בגלל אורגנואידים recapitulate הארגון המבני המקומי, כמו גם תכונות מולקולריות רבות של אפיתל מעיים ב vivo, טכניקה זו מאפשרת לנו ללמוד ביולוגיה נורמלית מצבי מחלות במעבדה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת להנדס גנטית אורגנואידים באמצעות גישת טרנסדוקציה יעילה מאוד עם ציטוקסיקיות נמוכה, ובכך לאפשר מחקרים פונקציונליים של אורגנואידים אלה מניפולציה גנטית. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לכיוון טיפול למחלות מעיים כי אנחנו יכולים לחשוף אורגנואידים מעיים לתרופות וסוכנים אחרים או התערבויות.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד תהליכים התפתחותיים ופתולוגיים במערכות אחרות נוח לתרבויות אורגנואידיות, כגון רקמות השד או לתאים הגדלים בתנאים דו-מימדיים סטנדרטיים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יצליחו עם התברות באורגנואידים קשים להנדסה או בתאים אחרים. היה לנו לראשונה את הרעיון לשיטה זו כאשר נתקלנו בקשיים מתמר האורגנואידים שלנו ותאי גזע.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו אובדן מבני של האורגנואידים יכול להתרחש אם דגימות אינם מטופלים כראוי במהלך תהליך ההטבעה לתוך מטריצת המרתף עבור cryosectioning. כדי לגדל אורגנואידים עבור התמרה ויראלית, תרבויות תאים אורגנואידים זרעים עם 200 מיקרוליטרים של מדיום שכפול ל הבאר בצלחת 48 באר, ודגירה באינקובטור תרבות רקמה סטנדרטית. להפשיר בקבוקונים של וירוס עבור התמרה, המאפשר כ 50 microliters של וירוס מרוכז לתרגום של כל באר צלחות 48 באר.
בצינור של 1.5 מיליליטר, מערבבים את הנגיף עם 12 מיקרוליטרים של תותב ננו-חלקיקים מגנטי, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, מוסיפים את פתרון הננו-חלקיקים המגנטיים ואת תערובת הווירוסים לתאים כדי להתמר. מניחים את צלחת 48 באר על צלחת מגנטית, ודגירה באינקובטור תרבות רקמות סטנדרטי לפחות שעתיים.
כאשר ההטרנספיה הנגיפית הושלמה, מעבירים את אשכולות התאים האורגנואידיים הנגועים ואת מדיום ההעתקה מכל באר לצינור של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 500 פעמים g במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי עם יניקה עדינה, וקררו את הצינורות המכילים את גלולת הקרח למשך חמש דקות.
הוסף 120 microliters של מטריצת קרום מרתף לכל צינור, ו resuspend את גלולה על ידי צינורות לאט למעלה ולמטה. זרעים 30 מיקרוליטר טיפות של תערובת תא מטריצה לתוך צלחת חדשה 48 היטב. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש עד 15 דקות עד המטריצה מתגבשת.
מוסיפים מדיום טרנסדוקציה לכל באר, וקטורת ב חממה סטנדרטית לתרבות רקמות למשך שלושה עד ארבעה ימים. לאחר שלושה עד ארבעה ימים, לבדוק את התרבויות תחת מיקרוסקופ אור ב 10x הגדלה כדי להבטיח ארגון של אשכולות תאים לתוך מבנים אורגנואידים. החלף בעדינות את מדיום ההעתקה בכל באר ב-250 מיקרוליטרים של מדיום ENR של תרבות האורגנואידית.
תחזיר את הצלחת לאנקובטור. התחל הליך זה על ידי הסרת מדיום ENR על ידי יניקה עדינה, נזהר לא לטרטר את מטריצת קרום המרתף. יש לשטוף בעדינות עם 500 מיקרוליטרים של PBS.
תקן את האורגנואידים על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של 4% פתרון paraformaldehyde לגם, ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, להסיר את פתרון paraformaldehyde על ידי יניקה. מוסיפים בעדינות מיקרוליטר אחד של PBS ל באר, ולאחר מכן להסיר את PBS על ידי יניקה עדינה.
בדרך זו, לשטוף פעמיים עם PBS. הסר את ה- PBS מהכביסה השנייה והוסף מיקרוליטר אחד של מאגר סוכרוז של 30% לכל דגימה. דגירה אורגנואידים קבועים סוכרוז במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס כדי לייבש את הדגימות.
הסר את מאגר סוכרוז על ידי יניקה, ולהוסיף רק מספיק תרכובת הטבעה כדי לכסות את שכבת מטריצה בכל באר. דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, מניחים את הדגימות במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות או עד שתרכובת ההטבעה הופכת מוצקה ולבנים.
מניחים את הצלחת עם תרכובת הטבעה קפואה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר התכה מינימלית של המתחם לאורך הקצוות. השתמש אזמל או מרית כדי להפריד את הבלוק מקירות הבאר. עבוד במהירות כדי למנוע התכה, באמצעות ממטרות כדי להסיר את המטריצה הטבעה בלוק מורכב, ולמקום אותו בבלוק דגימה.
ממלאים את התבנית לחלוטין עם תרכובת הטבעה. להקפיא במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפני השימוש בבלוק לחיתוך. פרוטוקול זה היה אופטימיזציה על ידי אורגנואידים מעיים מתמר הראשון עם וקטורים lentiviral מקושר GFP.
ה- GFP הודמיין בכל שלב בהתפתחות האורגנואידית, כולל בשלב מוקדם כאשר תאי קריפטה מתארגנים במבנים דמויי ציסטה או בנקודות זמן מאוחרות יותר כאשר אורגנואידים יוצרים ניצנים. אורגנואידים מעיים שהתמר בהצלחה היו אז פורמלין קבוע, cryosectioned, ונותחו על ידי הדמיה immunofluorescence. בתמונה זו, הגרעינים מוכתמים בכחול, והירוק מציין מולקולות הידבקות בתא האפיתל, אשר מתמתן גבולות התא.
האדום מציין כתמי ליסום לזיהוי תאי Paneth. לאחר השליטה, אורגנואידים מתמר יכול להתבצע בערך שלוש שעות, אורגנואידים crysection הטבעה יכול להיעשות בערך 2 1/2 שעות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבוד על קרח בעת טיפול רייגנטים מטריצת מרתף.
לאחר השלמת הליך זה, ניתוח immunofluorescent ושיטות אחרות כדי לזהות חלבונים או organelles יכול להתבצע כדי להעריך לוקליזציה או שפע יחסי. טכניקה זו סוללת את הדרכים עבור חוקרים לחקור ביולוגיה נורמלית מצבי מחלות במבחנה וגם עבור מחקרים vivo אם אורגנואידים מתומרים או תאים ניתן להשתיל לתוך עכברים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך להשתמש וירוסים המסומנים מגנטית כדי להנדס גנטית אורגנואידים עבור cryosectioning.
אנא אל תשכח כי עבודה עם וירוסים יכול להיות מסוכן מאוד, ואמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן מתאים תמיד צריך להתבצע בעת ביצוע הליך זה.
