This work was supported by the British Heart Foundation, project grant PG/13/69/30454.

עבודה Animal הוסמכה ואושרה על ידי ועדת הבדיקה אוניברסיטת אתיקה ניוקאסל. כל הנהלים בבעלי החיים בוצעו העומדים לפי ההדרכה של הדירקטיבה 2010/63 / איחוד האירופי הפרלמנט האירופי על ההגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות. 1. מינהל edu <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים edu תמיסת מלח סטרילית (0.9% w / v) בריכוז סופי של 12.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את הפתרון 40 ° C ו מערבולת כדי להתמוסס לחלוטין. אחסן מספיק edu / מלוחים ב 4 ° C להזריק כל העכברים במחקר המאפשר 6 זריקות יומיות. הערה: בדרך כלל מעל 6 עכברים נדרשים עבור כל קבוצת ניסוי. עם זאת, חישובי כוח יש לבצע מחקרים עצמאיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול עכברים בודדים. חשב את נפח נדרש לנהל 100 מיקרוגרם / גרם של פתרון edu / מלוחים כל עכבר (8 μl של פתרון המניות edu לכל גרם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את volum המתאיםדואר של edu / מלוחים לתוך מזרק אינסולין עם מחט 25 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הזרקה (IP) זריקות תוך טיפול בעכברים באמצעות טכניקות משרד הפנים אישר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח עכבר על מכסה הכלוב. משוך בעדינות בחזרה על בסיס הזנב בתקיפות לתפוס את העכבר על ידי בעורפו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הבטן להזרקה על ידי החזקת העכבר עם האצבע המורה והאגודל סמוך לבסיס של הראש להטות את הראש של החיה לאחור לכיוון הרצפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את הבטן עם פתרון אלכוהול 70%. אתר את קו האמצע של בעלי החיים ברבע ימני תחתון. להזריק את פתרון edu / המלוח לתוך החיה לתוך ברבע הימני התחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק עכברים עם פתרון edu / מלוח ולהקליט את הזמן של היום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.2 כדי 1.4 הזמני של יום, במשך 6 ימים רצופים. הערה: כפקד שלילי edu נדרש להגדיר את gating עבור ניתוח התזרים cytometric, להזריק בעידן נוסף, מגדר בניסוי ההתאמהעכבר ed עם נפח שווה של תמיסת מלח ללא edu. זה יספק את השליטה הנדרשת (אין שליטה edu). שליטה זו יש לכלול עבור כל מחקר כדי לאפשר וריאציות בקבוצות של ריאגנטים cytometer להגדיר. </li></ol> 2. לבבות קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגיל 24 שעות לאחר הזרקת 6 th edu, להקריב בעכברים באמצעות פריקת צוואר רחם (או לוח זמנים חלופי 1 ביתי אשר שיטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חיה להקריב בתנוחה אופקית ולעשות חתך בעור מהבטן באמצע כדי הסרעפת עם מספריים כירורגיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הסרעפת, והחזקה של עצם החזה משם מחלל הגוף, לחתוך בילטרלי כדי לחשוף את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את הלב מעט וחותכים את כלי הדם הגדולים של דרכי יצוא לנתח את הלב מתוך חלל בית החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד למקם כל הלב כדי צינור צנטריפוגות בודדות 15 מ&quot;ל המכיל 10 מ&quot;ל PBS מקורר עד 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר לבבות ספarate 10 ס&quot;מ צלחות פטרי, באמצעות אזמל לחתוך כל הלב בשני בכיוון sagittal ולשטוף את הלב על ידי כיווץ בעדינות עם זוג מלקחיים. ואז להחליף את PBS להסיר דם רב ככל האפשר. חזור על פעולה זו פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את שני החלקים של כל לב לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר אותו אדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לשלב 3 או לחילופין דגימות חנות -80 ° C כמפורט צעדים 2.9 ו 2.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 25 G, לעשות חור קטן במכסה צינור microcentrifuge כדי למנוע את המכסה מעל הפתיחה בשל הרחבת גזי כשהלב מעובד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל כל צינור microcentrifuge ומניחים במיכל חנקן נוזלי להקפיא. </li></ol> 3. גרעיני דיסוציאציה ו Cardiomyocyte תיוג גרעינים הערה: תיוג גרעיני דיסוציאציה cardiomyocyte גרעינים זה מותאם מזו של ברגמן ואחות &#39;11 בצע נוהל זה על כל הדגימות מוזרקות.עם edu ו מלוחים מוזרק (אין שליטה edu) כביקורת שלילית. ראה טבלה מס &#39;1 על המתכון של הפתרונות הנדרשים כדי לבצע שלבים אלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל הלב כדי להיות מנותח, להציב 36 מ&quot;ל של 1% BSA / פתרון PBS לתוך צינור ultracentrifuge, דגירה במשך 30 דקות, להשליך את הפתרון ולאחר מכן ולאפשר לאוויר יבש. הערה: צינור זה משמש בשלב 3.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים לבבות קפואים הפרט על צלחת 10 מ&quot;מ על הקרח ופשטי- באמצעות אזמל המאפשר את ליבם להפשיר במהלך תהליך מתייפייף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים לבבות טחון לתוך 15 מ&quot;ל של תא הצפת תמוגה בתוך שפופרת 50 צנטריפוגות מ&quot;ל ו homogenize עם homogenizer החללית במשך 15 שניות ב -25,000 סל&quot;ד בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 מיליליטר נוסף של תא הצפת תמוגה אל הצינור צנטריפוגה ומעביר 40 מיליליטר dounce עם עלי אישור גדול. בצעו 10 משיכות עם העלי ולסנן דרך 100 מיקרומטר אז 40 מיקרומטר תא מסננת לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 10 דק &#39;t 700 XG ב 4 ° C ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה הגרעיני 25 מיליליטר של תמיסת סוכרוז שיפוע שכבה בגרעיני התאים המכילים פתרון על גבי 10 מיליליטר של תמיסת סוכרוז שיפוע טריה בצינור ultracentrifuge הערוך 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 13,000 XG במשך שעה 1 ב 4 ° C באמצעות הרוטור צינור ונדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, לבטל את supernatant ו resuspend גלולה גרעינים ב -1,300 μl של חיץ אחסון הגרעינים צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge ותווית PCM1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 300 μl של ההשעיה לצינור microcentrifuge חדש ולהוסיף 700 μl של חיץ אחסון גרעינים טריים. לייבל הצינור הזה כשליטה ISO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אנטי PCM1 בריכוז סופי של 8 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אל הצינור microcentrifuge שכותרתו PCM1 ולהוסיף נוגדנים לשלוט אלוטיפ הארנב IgG בריכוז של 8 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אל הצינור microcentrifuge שכותרתו שליטה ISO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. בעקבות incubation, צנטריפוגות ב XG 700 במשך 10 דקות, לבטל את supernatant, להחליף עם 1 מ&quot;ל של חיץ אחסון גרעינים טריים, גלולה ו צנטריפוגות שוב במשך 10 דקות ב g 700 x. בטל supernatant ולהחליף עם 1 מ&quot;ל של חיץ אחסון גרעינים טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של F (ab &#39;) 2 שבר IgG נגד ארנב עיזים (H + L) נוגדנים (FITC או צבע ירוק ניאון שווה ערך) כדי להשיג ריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל. הערה: שימוש F (ab &#39;) 2 נוגדן שבר מקטין את פוטנציאל התיוג הלא ספציפי של תאים חיסוניים כולל מקרופאגים ותאי B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות לעטוף בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור דגירה במשך שעה 1 ב 4 ° C.. </li></ol> 4. איתור של edu התאגדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל 10x מרוכז תגובת edu חיץ 1:10 עם מים ללא יונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה PCM-1 ו השעיות גרעינים שכותרתו שליטה ISO ב 700 XG במשך 10 דקות, לבטל את supernatant ו resuspend גלולה גרעינים ב 1 מ&quot;ל של1% BSA / פתרון PBS. שטוף את כדור הגרעינים פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפה של דבר, לבטל את supernatant ולהחליף עם 100 μl של מקבע edu. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלישת צינורות בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את דגימות פעמיים עם 1 מ&quot;ל של 1% BSA / פתרון PBS, צנטריפוגות ב XG 700 ו דגירה עם פתרון permeabilization מבוססי saponin 1x בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קוקטייל תיוג edu 1x (טבלה 2). מינימום של 2 תגובות יידרשו לכלול את כל שליטה edu. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של קוקטייל תיוג 1x edu ישירות מדגם המכיל גרעינים כבר 100 μl של פתרון permeabilization מבוססי saponin 1x דגירה בטמפרטורת החדר המוגן מן האור למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 700 ו resuspend ב 1 מ&quot;ל של 1% BSA / PBS וחזור על שלב זה עוד פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 700 XG, להשליך supernatant ולהחליף עם 400 μl של פתרון מכתים DNA (ראה טבלה של חומרים). </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם של המגיב </td></tr><tr><td> 1. תא הצפת תמוגה </td></tr><tr><td> 0.32 M סוכרוז </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;מ CaCl 2 </td></tr><tr><td> 5 אצטט מגנזיום מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 2.0 mM EDTA </td></tr><tr><td> 0.5 מ&quot;מ EGTA </td></tr><tr><td> 1 מ&quot;מ DTT </td></tr><tr><td> 2.Sucrose Gradient פתרון </td></tr><tr><td> 2.1 M סוכרוז </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 אצטט מגנזיום מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 1 מ&quot;מ DTT </td></tr><tr><td> 3. למאגר אחסון גרעינים (NSB) </td></tr><tr><td> 0.44 M סוכרוז </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) </td></tr><tr><td> 70 מ&quot;מ KCl </td></tr><tr><td> 10 מ&quot;מ MgCl 2 </td></tr><tr><td> 1.5 מ&quot;מ spermine </td></tr></tbody></table> טבלת 1: מרכיבי חיץ גרעיני בידוד מתכון לכל החוצצים המופיעים בפסקה פרוטוקול 3 (דיסוציאציה גרעינים וסימון גרעיני cardiomyocyte).. ניתוח 5. תזרים Cytometric הערה: בצע זרימת cytometry על גרעינים מבודדים כפי שתואר לעיל 7,11,15. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, ליצור עלילה המתאר פיזור קדימה (FSC) ואת הצד פיזור (SSC) כדי לאפשר אפליית גרעינים מן ההריסות (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור העלילה להפלות גרעינים יחיד מתוך אגרגטים (תרשים 2B) על ידי התוויית 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole) (DAPI) אזור (3-405 / 450/50-א) לעומת גובה (33-405 / 450 / 50-H). ודא thaך * 3-405 / 450/50-אות נאסף על בקנה מידה ליניארי לאפשר קביעה נכונה של תוכן DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור עלילה המתארת ​​488/535/30 א &#39;(PCM-1) לעומת SSC ולהציג אירועים בלבד משער הגופייה שנוצר 5.2 כדי להעריך ביטוי PCM-1 באוכלוסיית הגופייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מדגם שליטת אלוטיפ כדי להקים שער חיובי PCM-1 (איור 2 ג). הפעל כמות קטנה של PCM1 שכותרתו מדגם לאמת את PCM1 להביע עמדה האוכלוסייה gating. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור עלילה המתארת ​​SSC-A vs 405/450/50-A (כדי לזהות DAPI). בחלקה זו, תצוגת גופייה רק ​​גרעינים להביע PCM1, באמצעות השערים שנוצרו 5.3. השתמש עלילה זה כדי ליצור שער hierarchal נוסף המכיל רק 2N גרעינים (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור עלילה המתאר 488/535/30 א לעומת 1-633 / 660/20-א &#39;עד תאפשר זיהוי של תיוג edu של PCM1 להביע האוכלוסייה cardiomyocyte. הצגת גרעינים רק שהוא גופייה, P<html> CM1 + ו- 2N באמצעות gating לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם לב לברוח אין שליטת edu כדי להגדיר את השער החיובי edu (האיור 2E). צור את השער המתאים תאי EDU +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גופיית שיא ולכמת, להביע 1 PCM, גרעיני 2N כי שלבו edu. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב אוכלוסייה זו כאחוז הגופייה הכוללת, גרעיני PCM1 +. זה יספק את שיעור דור גרעינים-cardiomyocyte ניאו, בתקופת דופק 7 יום edu, כאחוז גרעיני cardiomyocyte הכולל. הערה: כפי DAPI מחייב DNA הוא stoichiometric את עוצמת הקרינה היא יחסי לכמות של DNA. לקבוע ploidy מבוסס על עוצמת 405/450/50-אות, כפי שתואר לעיל 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את ploidy בתוך האוכלוסייה cardiomyocyte הכולל להשתמש העלילה הוקמה בשנת 5.5 ואסטרטגיה gating מבוסס על DNA ריכוז 7. </li></ol>/files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2:. Gating אסטרטגיה לכמת cardiomyocyte edu התאגדות ploidy (א) גרעינים מופלים מן ההריסות מבוססות על פיזור קדימה (FSC) ולפזר בצד (SSC). (ב) שער ליניארי נוצר אוכלוסיית גרעיני הגופייה מזוהית מבוססים על תיוג DAPI וגובה 405/450/50 vs אות אזור. (C) gating פלורסנט מאפשר הפרדת הגרעינים cardiomyocyte (PCM-1-חיובי) ו-cardiomyocyte הלא (PCM-1-שלילי) גרעינים מרקמות הלב. Intensity (D) של האות DAPI משמש כדי לקבוע ריכוז דנ&quot;א ploidy גרעינים ובכך האוכלוסייה cardiomyocyte PCM1 +. בשנת העכבר&gt; 80% של גרעיני cardiomyocyte הם דיפלואידי (2n). (E) gating פלורסנט מאפשר הפרדת 2N, גרעינים cardiomyocyte אשר שילבו edu (PCM + / EDU + = 0.9%) מ 2N, cardiomyocytes אשר לא שולבו edu (PCM + חינוכיות). כל הצעדים מפורטים בפרוטוקול 5.0. בדוגמה המוצגת מן MDX -. / עכברים y על רקע C57 / BL10 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53979/53979fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<ol>
	<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans.">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324, 98-102 (2009).</li><li>Senyo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+heart+renewal+by+pre-existing+cardiomyocytes.">Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes.</a> Nature. 493, 433-436 (2013).</li><li>Soonpaa, M. H., Rubart, M., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+measuring+cardiomyocyte+renewal.">Challenges measuring cardiomyocyte renewal.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 799-803 (2013).</li><li>Loffredo, F. S., Steinhauser, M. L., Gannon, J., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+cell+therapy+stimulates+endogenous+cardiomyocyte+progenitors+and+promotes+cardiac+repair.">Bone marrow-derived cell therapy stimulates endogenous cardiomyocyte progenitors and promotes cardiac repair.</a> Cell Stem Cell. 8, 389-398 (2011).</li><li>Malliaras, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+proliferation+and+progenitor+cell+recruitment+underlie+therapeutic+regeneration+after+myocardial+infarction+in+the+adult+mouse+heart.">Cardiomyocyte proliferation and progenitor cell recruitment underlie therapeutic regeneration after myocardial infarction in the adult mouse heart.</a> EMBO Mol Med. 5, 191-209 (2013).</li><li>Hsieh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+from+a+genetic+fate-mapping+study+that+stem+cells+refresh+adult+mammalian+cardiomyocytes+after+injury.">Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury.</a> Nat Med. 13, 970-974 (2007).</li><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cardiomyocyte+nuclei+and+assessment+of+ploidy+for+the+analysis+of+cell+turnover.">Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover.</a> Exp Cell Res. 317, 188-194 (2011).</li><li>Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+content,+ploidy+level+and+number+of+nuclei+in+the+human+heart+after+myocardial+infarction.">DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction.</a> Cardiovasc Res. 36, 45-51 (1997).</li><li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ki-67+protein:+from+the+known+and+the+unknown.">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> J Cell Physiol. 182, 311-322 (2000).</li><li>Carmena, M., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+geography+of+aurora+kinases.">The cellular geography of aurora kinases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 842-854 (2003).</li><li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Cardiomyocyte+Nuclei+from+Post-mortem+Tissue.">Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue.</a> J. Vis. Exp. , e4205 (2012).</li><li>Gilsbach, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+methylation+orchestrates+cardiomyocyte+development,+maturation+and+disease.">Dynamic DNA methylation orchestrates cardiomyocyte development, maturation and disease.</a> Nat Commun. 5, 5288 (2014).</li><li>Richardson, G., Laval, S., Owens, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+regeneration+in+the+mdx+mouse+model+of+non-ischemic+cardiomyopathy.">Cardiomyocyte regeneration in the mdx mouse model of non-ischemic cardiomyopathy.</a> Stem Cells Dev. , (2015).</li><li>Jiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+of+Bmp4+in+the+atrioventricular+septation+of+the+mouse+heart.">An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart.</a> Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).</li><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+renewal+in+humans.">Cardiomyocyte renewal in humans.</a> Circ Res. 110, e17-e18 (2012).</li><li>Prigge, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+double-fluorescent+reporter+for+in+vivo+and+ex+vivo+analyses+of+biological+transitions+in+mouse+nuclei.">Nuclear double-fluorescent reporter for in vivo and ex vivo analyses of biological transitions in mouse nuclei.</a> Mamm Genome. , (2013).</li><li>Naqvi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proliferative+burst+during+preadolescence+establishes+the+final+cardiomyocyte+number.">A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number.</a> Cell. 157, 795-807 (2014).</li><li>Liu, Z., Yue, S., Chen, X., Kubin, T., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cardiomyocyte+polyploidy+and+multinucleation+by+CyclinG1.">Regulation of cardiomyocyte polyploidy and multinucleation by CyclinG1.</a> Circ Res. 106, 1498-1506 (2010).</li><li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart.">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 298, C1603-C1609 (2010).</li><li>Kajstura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocyte+turnover+in+the+aging+human+heart.">Myocyte turnover in the aging human heart.</a> Circ Res. 107, 1374-1386 (2010).</li><li>Kajstura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyogenesis+in+the+adult+human+heart.">Cardiomyogenesis in the adult human heart.</a> Circ Res. 107, 305-315 (2010).</li><li>Walsh, S., Ponten, A., Fleischmann, B. K., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+cell+cycle+control+and+growth+estimation+in+vivo--an+analysis+based+on+cardiomyocyte+nuclei.">Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation in vivo--an analysis based on cardiomyocyte nuclei.</a> Cardiovasc Res. 86, 365-373 (2010).</li><li>Anversa, P., Leri, A., Kajstura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration.">Cardiac regeneration.</a> J Am Coll Cardiol. 47, 1769-1776 (2006).</li><li>Gonzalez-Valdes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+limits+dilated+cardiomyopathy+and+heart+failure+by+inhibiting+cardiac+senescence.">Bmi1 limits dilated cardiomyopathy and heart failure by inhibiting cardiac senescence.</a> Nat Commun. 6, 6473 (2015).</li><li>Kimura, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+fate+mapping+identifies+cycling+cardiomyocytes+in+the+adult+heart.">Hypoxia fate mapping identifies cycling cardiomyocytes in the adult heart.</a> Nature. 523, 226-230 (2015).</li><li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts.">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am J Physiol. 272, H220-H226 (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כדי לכמת במדויק מחזור cardiomyocyte מבחני התחדשות יש להבחין בין הדור cardiomyocyte נכון וחילוק DNA פרודוקטיבי. מחקרים רבים ממשיכים פשוט להתעלם אירועים בלתי יצרניים אלה, לכימות התפשטות cardiomyocyte אך ורק דרך הביטוי של נִיעוּת cyclin וסמני מחזור התא. עד כה שיטה אחת המאפשרת הכימות המדויק של מחזור cardiomyocyte תוך פיקוח על אירועים בלתי יצרניים אלה נשאר מרומז. בפרט הוא נשאר קשה להסביר polyploidization cardiomyocyte התורמת עד ~ 65% של שכפול הדנ&quot;א cardiomyocyte 13. לכן כדי לסייע כימות המדויק של דור cardiomyocyte פתחנו פרוטוקול המאפשר כימותים החזקים של שיעורי גרעיני ניאו cardiomyocyte תוך הדרת שכפול הדנ&quot;א שתוצאתו ploidy המוגברת. למרות בפרוטוקול זה לא יכול אפליה בין סוגים הניאו-cardiomyocytetion ו cardiomyocyte דו-התגרענות, ניתן להשתמש בו במהירות ובאופן מדויק לחשב את הגבול העליון (והיוו ploidy) של הדור cardiomyocyte. פרוטוקול זה ולכן מספק כלי הקרנה להעריך שינויים אפשריים בשיעורי דור cardiomyocyte ו polyploidization במודלי מחלה או להעריך את היעילות הפוטנציאלית של רפויים. לאחר שינויים בשער של דור גרעינים-cardiomyocyte ניאו מזוהה באמצעות פרוטוקול זה מחקרים מאוחרים יותר ניתן להשתמש כדי לבדוק אם זה עקב שינויים דורות cardiomyocyte של מספר התגרענות cardiomyocyte, כפי שתוארו לעיל 2,13,17,18. אלה כוללים את שימוש דינמיקת התגרענות cardiomyocyte כימות היסטולוגית בתקופת הדופק או מנתח סעיפי רקמות המתקבל חי פעמיו edu כדי להשוות התאגדות edu באוכלוסיות cardiomyocyte mononucleated ו multinucleated. בשל הרמות הנמוכות של מחזור cardiomyocyte זהפרוטוקול עושה שימוש זריקות מרובות של edu פני תקופה של 7 ימים. זה גם מאפשר &quot;רודף&quot; של כל מקורות הסלולר הפוטנציאל של דור cardiomyocyte ומתיר כימות של דור גרעיני cardiomyocyte המצטבר במשך פרק זמן זה. בהתאם המחקר, זמן זה עשוי להיות מותאם כדי להתאים את הרמות החזויות של דור cardiomyocyte. עבור כימות מדויק ההתאגדות edu בגרעינים cardiomyocyte, קיים הכרח כי אין תיוג הלא ספציפית של גרעינים עם נוגדנים משני המשמשים לאיתור תגובתיות PCM-1. לכן יהיה זה נבון לבצע ניסויי טיטרציה נוגדנים משני נוספים על מנת לייעל את ההיבט הזה של הפרוטוקול, במיוחד אם נוגדנים משני חוץ מזה הציעו בפרוטוקול זה הוא לשמש. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בביטוי PCM-1 לזהות גרעיני cardiomyocyte. אמנם זה מהווה סמן cardiomyocyte הוקמה, סמנים חלופיים שניתן להשתמש בהם כדי לאמתנתונים; אלה כוללים נוגדנים ספציפיים עבור לב Troponin T אשר זוהה בחלקו מקומי גרעיני cardiomyocyte 1. בדומה לכך, חלבונים מקומיים גרעיניים חלופיים ניתן להשתמש כדי לזהות ולכמת התאגדות edu באוכלוסיות גרעינים אחרות מזה של cardiomyocytes. חשוב כי כל הגרעינים cardiomyocyte כי עוברים פעיל מיטוזה מודרים מן הניתוח, כמו גורלם של סינתזת ה- DNA הזה אינו ידוע ועלול לגרום גם חלוקת התא או ploidy מוגברת. PCM1 הוא מפורק בשלב M של מחזור התא ולכן cardiomyocytes שעברו מיטוזה לא יזוהה על ידי ביטוי PCM1. בנוסף, כל הגרעינים בשלב S של מחזור התא צריך להיות מחוץ לניתוח שלאחר מכן. זו יכולה להיות מושגת על ידי gating את כל הגרעינים בעוצמה DAPI מעל האוכלוסייה 2N כולל אלה עם עוצמת DAPI בין 2N ו 4N אוכלוסיות. למרות זאת הוא יותר ויותרקיבל שהלב את היכולת להחליף cardiomyocytes במהלך הזדקנות נורמלית לבין פגיעה חריפה הבאה, את המקור ואת מידת הפוטנציאל הזה נשאר שנוי במחלוקת. בנוסף, שיעורים מפורד ממחזור cardiomyocyte דווחו 1,7,20-22. זה עשוי להיות בין השאר בשל קשיים טכניים לאתר במדויק וכימות הדור הניאו-cardiomyocyte 19. עד כה רוב המחקרים התבססו רק על השימוש בניתוח היסטולוגית והזיהוי של cardiomyocytes באמצעות ביטוי של חלבונים cytoplasmic, כולל חלבונים של sarcomere, כימות של מחזור cardiomyocyte והתחדשות 2,4,23,24. השימוש בשיטות אלה כדי לזהות את הביטוי של סמני התפשטות, או כפי שהודגם כאן, השילוב של אנלוגים thymidine יכול לגרום בקלות מזיהוי השגויה של סוגי תאים לבביים אחרים כמו cardiomyocytes. בעוד השימוש הדמיה confocal 3D יכול לעזור כדי להקל על בעיות אלה השיטות אסה יקרות זמן רב. מעניין לציין, כי הפרוטוקול המתואר כאן מדגים הדור גרעינים-cardiomyocyte ניאו מתרחשת בקצב של 0.17% בשבוע. זה עולה בקנה אחד עם זרימת אחרים cytometry מחקרים המבוססים הוכחת שיעורי תחלופה שבועית של עד 0.13% 5. למרות שזה מפתה להסיק שיעורי מחזור שנתיים על פי נתונים אלו, כמו במחקרים קודמים 2,5,25,26, זו אינה מתאימה כמו ושיעור העזיבה הם דינמיים במהלך זמן חיים של חיה 13. לשיטה זו מספר היישומים הפוטנציאליים כוללים בחינה של הרפוי הפוטנציאלי כדי לשפר התחדשות cardiomyocyte או שבדק את ההשפעה של מחלת לב על מחזור cardiomyocyte ושיעורי polyploidization cardiomyocyte.

בשנים האחרונות חלה ולראיות תיגר על ההנחה כי הלב הוא איבר 1,2 הבדיל סופני, שלאחר mitotic. עם זאת, כימות של מחזור cardiomyocyte והתחדשות נותרת מאתגרת. הקשיים בזיהוי דור cardiomyocyte נדיר במדויק תוך שימוש בטכניקות immunohistochemical סטנדרטיים גם מדווחים 3. בנוסף, מקור הסלולר של דור cardiomyocyte נשאר לא ברור עם ראיות לתרומות על ידי התפשטות cardiomyocyte וכן התמיינות תאי גזע 4-6. לכן, שימוש במודלים התחקות השושלת אשר דורשים ידע של פנוטיפ cardiomyocyte אבי הוא בלתי אפשרי וכימות של התפשטות מאוכלוסיה אחת, כולל שריר הלב, אינו ראוי. יתר על כן cardiomyocyte יש פוטנציאל endoreplication ללא karyokinesis (וכתוצאה מכך המכונית polyploiddiomyocyte) או karyokinesis בהעדר cytokinesis (וכתוצאה מכך cardiomyocyte binucleated) 7,8. כימות מדויק של מחזור cardiomyocyte תלויה ביכולת להבחין בינם ובין הדור הניאו-cardiomyocyte נכון. זה יוצר סיבוכים ייחודיים משום שכפול הדנ&quot;א וביטוי של קינאזות תלויות ציקלין ב cardiomyocytes לא בלעדי להפגין חלוקת תא נכון 9,10. כדי לסייע כימות של הדור הניאו-cardiomyocyte, יש לנו בשילוב טכניקה בידוד גרעינים הוקמה, וסימון אימונולוגיים של pericentriolar חומר 1 (PCM1) לזיהוי גרעינים cardiomyocyte כפי שתואר על ידי ברגמן et al. 7,11 עם שיטות חדשניות של טווח ארוך תיוג DNA וניתוח ploidy. PCM-1 הוא חלבון centrosome שמצטבר על פני שטח הגרעין של מיוציטים בדיל, הלא אופניים. מחקרים קודמים הראו כי נוגדנים נגדPCM-1 תווית במיוחד גרעינים cardiomyocyte 7,11 וכפי PCM1 נוצל בעבר על ידי מספר קבוצות עצמאיות לזהות 1,12,13 cardiomyocytes כזה. בנוסף, אנו הראינו כי ביטוי PCM1 מפות כדי גרעיני cardiomyocyte שכותרתו גנטית במודל העכבר המהונדס-cre TnT 14 (איור 1 משלים). הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר זיהוי המדויק ורגיש של דור גרעיני cardiomyocyte ניאו בלב העכבר, ללא קשר המקור התאי (איור 1 א &#39;וב&#39;) תוך הדרת תיוג nucleoside זמנית בשל polyploidization מהניתוח (איור 1 ג ו-ד). אמנם שיטה זו לא יכולה לשלוט על cardiomyocyte binucleation, היא מאפשרת כימות מהיר ויציב של גרעינים הניאו-cardiomyocyte אשר נדרש עבור כימות מדויק של מחזור cardiomyocyte. יתר על כן,הוא מספק כלי מיון מהירים להעריך שינויים פוטנציאליים הדינמיקה של דור cardiomyocyte. בעוד תיוג DNA בדרך כלל 5-Bromo-2&#39;-deoxyuridine (BrdU) כמו אנלוגי thymidine, פרוטוקול המתואר כאן משתמשת assay מבוסס 5 ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EDU) כפי שהוא דורש מדרגות עיבוד פחות עבור יותר מהיר דרך-לשים ואינו דורש denaturing של DNA כדי לאפשר גילוי חיסוני, מה שהופך אותו תואם פרוטוקולי immunostaining אחרים ובכך הגדיל את היישומים במורד הפוטנציאל של השיטה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig1.jpg" /> איור 1: פועם רציף עם edu תוויות הניאו-cardiomyocytes ללא קשר אבות שלהם. (א) edu הוא שולב DNA של cardiomyocytes בעת חלוקת התא. הפצת נשק באוכלוסייה cardiomyocyte יהיה Result לעלייה, או החלפה של cardiomyocytes ולכן הוא סינתזה של DNA פרודוקטיבי (תורם תחזוקה ותיקון רקמות). (ב) edu הוא שולב DNA של ובתאים לב בעת חלוקת התא. זה יישמר בתא במהלך בידול אל שושלת cardiomyocyte. התמיינות תאי גזע זה תביא גם לעלייה במספר cardiomyocytes ולכן תורמת תחזוקה ותיקון רקמות. (C) cardiomyocytes יש פוטנציאל לעבור &quot;לא פרודוקטיביים&quot; שכפול הדנ&quot;א וכתוצאה מכך ploidy cardiomyocyte גדל, אשר מזוהה עם היפרטרופיה cardiomyocyte שיפוץ שריר הלב, אך אינו מחליף cardiomyocytes האבוד. תהליך polyploidization נבדל binucleation כמו התוצאה היא cardiomyocyte עם גרעינים יחידים אשר מכיל ארבעה או יותר סטים של שני כרומוזומים הומולוגיים (&gt; 2N). (ד) בעקבות p גרעינים רציףulse, פרוטוקול זה מתאר בידוד גרעינים וזיהוי של גרעינים cardiomyocyte ידי ביטוי PCM1 לאפשר כימות של שני ploidy cardiomyocyte ושילוב edu. ביטוי PCM1 ושילוב edu זוהה באמצעות cytometry הזרימה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53979/53979fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2038">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:501px;">0.32 M sucrose</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">84100</td>
			<td style="width:1156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 mM Tris-HCl (pH = 8)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mM CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>c5086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mM magnesium acetate</td>
			<td>sigma</td>
			<td>M-5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.0 mM EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5 mM EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 mM DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">70 mM KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 mM MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mM spermine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>85590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isotype rabbit IgG- ChIP Grade</td>
			<td>abcam</td>
			<td>abc7415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit anti-PCM-1 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">HPA023374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 F(ab&#39;)2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cell strainers&#160; 70 &#956;m and 100&#956;m&#160;</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11597522, 11517532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9188-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EdU (5-ethynyl-2&#8217;-deoxyuridine)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C10634</td>
			<td>This kit inlcudes&#160; reagents required for section, EdU reaction buffer,&#160; EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CyStain DNA 2 step kit,</td>
			<td>Sysmex Partec</td>
			<td>05 5005</td>
			<td>This kit inlcudes&#160; reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Probe homogeniser e.g. TissueRuptor&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>9001273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TissueRuptor Disposable Probes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:267px;">990890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ultracentrifuge</td>
			<td>Sorvall&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Facscanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 mL, 25 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous assessment of cardiomyocyte dna synthesis and ploidy: a method to assist quantification of cardiomyocyte regeneration and turnover

למרות זאת הוא קיבל את זה בלב יש פוטנציאל מוגבל להתחדש cardiomyocytes בעקבות פציעה וכי רמות נמוכות של מחזור cardiomyocyte להתרחש במהלך הזדקנות נורמלית, כימות של אירועים אלה נותר מאתגר. מדובר בין השאר בשל הנדירות של תהליך והעובדה מקורות תאיים רבים לתרום תחזוקה שריר הלב. יתר על כן, שכפול ה- DNA בתוך cardiomyocytes לעתים קרובות מוביל cardiomyocyte polyploid ורק לעיתים רחוקות מוביל cardiomyocytes חדש על ידי חטיבת הסלולר. כדי לכמת במדויק אפליה מחזור cardiomyocyte בין תהליכים אלה היא חיונית. הפרוטוקול המתואר כאן מעסיקה תיוג nucleoside לטווח ארוך כדי לתייג כל הגרעינים שהתעוררו כתוצאה גרעינים שכפול דנ&quot;א cardiomyocyte מזוהה על ידי ניצול בידוד הגרעינים ואת immunolabeling PCM1 שלאחר מכן. יחד זה מאפשר זיהוי מדויק ורגיש של תיוג nucleoside של גardiomyocyte אוכלוסיית גרעינים. יתר על כן, 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole תיוג וניתוח ploidy גרעינים, מאפשרת אפליה של גרעינים הניאו-cardiomyocyte מגרעינים אשר שילבו nucleoside במהלך polyploidization. אמנם שיטה זו לא יכולה לשלוט על cardiomyocyte binucleation, היא מאפשרת כימות מהיר ויציב של גרעינים הניאו-cardiomyocyte תוך התחשבות polyploidization. לשיטה זו מספר היישומים במורד זרם כוללים בחינה של הרפוי הפוטנציאלי כדי לשפר התחדשות cardiomyocyte או שבדק את ההשפעה של מחלת לב על מחזור cardiomyocyte ו ploidy. טכניקה זו היא גם תואמת עם טכניקות immunohistological במורד נוספות, המאפשרות כימותי התאגדות nucleoside בכל סוגי תאי הלב.

שיטה זו מאפשרת כימות של התאגדות edu מוגברת בשל חלוקת גרעיני cardiomyocyte תוך פיקוח על polyploidization המוגברת. באמצעות assay מבוסס BrdU, הראינו בעבר כי הלב יונקים מגיב לאובדן cardiomyocyte כרונית, במודל עכבר MDX של ניוון שרירים דושן, עם התחדשות של שריר הלב החדש. השתמשנו בשיטות המתוארות כאן כדי להמשיך ולאמת את הממצאים שלנו שפורסמו וכדי להדגים את התועלת של הפרוטוקול. על פי הפרוטוקול המתואר; מבוגר (12 בן שבוע) עכברי bl10 MDX ושליטה היו פעמו עם זריקה יומית אחת edu למשך 7 ימים, שדווח בעבר כדי לאפשר ניתוח סטטי בין 5,13 קבוצות ניסוי. ניתוח immunohistological הלבבות פעמו מדגים את הנוכחות של PCM1 להביע cardiomyocytes אשר שילבו edu (איור 3 א). עם זאת, הנתונים שהתקבלו usinיכול להתפרש שלא כהלכה גרם שיטות immunohistological, כמו סוגי תאים אחרים אשר שילבו edu ניתן בטעות כמפר cardiomyocytes. דוגמה לכך באה לידי ביטוי משלים איור 1 א &#39;וב&#39;. זאת ועוד שיטות immunohistological אינן מבחינות polyploidization מחלוקה גרעינית. תזרים cytometry הניתוח המפורט בפרוטוקול זה מאפשר הכימות המהיר של חטיבה הגרעינית cardiomyocyte בעכברי MDX ובקרה, תוך הדרת תאים אשר שלבו edu בשל polyploidization. בדומה נתונים שפורסמו בעבר 13, ניתוח הראה עלייה בשיעורי דור גרעינים הניא-cardiomyocyte בלבבות עכבר MDX לעומת גיל מתאים שולטים (1.2% לעומת 0.17%; איור 3 ו- C). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig3.jpg" /> איור 3: </strong&gt; כימות edu שכותרתו cardiomyocytes ב wildtype ולבבות MDX. (א) תמונה של תחזיות מחסנית Z שנלקחו 40 מיקרומטר חלקים עבים של לבבות MDX. PCM-1 גרעיני cardiomyocyte להביע (ירוק) אשר מאגד edu (אדום). החץ הצהוב מצביע edu שכותרתו cardiomyocytes. I ו- II מציין הפרט edu שכותרתו cardiomyocytes שמוצג מטוס- Z. גרעינים שכותרתו עם DAPI (כחול) (B ו- C) cytometry זרימה של גרעינים בודדים מראה מגרשים נציג 12-13 בשבוע סוג בר הישן (C57 / BL10) ועכברים MDX (MDX - / y על רקע C57 / BL10). (ב) היסטוגרמה מראה עוצמת DAPI ואפליה בין 2N ו&gt; 2N גרעינים. מגרשים (C) מראים התאגדות edu באוכלוסיית גרעיני 2N cardiomyocyte כאשר נותח כמפורט בפרוטוקול זה. עבור כל העכברים Edu היה מנוהל במשך שבוע 1 מ 12 שבועות של גיל. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53979/53979fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> איור 1 משלים:. PCM-1 הוא סמן ספציפי עבור גרעיני cardiomyocyte באמצעות הפרוטוקול המתואר גרעינים נותקו מן העכבר המהונדס הכפול המיוצר על ידי חציית TNT-cre עכברים 14 עם קו הכתב הרגיש ROSA NT / NG cre 16. בהפעלת cre העכבר וכתוצאה בשליטת Troponin T האמרגן (TNT) מוביל ביטוי בלתי הפיך של GFP עם הוא מקומי הגרעינים. גרעינים שכותרתו עם שליטת אלוטיפ (ISO) מדגים את היכולת לזהות את אוכלוסיית גרעיני cardiomyocyte להביע GFP (488/530/30-א). תיוג של גרעינים עם אנטי PCM1 (נוגדנים משני זוהו על ידי 633-660 / 20-A) מדגים את מתאם ביטוי PCM1 עם cardiomyocy להביע GFPאוכלוסיית גרעיני te. בדוגמה זו 98.8% של גרעיני cardiomyocyte כפי שהוגדרו על ידי פעילות הפרומוטר TNT, מסומנים על ידי נוגדן PCM1. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure1.tif" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת משלים איור 1.</a> איור 2 משלים:. אתגרים לכימות חידוש cardiomyocyte ידי טכניקות immunohistological (א) תמונה 2D מציגה שני PCM-1 גרעינים להביע cardiomyocyte (ירוק) אשר נראה להיות מתויג גם עבור edu (אדום). חצים צהובים עולים מה שנראה cardiomyocytes אשר שלב edu. זאת בשל את שיתוף לוקליזציה לכאורה הביטוי PCM1 וסימון edu כאשר דמיינו באמצעות הדמיה 2-מימדית. (ב) היטל 3 ממדים של תמונה זו מזהה את edu שכותרתו תאים אינם cardiomyocytes אבל הם תאים שאינם cardiomyocyte שמעל PCM1 להביע גרעיני cardiomyocyte. C57 / עכברים BL10 לאחר 12 שבועות של גיל המשמשים בניסויים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2A.tif" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד איור 2A משלים.</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2B.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת משלים איור 2B.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td rowspan="2"> מרכיבי תגובה </td><td colspan="2"> מספר התגובות </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 875 μl </td><td> 2.19 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מגן נחושת </td><td> 20 μl </td><td> 50 μl </td></tr><tr><td> יזיד picolyl צבע פלואורסצנטי </td><td> 5 μl </td><td> 12.5 μl </td></tr><tr><td> תגובה מדוללתחיץ ערוך 4.1 </td><td> 100 μl </td><td> 250 μl </td></tr><tr><td> עוצמת התגובה סה&quot;כ </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td> 2.5 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 2: edu מרכיב קוקטייל. מתכון קוקטייל תיוג edu הנדרש בפרוטוקול סעיף 4 (איתור התאגדות edu).

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover at JoVE.com

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

הערכה סימולטני של DNA Cardiomyocyte סינתזה ploidy: שיטה Assist כימות Cardiomyocyte רגנרציה מחזור

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

simultaneous-assessment-cardiomyocyte-dna-synthesis-ploidy-method-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.3K Views.  Newcastle University. Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

Video: Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.

הכנת עכברוש Oligodendrocyte ובתאי תרבויות וכימות של Oligodendrogenesis באמצעות סריקת קרינת Dual-אינפרא אדום

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used therapeutically, in the near future, to restore function to damaged organs. Nevertheless, several technical issues, including the highly invasive procedure of isolating MSCs and the inefficiency surrounding their amplification, currently hamper the potential clinical use of these therapeutic modalities. Herein, we introduce a highly efficient method for the generation of dedifferentiated fat cells (DFAT), MSC-like cells. Interestingly, DFAT cells can be differentiated into several cell types including adipogenic, osteogenic, and chondrogenic cells. Although other groups have previously presented various methods for generating DFAT cells from mature adipose tissue, our method allows us to produce DFAT cells more efficiently. In this regard, we demonstrate that DFAT culture medium (DCM), supplemented with 20% FBS, is more effective in generating DFAT cells than DMEM, supplemented with 20% FBS. Additionally, the DFAT cells produced by our cell culture method can be redifferentiated into several tissue types. As such, a very interesting and useful model for the study of tissue dedifferentiation is presented.

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

שיטה יעילה להשיג תאי Dedifferentiated שומן

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

מניפולציה ploidy של עוברי דג הזברה עם חום 2 הלם טיפול

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

אינדוקציה של התחדשות שריר שלד החריף ידי Cardiotoxin הזרקה

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

הערכה תת סוגי Cardiomyocyte בעקבות תמלול פקטור בתיווך תכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

במבחנה הבידול של גזע Mesenchymal אנושי לתוך תאים דמויי Cardiomyocyte תפקודית

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

כימית קטיעה והתחדשות של הלוע ב Planarian התיכון ונמצא Schmidtea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד Keratinocytes האנושי העיקרי של רקמת עור מבוגר

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...