegans באמצעות לצבוע חיוני רגיש pH 5 (6) - carboxy - 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

Video: Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine whether there is an imbalance in age-related energy metabolism between mitochondrial oxidative phosphorylation and aerobic glycolysis. Here, we show the utilization of commercial colorimetric assay kits for lactate and pyruvate in the model organism C. elegans. Recently, the sensitivity and accuracy of the colorimetric/fluorimetric assay kits have been improved greatly by the research and development conducted by reagent manufacturers. The improved reagents have enabled the use of small-scale assays with a 96-well plate in C. elegans. In general, a fluorimetric assay is superior in sensitivity to a colorimetric assay; however, the colorimetric approach is more suitable for the use in common laboratories. Another important issue in these assays for quantitative determination is protein precipitation of homogenized C. elegans samples. In our protein precipitation method, common precipitants (e.g., trichloroacetic acid, perchloric acid and metaphosphoric acid) are used for sample preparation. A protein-free assay sample is prepared by directly adding cold precipitant (final concentration of 5%) during homogenization.

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe a modified small-scale extraction and colorimetric assays of lactate and pyruvate in the nematode C. elegans. When utilizing commercial assay kits, the technical development of their sensitivity and accuracy is important. Protein precipitation in extraction is the most critical step for the quantitative determination of intracellular metabolites.

ערכי צבע מוחלטים מבחני של תאיים לקטט בקנה מידה קטן ו פירובט ב נמטודות Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Biochemistry

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

C. elegans המעי כמו המודל עבור המערכת לומן מורפוגנזה ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן ברמה תא בודד: תיוג על ידי נוגדנים מכתים, ניתוח אובדן RNAi-של-פונקציה והדמיה

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Biology

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a nonmammalian animal model that is widely used as an assay system due to its short lifespan, transparency, cost-effectiveness, and lack of animal ethics issues. In this study, a method was developed to investigate the effects of different bacteria and 3,3'-diindolylmethane (DIM) on the intestinal permeability of C. elegans with a high-throughput image analysis system. The worms were infected with different gut bacteria or cotreated with DIM for 48 h and fed with fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran overnight. Then, the intestinal permeability was examined by comparing the fluorescence images and the fluorescence intensity inside the worm bodies. This method may also have the potential to identify probiotic and pathogenic intestinal bacteria that affect intestinal permeability in the animal model and is effective for examining the effects of harmful or health-promoting chemicals on intestinal permeability and intestinal health. However, this protocol also has some considerable limitations at the genetic level, especially for determining which genes are altered to control illness, because this method is mostly used for phenotypic determination. In addition, this method is limited to determining exactly which pathogenic substrates cause inflammation or increase the permeability of the worms' intestines during infection. Therefore, further in-depth studies, including investigation of the molecular genetic mechanism using mutant bacteria and nematodes as well as chemical component analysis of bacteria, are required to fully evaluate the function of bacteria and chemicals in determining intestinal permeability.

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

This protocol describes how to measure intestinal permeability of Caenorhabditis elegans. This method is helpful for basic biological research on intestinal health related to the interaction between intestinal bacteria and their host and for screening to identify probiotic and chemical agents to cure leaky gut syndrome and inflammatory bowel diseases.

מדידת ההשפעות של חיידקים וכימיקלים על חדירות המעי של האלמרנים

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

Medicine

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Neuroscience

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved in humans and are associated with metabolic syndrome or other diseases. Examination of lipid accumulation in this organism can be carried out by fixative dyes or label-free methods. Fixative stains like Nile red and oil red O are inexpensive, reliable ways to quantitatively measure lipid levels and to qualitatively observe lipid distribution across tissues, respectively. Moreover, these stains allow for high-throughput screening of various lipid metabolism genes and pathways. Additionally, their hydrophobic nature facilitates lipid solubility, reduces interaction with surrounding tissues, and prevents dissociation into the solvent. Though these methods are effective at examining general lipid content, they do not provide detailed information about the chemical composition and diversity of lipid deposits. For these purposes, label-free methods such as GC-MS and CARS microscopy are better suited, their costs notwithstanding.

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Nile red staining of fixed Caenorhabditis elegans is a method for quantitative measurement of neutral lipid deposits, while oil red O staining facilitates qualitative assessment of lipid distribution among tissues.

כימות של השומנים לשפע, הערכה של השומנים הפצה Caenorhabditis elegans ע י הנילוס אדום אדום שמן מכתים O

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

הדמיה ללא תווית של דינמיקת אחסון השומנים באלגנים של Caenorhabditis באמצעות מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

<meta charset="utf8"></head><body>הערכת חילוף החומרים ודפוס ההזדקנות ב - Caenorhabditis elegans

Using Low-Cost Dyes to Visualize Glycogen Accumulation and Gut Integrity in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a transparent, non-parasitic nematode with a simple biology, which makes it a great tool for biological sciences teaching through the staining of the cells or their molecular content. Lugol dye (iodine-potassium iodide solution) has been widely used in biochemistry to stain glycogen stores. In this context, it is possible to observe differences between fed and starved animals, besides the effects of different conditions, such as different diets and oxygen levels. Erioglaucine is a blue dye that indicates the loss of the intestinal barrier. When the intestinal barrier is intact, the blue dye stains inside the lumen; however, when this integrity is disrupted, the dye leaks into the body cavity. Using a stereomicroscope or a microscope, teachers can demonstrate physiological and biochemical alterations, or they can instigate students to ask a scientific question and hypothesize and test their hypothesis using these assays. The present protocol describes two staining techniques in C. elegans that can be easily carried out by students.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: חקר תהליכים מטבוליים והזדקנות ב- C. elegans באמצעות בדיקות בעלות נמוכה ובעלות השפעה גבוהה

Teaching biological sciences can be made more stimulating for students through the use of experimentation. This manuscript presents two different yet complementary protocols that can be utilized in the classroom to encourage students to formulate and test hypotheses related to high-calorie diets, starvation, and aging.

שימוש בצבעים זולים כדי להמחיש הצטברות גליקוגן ושלמות המעי ב - Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a transparent, non-parasitic nematode with a simple biology, which makes it a great tool for biological sciences ...

הערכת Alkalinization Lysosomal ב המעי של חיים Caenorhabditis elegans

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ערכי צבע מוחלטים מבחני של תאיים לקטט בקנה מידה קטן ו פירובט ב נמטודות Caenorhabditis elegans

C. elegans המעי כמו המודל עבור המערכת לומן מורפוגנזה ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן ברמה תא בודד: תיוג על ידי נוגדנים מכתים, ניתוח אובדן RNAi-של-פונקציה והדמיה

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

מדידת ההשפעות של חיידקים וכימיקלים על חדירות המעי של האלמרנים

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב

כימות של השומנים לשפע, הערכה של השומנים הפצה Caenorhabditis elegans ע י הנילוס אדום אדום שמן מכתים O

הדמיה ללא תווית של דינמיקת אחסון השומנים באלגנים של Caenorhabditis באמצעות מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה

שימוש בצבעים זולים כדי להמחיש הצטברות גליקוגן ושלמות המעי ב - Caenorhabditis elegans