Поскольку органоиды подысовывают родную структурную организацию, а также многие молекулярные особенности кишечного эпителия in vivo, этот метод позволяет изучать нормальную биологию и состояния заболеваний в лаборатории. Основным преимуществом этого метода является способность генетически инженер органоидов с использованием очень высокоэффективного подхода к трансдукции с низкой цитотоксичности, что позволяет для функциональных исследований этих генетически манипулируемых органоидов. Последствия этого метода распространяются на терапию кишечных заболеваний, потому что мы можем подвергать кишечных органоидов наркотиков и других агентов или мероприятий.
Этот метод может быть применен для изучения развития и патологических процессов в других системах, подложных органоидным культурам, таким как ткани молочной железы или для клеток, растущих в стандартных 2D условиях. Как правило, лица, новые для этого метода будет успешным с трансдукции в трудно-инженер органоидов или других клеток. Впервые у нас возникла идея этого метода, когда мы столкнулись с трудностями при трансдуцировании наших органоидов и стволовых клеток.
Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, как структурная потеря органоидов может произойти, если образцы не должным образом обработаны во время встраивания процесса в подвале матрицы для криозирования. Выращивать органоиды для вирусной трансдукции, культуры семенных органоидных клеток с 200 микролитров трансдукционной среды на колодец в 48-колодец пластины, и инкубировать в стандартной культуре тканей инкубатора. Оттепель флаконы вируса для трансдукции, что позволяет около 50 микролитров концентрированного вируса для трансдукции каждой из них в 48-хорошо пластин.
В 1,5-миллилитровой трубке смешайте вирус с 12 микролитровами раствора магнитных наночастиц и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут. Через 15 минут добавьте магнитный раствор наночастиц и вирусную смесь в клетки для индуцированных. Поместите 48-хорошо пластины на магнитной пластине, и инкубировать в стандартной культуры ткани инкубатор, по крайней мере два часа.
Когда вирусная трансфекция будет завершена, перенесите инфицированные органоидные клеточные кластеры и трансдукционную среду из каждого колодец в 1,5-миллилитровую трубку. Центрифуга по 500 раз г в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта с нежным всасыванием и охладьте трубки, содержащие гранулы на льду в течение пяти минут.
Добавьте 120 микролитров мембранной матрицы подвала к каждой трубке и повторно посовелите гранулы, медленно трубя вверх и вниз. Семенные 30-микролитровые капли матрично-клеточной смеси в новую пластину из 48 колодец. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение пяти-пяти минут, пока матрица не затвердеет.
Добавьте трансдукционную среду к каждой хорошо, и инкубировать в стандартном инкубаторе культуры тканей в течение трех-четырех дней. Через три-четыре дня проинспектировать культуры под световым микроскопом при 10-м увеличении, чтобы обеспечить организацию клеточных кластеров в органоидные структуры. Аккуратно замените трансдукционную среду в каждой хорошо с 250 микролитров органоидной культуры ENR среды.
Верните тарелку в инкубатор. Начните эту процедуру, удалив enR среды нежным всасывания, будьте осторожны, чтобы не возмущать матрицы мембраны подвала. Аккуратно промыть 500 микролитров PBS.
Исправить органоиды, добавив один микролитер 4%параформальдегид раствор на колодец, и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Через 30 минут удалите раствор параформальдегида путем всасывания. Аккуратно добавьте один микролитер PBS на колодец, а затем удалите PBS нежным всасыванием.
Таким образом, мыть дважды с PBS. Удалите PBS из второй стирки, и добавить один микролитер 30% сахарозы буфера для каждого образца. Инкубировать фиксированные органоиды в сахарозе в течение одного часа при четырех градусах по Цельсию, чтобы обезвоживать образцы.
Удалите буфер сахарозы путем всасывания, и добавить достаточно встраивания соединения для покрытия матричного слоя в каждой хорошо. Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем поместите образцы в морозильную камеру по температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение 10 минут или до тех пор, пока встраивающий соединение не станет твердым и белым.
Поместите пластину с замороженным встраиваемым соединением при комнатной температуре, чтобы обеспечить минимальное таяние соединения по краям. Используйте скальпель или шпатель, чтобы отделить блок от стенок колодеца. Работайте быстро, чтобы предотвратить таяние, используя типсы, чтобы удалить матрицу встраивания соединения блока, и поместить его в блок образца.
Заполните форму полностью с встраиванием соединения. Заморозить при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение 30 минут, прежде чем использовать блок для секций. Этот протокол был оптимизирован путем первой трансдуцирования кишечных органоидов с лентивирусными векторами, связанными с GFP.
GFP был визуализированы на каждом этапе развития органоидов, в том числе на раннем этапе, когда крипто-клетки организовать в кисты, как структуры или на более поздних точках времени, когда органоиды образуют почки. Успешно транс индуцированные кишечные органоиды были затем формалин-фиксированной, криозекции, и проанализированы с помощью иммунофлуоресценции изображений. На этом изображении ядра окрашены в синий цвет, а зеленый цвет указывает на молекулы адгезии эпителиальных клеток, которые демаркирует границы клеток.
Красный цвет указывает на лизосом окрашивание для идентификации клеток Панета. После освоения, трансдуцирования органоидов может быть выполнена примерно за три часа, и органоиды крисекции встраивания может быть сделано примерно в 2 1 / 2 часа. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы работать на льду при обработке подвала матричных реагентов.
После завершения этой процедуры, иммунофлуоресцентный анализ и другие методы для обнаружения белков или органелл могут быть выполнены для оценки локализации или относительного изобилия. Этот метод прокладывает путь для исследователей, чтобы исследовать нормальную биологию и болезни государств в пробирке, а также для виво исследований, если транс индуцированных органоидов или клеток могут быть имплантированы в мышей. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как использовать магнитно помечены вирусы генетически инженер органоидов для криозирования.
Пожалуйста, не забывайте, что работа с вирусами может быть чрезвычайно опасной, и такие меры предосторожности, как ношение соответствующего защитного снаряжения, всегда должны быть предприняты при выполнении этой процедуры.
