Work in S.M.'s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

1. ניתוק של Neurospheres ממוח העכבר למבוגרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר מבוגר (סביב 2 חודשים) ממנת יתר של isoflurane. בדוק היטב כי העכבר הפסיק נשימה לנתח מיד לאחר מותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים, לעשות חתך קו האמצע כדי לפתוח את הגולגולת. הסר את המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המוח קר PBS בצלחת 10 ס&quot;מ על הקרח. בצע את השיטה לנתיחה כל ההר להשיג את SVZ מן החדר לרוחב 48. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החדר לרוחב לתוך צינור מ&quot;ל 1.5, להוסיף 500 μL של 0.05% טריפסין-EDTA ב PBS, ו דגירה הצינור במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 15 דקות, להוסיף 500 μL של המדיום לעצור בעדינות pipet 20 - 30 פעמים עם טיפ מ&quot;ל 1. הימנע ויוצרים בועות אוויר במהלך בפיפטה. הערה: שלב זה הוא קריטי להישרדות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את התאים ב 500 XG במשך 8 דקות. בטל supernatant, להוסיף 1 מ&quot;ל של PBS, ו גלולה tהוא התאים על ידי pipetting 5x בעדינות עם קצה מ&quot;ל 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה XG ב 500 במשך 8 דקות. בטל supernatant באמצעות טיפ 1 מ&quot;ל ולהוסיף 1 מ&quot;ל של מדיום הבסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) אם פסולת הסלולר הם נצפו, עוברים התאים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים עם hemocytometer; באופן כללי, על 30,000 - 60,000 תאים / SVZ מתקבלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט התאים מן SVZ אחד לתוך צלחת 10 ס&quot;מ עם 10 מ&quot;ל של מדיום ותרבות המל&quot;ל על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) כדי למנוע היתוך בין תחומי 49, לשים 1000 תאים הבאר אחד של צלחת אולטרה-נמוכה מחייב 6-היטב, כי הוא מלא מראש עם 1.5 מ&quot;ל של מדיום ותרבות המל&quot;ל על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. הערה: לאחר 5-7 ימים, neurospheres ניתן לראות (איור 2A). תקופת culturing עשויה להיות שונה עם הגיל של עכבר או הרקע הגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2 מ&quot;ל של מדיום NSC כל 3-4 ימים כדי לשמור על התרבות(לא להסיר את המדיום הקיים). </li></ol> ניתוח 2. לחוק הכשרות דיפרנציאציה של בדיקות Neurospheres ו Ciliogenesis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את יכולת הבידול, לנתח את neurospheres בתנאים חסידים במדיום בידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר 12 מ&quot;מ עגול coverslips ידי מעוקר או עם חשיפה UV לפני השימוש. לקבלת תרבית תאים חסידה, לשים מכסת זכוכית עגולה מעוקרת 12 מ&quot;מ לתוך באר של צלחת 24-היטב בתנאים מזוהמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל זכוכית המכסה עבור 10 s עם 500 μL של 0.002% פולי- L- ליזין (PLL). לשאוב את הפתרון ולייבש אותו במשך 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של פתרון laminin (5 מיקרוגרם / μL). דגירת זכוכית הכיסוי עבור 1 ש &#39;ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את laminin ולהוסיף 500 μL של מדיום בידול או בינוני NSC (שליטה מובחנת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור assay בידול, להרים 100 - כדור מיקרומטר 200 עם טיפ 200 μL תחת מיקרוסקופ. לְהוֹסִיף5-10 neurospheres היטב בכל צלחת 24-היטב בתרבות במשך 7-10 ימים במדיום בידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח neurospheres מובחן, להוסיף 5-10 neurospheres היטב בכל צלחת 24-היטב בתרבות במשך 1-2 ימים במדיום המל&quot;ל. Neurospheres Attached להתפשט ולגדול כמו בשכבה (2B איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת בינוני בקפידה, לתקן את התאים עם 4 paraformaldehyde% (PFA) ב PBS עבור 15 דקות ב RT, ולאחר מכן לשטוף עם PBS פעמיים עבור 5 דקות ב RT. הצלחת ניתן לאחסן 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 חודשים. הערה: כדי להמחיש תאי גזע / ובתאים עצביים במדיום NSC ותאי בדיל במדיום בידול, לבצע immunostaining נגד Nestin (גזע עצבי / ובתאי סמן תא), β טובולין III (monoclonal Tuj1, סמן עצבי), GFAP (חלבון גליה fibrillary חומצי astrocyte, סמן), ולאחר O4 (סמן oligodendrocyte) (איור 2B-E). כדי לנתח את הריסים, לבצע immunostaining נגד Arl13b (CI העיקריליה סמן) ו Gpr161 (GPCR ריסי) (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר מכסה זכוכית עם פתרון הרכבה על גבי זכוכית שקופית. הטה את הכוס השקופית להסיר פתרון עודף. </li></ol> 3. ניתוח של Ciliogenesis ב Neurospheres <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח תאים neurospheres שלמים ידי immunostaining, העברת 1 מ&quot;ל של מדיום culturing המכיל neurospheres מרובים כדי צינור 1.5 מ&quot;ל ומסובב ב XG 500 עבור 8 דקות. תקן את התחומים עם 4% (PFA) לאחר ההסרה הבינונית עבור 15 דקות ולשטוף עם PBS. ספין למטה תחומי XG ב 500 במשך 8 דקות, להסיר supernatant, דגירה בתחומי O / N עם סוכרוז 30% ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant באמצעות קצה מ&quot;ל 1 ולהוסיף 500 μL של פתרון אוקטובר באמצעות קצה מ&quot;ל קיצוץ 1. חותך את קצה הקצה כדי להרחיב את הפתח, כמו אוקטובר הוא צמיג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון אוקטובר המכיל את neurospheres לתוך תבנית הקפאה פלסטיק חד פעמיות (10 מ&quot;מ x 10 מ&quot;מ x 5 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את מ &#39;הישן על קרח יבש דקות 15 לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) הפסק את הניסוי ולאחסן את התבנית במקפיא C -80 ° עד 1 שנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את החלקים עם cryostat; עובי סעיפים צריך להיות 15-30 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את הריסים העיקריים בתוך neurosphere, לבצע immunostaining נגד Arl13b (איור 4). </li></ol> תרבות Passage 4. Neurospheres ו NSCs חסיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המסדרון, neurospheres בעוד בגודל כדור הוא בין 100-200 מיקרומטר; כאשר neurospheres גדול מדי (300 מיקרומטר ומעלה), הם לא אידיאליים עבור ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת neurospheres לתוך צינור 50 מ&quot;ל באמצעות קצה מ&quot;ל 1 ומסובב ב XG 500 עבור 8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant באמצעות aspirator, להוסיף 500 μL של 0.05% טריפסין-EDTA ב PBS, דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כמות טריפסין משתנה בהתאם למספר תחומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של המדיום בסרום בעדינות צינורt 20 פעמים עם טיפ מ&quot;ל 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה XG ב 500 במשך 8 דקות. בטל supernatant באמצעות טיפ 1 מ&quot;ל ולהוסיף 1 מ&quot;ל של מדיום הבסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) אם neurospheres פסולת או undissociated הסלולר נראים, עוברים התאים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר התאים בצלחת 10 ס&quot;מ בצפיפות של 10,000 תאים / ס&quot;מ 2 במדיום המל&quot;ל; התא יהיה מוכן לקטע הבא אחרי שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) כדי להקפיא את התאים, להוסיף מקפיא בינוני לייצר 500,000 עד 1,000,000 תאים / מ&quot;ל ​​ההשעיה. להקפיא את התאים באמצעות מכולות מקפיאות-קריו; neurospheres undissociated אפשר להקפיא גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור התרבות החסידה, dillute לתאי 50,000 תאים / סנטימטר 2 על PLL- ו Laminin מצופה coverslips עם מדיום NSC, ותרבות במשך 1-2 ימים. </li></ol> 5. רעב וניתוח של צילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בינוני רעב (לוח 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1-2 ימים לאחר pl הראשוניתating של תאים חסידים לאחר ניתוק, שינוי המדיום המל&quot;ל גם אחד (שליטה) ובינוני לרעב אחר היטב (ניסוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התאים החסידים עבור 24 h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים עם 4% PFA ב PBS עבור 15 דקות ב RT ולשטוף פעמיים עם PBS עבור 5 דקות כל אחד ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) הפסק את הניסוי ולאחסן את צלחות 24-היטב עם coverslips PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פרוטוקול immunofluorescence מכתים 7, 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslips באמצעות פתרון גובר. יבש את O זכוכית שקופית / N ב RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות על מיקרוסקופ מתחם בהגדלה ההכרחית. שימוש במיקרוסקופ, מצלמה, ויעדים (40X / 1.3 נפט 63X / 1.4 נפט), הנשלט באמצעות התוכנה המלווה. קח z-סעיפים מספיק על 0.5-0.8 מיקרומטר במרווחים (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח כמותי של לוקליזציה ריסים בתאים חסידים, לרכוש ערימות של תמונות מתוך 3-8 שדות רצופים עם תאים ומחוברים ע&quot;י הסתכלות לתוך ערוץ DAPI. לכמת את מספר הריסים העיקריים באמצעות ImageJ / פיג&#39;י. בדרך כלל, להשתמש בכלי &quot;מונה Cell&quot; של תוספי ImageJ&gt; לנתח בתיבת הדו-שיח כדי לספור את התאים עם ריסי GPCR חיוביים; תחזיות מקסימליים מארובות של תמונות ניתן גם לייצא מ עוצמת תמונה ופרמטרי ניגוד דומה ImageJ / Fiji.Use עבור כל תמונות מאותו הניסוי לספירה ועניין יצוא. </li></ol> 6. Transfection של Neurospheres <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמד תאים ניתק כדי coverslips עבור 24 h. השתמש צפיפות תאים בדרך כלל בין 75,000 ו 150,000 תאים 500 μL של המל&quot;ל בינוני באר אחד של צלחת 24-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 25 μL של המדיום סרום מופחת 1.5 μL של מגיב transfection בתוך microtube 0.5 מ&quot;ל על ידי vortexing עבור 5 ים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2.5 מיקרוגרם של פלסמיד דנ&quot;א רעלן פנימי חופשית microtub 0.5 מ&quot;ל נפרדדואר המכיל 25 μL של תקשורת סרום המופחתת ומערבבים ידי vortexing עבור 5 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1 μL של מגיב transfection ל- DNA המכיל שני microtube ומערבב ידי vortexing עבור 5 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תערובת מהצינור המכילים DNA אל microtube הראשון ומערבבים ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת במשך 10-15 דקות ב RT. לאחר הדגירה, בעדינות ומוסיפים את תערובת transfection dropwise אל בארות על גבי מדיום NSC (500 μL / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי המדיום 24 h-transfection פוסט לשלוט (מדיום NSC) בינוני או בינוני רעב (500 μL / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים על ידי שינוי בינוני עד 4% PFA לאחר 24 h ולבצע immunostaining; בדרך כלל, עד יעילות transfection 10% מתקבל באמצעות פרוטוקול זה. </li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

כאן, אנו מתארים שיטה להפקה ולשמור תרבויות neurosphere מן SVZ עכבר המבוגר. כמה נקודות רלוונטיות לגבי התרבויות הן כדלקמן. ראשית, בגדלים של הספירות הם בדרך כלל בין 50 ל - 200 מיקרומטר. מניסיוננו, כאשר neurosphere מקבל גדול יותר 300 מיקרומטר קוטר, הזמן האופטימלי עבור passaging הוחמץ. תחומים גדולים אלה מכילים תאים מתים בתוך הליבה. שנית, כפי neurospheres משמשת ללמוד בתאי גזע / ובתאים עצביים, חשוב להשתמש EGF ו FGF-בסיסי (bFGF) כדי לשמור על stemness של תאים אלה. לכן, הגורמים להשרות התמיינות, כגון FBS, יש להימנע במהלך התחזוקה של neurospheres. הוכח כי 10% FBS יכול להבדיל neurospheres לתוך האסטרוציטים 47. שלישית, מידת הבידול עצבי עלולה להיות תלויה בגיל העכבר. אם אחד רצונות בידול עצבי יותר מ neurospheres, עכברים צעירים (da לאחר הלידהy 0) יכול לשמש. רביעית, אם מתחילים תרבויות חדשות, זה טוב תמיד לבחון את יכולת ההבחנה של neurospheres. החמישית, השיטה שלנו מאפשרת גם הקפאה להפשרה מתרבויות neurosphere הוקמו לשימוש הניסיון בעתיד. לאחר הפשרה, תאים בדרך כלל גדלי תאים חסידים כמו בצורת כישור ללא פולי- L- ליזין או laminin. זו עלולה להיגרם על ידי פגיעה להקפיא להפשיר את התאים. חשוב לשמור על התאים גדלו עד שהם הופכים 60 - 80% ומחוברות לפני המעבר. לאחר חלוף, התאים בדרך כלל גדלים כמו neurospheres וניתן passaged למעלה בדרך כלל 5 - 10 פעמים. Neurosphere מבוסס שיטות התרבות מאפשרות לנו ללמוד סחר ריסים ו מסלולי איתות גזע עצבי / ובתאים נוירונים בדיל. בחנו cilia העיקרי צף / neurospheres חסיד הבדיל. חשוב לרכוש z-מספר סעיפים לדמיין ריסים לאורך ההיקף המלא של neurospheres. יתר על כן, ומאחוראה יצירת תרבויות חסידות של neurospheres אלה, ולהרעיב עבור 24 h, רוב תאי ריסים (איור 5) והעשר את היתום GPCR, Gpr161. עם זאת, ממושכת רעבה של תוצאות תרבויות החסידות במבנים התת-תאי vacuolar. לפיכך, חשוב לייעל תקופות רעבות בקפידה למטרות ניסוי בפרט. נכון לעכשיו, מחקרים על ciliogenesis מבוצעים בעיקר כמה ריסים, הונצח שורות תאים 57. שורות תאים אלה אינן תמיד בנאמנות לשחזר נוירונים ותאי גזע / ובתאים עצביים בהבעת רכיבי איתות, כגון GPCRs או מכונה מסלול ששישה, מה שהופכים את זה הכרחי כדי לפתח שיטות חדשות יותר כדי ללמוד את התפקיד של ריסים בתהליכים ביולוגיים. השיטות מבוססות neurosphere המתואר כאן מאפשרות לנו ללמוד מסלולי הסלולר מוסדר ריסים, כולל GPCR איתות ששישה בהקשר של תאי גזע / ובתאים עצביים diffנוירונים erentiated.

Cilium העיקרי הוא תא התת-תאי דינמי המבוסס microtubule שמתפקד אנטנה חושית בתיאום מסלולי איתות הסלולר, כולל סוניק הקיפוד (ששש) מסלול במהלך ההתפתחות העצבית עובריים 1, 2, ו איתות התת-תאי ממודרת פונקציה 3 העצבית מבוגר, 4 . איתות רכיבים של מסלולים אלה, כגון קולטן ששש טלוא 5; מסלול מפעיל smoothened (SMO) 6; ו Gpr161 7, גידול G יתום חלבון בשילוב קולטן (GPCR) כי באופן שלילי מסדיר את מסלול ששש, למקם את הריסים באופן דינמי. GPCRs המרובה דווח למקם את הריסים בנוירונים במוח 7, 8, 9, 10 </sup&gt;, 11, 12, 13, 14, 15, 16. פגמי ריסי מסלולי איתות שנוצר ריסים להשפיע רקמות מרובות נקראים ביחד כמו ciliopathies 17, 18, 19. הספקטרום המחלה ciliopathy קרובות כולל ליקויים נוירו-התפתחותיות, כגון הפרעות craniofacial 20, 21, 22. בנוסף, cilia העיקרי בנוירונים ההיפותלמוס לווסת מסלולי שובע מרכזיים, ופגמים לגרום להשמנה מרכזית 23, שיקוף השמנת ciliopathies syndromic כגון תסמונת Bardet Biedel 24. בנוסף, קולטן ונוירופפטידים איתות הריסים מסדיר centrשובע אל מסלולי 11, 14. לוקליזציה ריסי adenylyl cyclase III (ACIII) ו GPCRs כגון קולטן סומטוסטטין 3 ב נוירונים בהיפוקמפוס לגרום למומים זיהוי האובייקט הרומן וגירעונות זיכרון 25, 26 ו- Parallels חוסר שלמות ריסי 27. היבטים התפתחותיים של איתות שנוצר הריסים קשורות בטבורן הומאוסטזיס רקמות; בפרט, הריסים חשובים להתקדמות ומדולובלסטומות ששש-תת הנובעים אבות גרגיר של 28 המוחון, 29. לפיכך, cilia העיקרי ממלא תפקידים חשובים במהלך עוברית, לאחר הלידה, ואת ההתפתחות עצבית מבוגרת ותפקוד. בתאי גזע עצביים (NSCs) מתגוררים באזור subventricular (SVZ) של החדר הלטרלי, אזור subgranular של gyrus המשוננת של ההיפוקמפוס, ואתאזור חדרית של החדר השלישי בהיפותלמוס ביונקים 30, 31, 32. NSCs הם מולטיפוטנטיים, בעלי יכולת התחדשות עצמית, והם חשובים להתפתחות המוח ורפואה רגנרטיבית 30. רוב NSCs ב SVZ הם שקטים ובעלי cilium העיקרי בודד כי, במקרים רבים, משתרע אל החדר לרוחב 33. אותות cilium העיקריים באמצעות הלוקליזציה של קולטנים שונים, להמרצת תגובה תאית במורד זרם, במיוחד ביחס ששש, TGFβ, ומסלולי טירוזין קינאז קולטן 2, 34, 35, 36. מאז cilia העיקרי להאריך לתוך החדר לרוחב, משערים כי cilia העיקרי לזהות ציטוקינים בנוזל השדרה (CSF) כדי להפעיל NSCs 37 </sעד&gt;. מחקרים אחרונים מראים כי מסלול איתות ששש ו הריסים העיקריים הם קריטיים עבור הפעלת תאי גזע של תיקון והתחדשות של רקמות מרובות, כולל אפיתל ההרחה, ריאות, כליות 38, 39, 40, 41. עם זאת, המנגנונים שבאמצעותם CSF מתקשר עם NSCs והאם cilia העיקרי מעורבים אינם ידועים. NSCs החסיד בתרבות הוא ריסים; למקם רכיבים מסלולים ששש, כגון SMO ו Gpr161 ב ריסים; והם ששישה 42 תגובה. לפיכך, NSCs יכול לשמש כמערכת מודל חשובה ללמוד את המסלול שהשישה, סחר ריסים, ומסלולי בידול עצביים. בנוסף, נוירונים נבדלים NSCs יכולים לשמש גם עבור מבחני סחר ריסים. Neurospheres הם היוו של צבירי תאי &quot;פנויות&quot; הנובעים מההפצה של neural גזע / ובתאי תאים שגדלים בנוכחות גורמי גדילה ספציפיות ומשטחי nonadhesive 43, 44. Neurospheres לשמש חשובה דגמים בתרבות במבחנה ללמוד גזע עצביים / ובתאים בפיתוח נורמלי למחלה 31, 45, 46, 47. כאן, אנו מתארים assay מבוסס-neurosphere עבור culturing גזע עצביים / ובתאים ו לבידול לתוך הנוירונים / גליה. אנחנו במיוחד להדגיש את הסחר של איתות רכיבי ריסים של גזע עצבי / ובתאים נוירונים בדיל (איור 1). בניגוד נוירונים culturing העיקרי, neurospheres העיקרי הם יחסית קל תרבות, ניתנים קטעים מרובים להקפיא להפשיר מחזורים, והוא יכול לעבור התמיינות לתוך הנוירונים / גליה. חשוב לציין, קבענו כי עצבי נגזר neurosphereתאי גזע / ובתאים נוירונים בדיל הם ריסים בתרבות LOCALIZE מולקולות איתות רלוונטיות לתפקוד ריסים בתאים אלה. Neurosphere מבוסס שיטות culturing יכולות לשמש כמערכת מודל אידיאלית ללימוד סחר ciliogenesis ואת הריסים ב NSCs נוירונים בדיל.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm round cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95 mm X 15 mm petri dish, slippable lid</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td>10 cm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arl13B, Clone N295B/66</td>
			<td>Neuromab</td>
			<td>AB_11000053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td>B27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>ST 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancrease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td>Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Vinyl Specimen Molds</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>4565</td>
			<td>10 mm X 10 mm X 5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10&#215;, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>mounting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21137</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gpr161</td>
			<td>home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>FGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>0.100 mm deep</td>
			<td>improved neubauer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0500-2</td>
			<td>Isofluorane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Nalgene&#160;</td>
			<td>5100-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td>N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF protein, CF</td>
			<td>R and D systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>EGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (10X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174-100</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COSTAR 6 Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td>ultra-low binding 6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-tubulin III</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>TUJ1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using primary neurosphere cultures to study primary cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

לאחר ציפוי התאים מן SVZ במדיום המל&quot;ל במשך שבוע, neurospheres צף נצפו (איור 2 א). הגדלים של התחום נעים בין 50 לבין 200 מיקרומטר. כדי לבחון אם הספירות היו שמקורם בתאי גזע / ובתאים עצביים, את neurospheres היה מצופה על PLL- ו Laminin מצופה coverslips במדיום NSC עבור 2 ימים. לאחר מכן הם היו immunostained נגד סמן תא גזע / ובתאים העצביים, Nestin. יומיים נדרשו כדי לאפשר את הכדורים אל לצרף את coverslips לגדול כמו בשכבה של תאים. בשכבה של תאים היתה חיובית עבור Nestin (איור 2B). כדי לבחון את יכולת ההבחנה של neurospheres, אנו מצופה מהם ביצוע השלבים המפורטים בסעיף 2 על PLL- ו Laminin מצופים coverslips במדיום בידול ללא ניתוק למשך 7-10 ימים. זה לוקח לפחות שבוע לבידול. Neurospheres מצורפת coverslips ולהרחיבאד לגדול כמו בשכבה של תאים. אנחנו תיקנו את התאים immunostained נגד נוירון, astrocyte, וסמנים oligodendrocyte. הבחנו neurospheres חסיד שהבדילו לתוך β טובולין נוירונים III-חיובי, האסטרוציטים GFAP חיובי, ו oligodendrocytes O4-חיובי (איור 2C-E). לפיכך, ניתן לגזור neurospheres מולטיפוטנטיים מן SVZ עכבר מבוגר. כדי לקבוע אם neurospheres החסיד נוירונים בדיל יש cilia העיקרי, אנו immunostained נגד Arl13b (סמן cilium העיקרי) 51 ו Gpr161 (GPCR-מקומי ריסים) 7. מניסיוננו, בעכברי מודל זמין להביע ARL13B-mCherry, ובמחקרים עם קליפת עכבר מתפתחת, רוב (אם לא כל) ריסים עצביים במוח להביע Arl13b, בעוד כל הנוירונים אינם ACIII חיובי 52, 53, 54. ה<html> הים, אנחנו בעיקר מסתמכים על Arl13b לזהות ריסים עצביים. אנחנו הבחנו cilia העיקרי ואת הלוקליזציה של Gpr161 אל הריסים של ובתאים ב neurospheres הדבק (איור 3A) ו בנוירונים בדיל (איור 3B). לפיכך, neurospheres חסיד שושלות בדיל הם ריסים בתרבות בתרגום מולקולות איתות. כדי לקבוע אם neurospheres צף יש cilia העיקרי, אנו cryosectioned neurospheres צף לאחר קיבוע, כמפורט בסעיף 3. הבחנו cilia העיקרי גזע עצביים / ובתאים התאים neurospheres מחולק (איור 4 א-ב). חשוב לרכוש z-סעיפים ברחבי neurospheres לדמיין מלא cilia העיקרי, משום שקשה לבחון את הריסים העיקריים z-מטוס בודד. לסיכום, neurospheres המובחן יש אוכלוסיות הטרוגניות של תאי ריסים ולא ריסים. : לשמור-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; כדי לנתח את ciliogenesis של תאי גזע / ובתאים עצביים, אנו ניתקים neurospheres ו מצופים בתאים על PLL- ו coverslips מצופה Laminin. לאחר culturing אותם במדיום רעב, צפינו גידול באחוז הריסים, כפי שזוהו על ידי Arl13b, לעומת אלה בתרבית בינוני NSC (% ciliation) (איור 5 א-ב). בנוסף, אנו ציינו מספר גדל של ריסי Gpr161 החיוביים על הרעבה (% ריסי Gpr161 חיובי / Arl13b חיובי cilia) (איור 5 א-ב). מעניין, במחקר קודם באמצעות שורות תאי גזע אנושיים מובחן עובריים הוכיח כי תאי גזע עובריים ממקור אנושי בתרבות גם להחזיק את השיער הראשוני 55. מספר ואורך עלייה הריסים על רעב סרום אלה שורות תאים, ואת הריסים אלה גם בעלי רכיבים של מכונות ששש. גם אנחנו טרנספקציה חסיד גזע עצביים / progenitor תאים, כמתואר בסעיף 6. בדרך כלל אנחנו הבחנו יעילות transfection של עד 10%, בדומה תרבויות נוירון העיקרי במעבדה (איור 6). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פִּתָרוֹן </td><td> רְכִיב </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> לדלל 10x PBS עם מים autoclaved </td></tr><tr><td> מדיום NSC </td><td> 2 מ&quot;ל 50x B27 </td></tr><tr><td></td><td> 1 מ&quot;ל 100x N2 </td></tr><tr><td></td><td> 1 מ&quot;ל 200 מ&quot;מ L- גלוטמין </td></tr><tr><td></td><td> 1 מ&quot;ל 100x פן / סטרפטוקוקוס </td></tr><tr><td></td><td> FGF-בסיסי (אדם bFGF) (נ&quot;ג 25 פתרון במלאי / מ&quot;ל ​​במדיום Neurobasal): 20 ng / mL או 2 סך מ&quot;ג עבור 100 מ&quot;ל התקשורת </td></tr><tr><td></td><td> EGF (פתרון במלאי 25 ng / mL בינוני Neurobasal): 20 ng / mL או 2 סך מ&quot;ג עבור 100 מ&quot;ל התקשורת </td></tr><tr><td></td><td> 95 בינוני בסיסי מיליליטר </td></tr><tr><td> FGF-יסוד האדם (האדם bFGF) </td><td> 1 בינוני הבסיסי מ&quot;ל בבקבוק מיקרוגרם מסחרי האדם bFGF 25 </td></tr><tr><td></td><td> חנות microtubes סטרילי ב- C ° -20 או נמוך. השתמש aliquot יחיד 80 μL או 2 מיקרוגרם / 100 מ&quot;ל התקשורת המל&quot;ל. </td></tr><tr><td> EGF </td><td> להוסיף 8 בינוני הבסיסי מ&quot;ל בבקבוק מיקרוגרם מסחרי EGF 20 </td></tr><tr><td></td><td> אחסן microtubes סטרילי כמו C -20 ° או נמוך. השתמש aliquot יחיד 80 מיקרוגרם / 100 מיליליטר תקשורת. </td></tr><tr><td> מדיום עצירה </td><td> 1 מ&quot;ל FBS </td></tr><tr><td></td><td> 75 U DNase אני (75 U / uL ב PBS) </td></tr><tr><td></td><td> 9 מ&quot;ל PBS </td></tr><tr><td> מדיום סרום </td><td> 1 מ&quot;ל FBS </td></tr><tr><td></td><td> בינוני 9 מ&quot;ל בסל </td></tr><tr><td> מדיום הקפאה </td><td> 4 מ&quot;ל DMSO </td></tr><tr><td></td><td> 24 בינוני בסיסי מיליליטר </td></tr><tr><html><td></td><td> 12 מ&quot;ל 30% FBS </td></tr><tr><td> בינוני בידול </td><td> 90 בינוני בסיסי מיליליטר </td></tr><tr><td></td><td> 5 מ&quot;ל 5% FBS </td></tr><tr><td></td><td> 1 מ&quot;ל 100x פן / סטרפטוקוקוס </td></tr><tr><td></td><td> 1 מ&quot;ל 200 מ&quot;מ L- גלוטמין </td></tr><tr><td></td><td> 1 מ&quot;ל 100x N2 </td></tr><tr><td></td><td> 2 מ&quot;ל 50x B27 </td></tr><tr><td></td><td> FGF-בסיסי (אדם bFGF) (פתרון במלאי של 25 ng / mL בינוני Neurobasal): 10 ng / mL או 1 הכולל מ&quot;ג עבור 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מדיום רעב </td><td> 95 בינוני בסיסי מיליליטר </td></tr><tr><td></td><td> 1 מ&quot;ל 100x פן / סטרפטוקוקוס </td></tr><tr><td></td><td> 1 מ&quot;ל 200 מ&quot;מ L- גלוטמין </td></tr><tr><td></td><td> 1 מ&quot;ל 100x N2 </td></tr><tr><td></td><td> 2 מ&quot;ל 50x B27 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: מתכון של פתרונות. ve_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55315/55315fig1.jpg" /> איור 1: תרשים סכמטי של neurosphere התרבות והתמיינות הפרוטוקולים. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55315/55315fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55315/55315fig2.jpg" /> איור 2: קיבולת בידול לתצוגות Neurospheres. (א) neurospheres נציג מוצג. (ב) Neurospheres היה מצופה על PLL- ו Laminin מצופה coverslips במדיום NSC עבור 2 ימים היו immunostained נגד Nestin (גזע עצבי / סמן תא אב). (CE) Neurospheres היו מצופה ביצוע השלבים המפורטים בסעיף 2 על PLL- ו Laminin מצופים coverslips במדיום בידול עבור 7 ימים withoניתוק UT; תוקן; ו immunostained נגד β טובולין III (סמן עצבי), GFAP (סמן astrocyte), ו O4 (סמן oligodendrocyte). הגרעינים הוכתמו על ידי DAPI. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55315/55315fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55315/55315fig3.jpg" /> איור 3: Neurospheres ו נוירונים החסיד Differentiated Neurospheres הם ריסים. (א) neurospheres Undissociated היו מצופה על coverslips מצופה במדיום NSC עבור 2 ד; תוקן; ו immunostained נגד Gpr161 (ירוק), Arl13b (אדום), ו- DNA (כחול). (ב) נוירונים הבדיל היו immunostained נגד Gpr161 (ירוק), Arl13b (אדום, א) או β טובולין III (אדום, B), ואת ה- DNA (כחול). חיצים לבנים מצביעים לוקליזציה Gpr161 ב ריסים.הפנלים ממש (א &#39;) הם נופים מוגדלים של cilium העיקרי מצוין על ידי החץ הלבן. Cilium Gpr161 חיובי הנוירון לבן-התאגרף מוצג בצד ימין (B). סולם = 10 מיקרומטר (א); 50 מיקרומטר (B). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55315/55315fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55315/55315fig4.jpg" /> איור 4: צפים, מובחן Neurospheres להחזיק תאי ריסים. neurospheres צף תוקנו, מוטבע אוקטובר, cryosectioned, ומעובד immunofluorescence נגד Arl13b (אדום) ו DNA. ריסים עיקריים Arl13b חיוביים בתוך neurosphere מוצגים. הפאנל ב (א) הוא היטל מירבי בעוצמה של 14 z-סעיפים ב 0.8 מיקרומטר במרווחים של neurosphere. הפנלים ב (ב) להציג את התצוגה המוגדלת גתאי iliated באזור הלבן-התאגרף (א). דימוי ההקרנה המקסימאלי מכל Z- הקטעים מוצג כערימה, ואילו מספרים 1 עד 14 מצביעי z-חלקים בודדים. החצים הלבנים מצביעים cilia העיקרי. בר סולם = 50 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55315/55315fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/55315/55315fig5.jpg" /> איור 5: רעב הגורם Ciliogenesis ב גזע ניתק חסיד עצבי / ובתאים. (א) תאים ניתקים היו מצופים על coverslips מצופה במדיום NSC או בינוני רעב במשך 24 h; תוקן; ו immunostained נגד Gpr161 (ירוק), Arl13b (אדום), ו- DNA (כחול). ריסי Gpr161 חיובי נצפים בשליטה (משמאל) מורעב (מימין) תאים. הפנלים התחתונים נופים מוגדלים של קופסות הלבנות המצוינות בהתאמהלוחות עליונים. החצים וראשי חצי לבנים מצביעים Gpr161-חיובי -שלילית ריסים, בהתאמה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ב) כימות של תאי ריסי Arl13b חיוביים (גרף משמאל) Gpr161 לוקליזציה ב ריסי Arl13b החיוביים (מימין גרף) בשליטה ותאי מורעבים. האחוזים של שני Arl13b חיוב תאי ריסי Gpr161 לוקליזציה ב Arl13b חיובי ריסים גדלו על הרעבה. הכימות מבוצע משני שדות מבט אחד משני משכפל טכני של ניסוי בודד. הנתונים מיוצגים כממוצע מכל 4 שדות הראיה ± סטיית התקן. *, P &lt;0.05; **, P &lt;0.01. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55315/55315fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/55315/55315fig6.jpg" /> איור 6: Transfection בגזע ניתק חסיד עצבי / ובתאים. תאים ניתקים מצופים על coverslips המצופה היו transfected עם סופית N-LAP-TULP3 (1-183 aa) mut12 מבנה שאינו להיקשר IFT-A הליבה 56 מורכבים. המדיום שונה-transfection פוסט h 24 בינוני רעב. התאים היו קבועים לאחר 24 שעות ולאחר immunostained נגד GFP (ירוק), Gpr161 (אדום), Arl13b (מג&#39;נטה), ו- DNA (כחול). תא טרנספקציה עם Gpr161- ו cilium Arl13b החיובי מסומן על ידי חץ לבן, ואילו תא טרנספקציה ללא ריסים מוצג עם ראש חץ לבן. חיצים וראשי חצים צהובים מצביעים לתאי untransfected עם או בלי Gpr161 / Arl13b, בהתאמה. בר סולם = 10 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55315/55315fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia at JoVE.com

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Cilium העיקרי הוא גורם קריטי ב התפשטות תאים ובתאים עצבית, בידול עצבי, ואת תפקוד עצבי בוגרת. כאן, אנו מתארים שיטה ללמוד ciliogenesis וסחר איתות חלבונים כדי ריסים בתאי גזע / ובתאים עצביים נוירונים בדיל באמצעות תרבויות neurosphere עיקריות.

בתרביות neurosphere ראשיים כדי המחקר העיקרי צילה

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

using-primary-neurosphere-cultures-to-study-primary-cilia

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.3K Views.  University of Texas Southwestern Medical Center.  Cilium העיקרי הוא גורם קריטי ב התפשטות תאים ובתאים עצבית, בידול עצבי, ואת תפקוד עצבי בוגרת. כאן, אנו מתארים שיטה ללמוד ciliogenesis וסחר איתות חלבונים כדי ריסים בתאי גזע / ובתאים עצביים נוירונים בדיל באמצעות תרבויות neurosphere עיקריות. 

Video: Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and Schwann cells in the peripheral nervous system (PNS). We use an in vitro myelination assay, an established model for studying CNS myelination in vitro. To do this, oligodendrocyte precursor cells (OPCs) are added to the purified primary rodent dorsal root ganglion (DRG) neurons to form myelinating co-cultures. In order to specifically interrogate the roles that particular proteins expressed by oligodendrocytes exert upon myelination we have developed protocols that selectively transduce OPCs using the lentivirus overexpressing wild type, constitutively active or dominant negative proteins before being seeded onto the DRG neurons. This allows us to specifically interrogate the roles of these oligodendroglial proteins in regulating myelination. The protocols can also be applied in the study of other cell types, thus providing an approach that allows selective manipulation of proteins expressed by a desired cell type, such as oligodendrocytes for the targeted study of signaling and compensation mechanisms. In conclusion, combining the in vitro myelination assay with lentiviral infected OPCs provides a strategic tool for the analysis of molecular mechanisms involved in myelination.

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

ייצור ושימוש בLentivirus לתאי סלקטיבי transduce הראשי oligodendrocyte מבשר ל<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני myelination

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop within the uterus. A newly developed ex vivo upright droplet culture method provides an attractive alternative to studies performed in utero. The ex vivo droplet culture provides the ability to examine and manipulate cellular interactions and diverse signaling pathways through use of various blocking and activating compounds; additionally, the effects of various pharmacological reagents on the development of specific organs can be studied without unwanted side effects of systemic drug delivery in utero. As compared to other in vitro systems, the droplet culture not only allows for the ability to study three-dimensional morphogenesis and cell-cell interactions, which cannot be reproduced in mammalian cell lines, but also requires significantly less reagents than other ex vivo and in vitro protocols. This paper demonstrates proper mouse fetal organ dissection and upright droplet culture techniques, followed by whole organ immunofluorescence to demonstrate the effectiveness of the method. The ex vivo droplet culture method allows the formation of organ architecture comparable to what is observed in vivo and can be utilized to study otherwise difficult-to-study processes due to embryonic lethality in in vivo models. As a model application system, a small-molecule inhibitor will be utilized to probe the role of vascularization in testicular morphogenesis. This ex vivo droplet culture method is expandable to other fetal organ systems, such as lung and potentially others, although each organ must be extensively studied to determine any organ-specific modifications to the protocol. This organ culture system provides flexibility in experimentation with fetal organs, and results obtained using this technique will help researchers gain insights into fetal development.

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

שימוש<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות הזקופה טיפה של איברים העובר שלמים לחקר תהליכים התפתחותיים בעכבר organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell lines. However, primary cell cultures usually have a finite life span and need to be frequently re-established. Fibroblasts are an easily accessible source of primary cells. Here, we discuss a simple and quick experimental procedure to establish primary fibroblast cultures from ears and tails of mice. The protocol can be used to establish primary fibroblast cultures from ears stored at RT for up to 10 days. When the protocol is carefully followed, contaminations are unlikely to occur despite the use of non-sterile tissue stored for extended time in some cases. Fibroblasts proliferate rapidly in culture and can be expanded to substantial numbers before undergoing replicative senescence.

We describe a simple and quick experimental procedure for generating primary fibroblasts from the ears and tails of mice. The procedure does not require special animal training and can be used for the generation of fibroblast cultures from ears stored at RT for up to 10 days.

תרבויות יצירה ראשיות פיברובלסטים מרקמות אוזן וזנב עכבר

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.

This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.

ראשוניים האדם Trophoblast דגם תרבית תאים כדי לחקור את ההשפעות המגנות של מלטונין נגד היפוקסיה / נגרמת reoxygenation שיבוש

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells, represent a unique type of undifferentiated cells with promise in tissue engineering and for reprogramming into iPSC for future pediatric interventions and stem cell banking. The protocol presented here describes an optimized procedure for extracting and culturing primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells and generating episomal induced pluripotent stem cells from these cells in fully chemically defined culture conditions utilizing human recombinant vitronectin and the E8 medium. Characterization of the new lines by applying stringent methods &#8211; flow cytometry, confocal imaging, teratoma formation and transcriptional profiling &#8211; is also described. The newly generated lines express markers of embryonic stem cells &#8211; Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 &#8211; while being negative for the SSEA-1 marker. The stem cell lines form teratomas in scid-beige mice in 6-8 weeks and the teratomas contain tissues representative of all three germ layers. Transcriptional profiling of the lines by submitting global expression microarray data to a bioinformatic pluripotency assessment algorithm deemed all lines pluripotent and therefore, this approach is an attractive alternative to animal testing. The new iPSC lines can readily be used in downstream experiments involving the optimization of differentiation and tissue engineering.

This protocol describes the reprogramming of primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells into induced pluripotent stem cells using a non-integrating episomal approach in fully chemically defined conditions. Procedures of extraction, culture, reprogramming, and characterization of the resulting induced pluripotent stem cells by stringent methods are detailed.

התכנות ראשי מי שפיר ו ממברנות התאים כדי Pluripotency בתנאים קסנו-חופשית

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in the elderly and end-stage renal disease (ESRD) patients, who commonly suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. At present, there are no medication therapies that can stop its progression. The mechanisms that underlie this pathological process remain unclear. The aortic valve leaflet is composed of a thin layer of valve endothelial cells (VECs) on the outer surfaces of the aortic cusps, with valve interstitial cells (VICs) sandwiched between the VECs. The use of a rat model enables the in vitro study of ectopic calcification based on the in vivo physiopathological serum phosphate (Pi) and calcium (Ca) levels of patients who suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. The described protocol details the isolation of a pure rat VIC population as shown by the expression of VIC markers: alpha-smooth muscle actin (&#945;-SMA) vimentin and tissue growth factor beta (TGF&#946;) 1 and 2, and the absence of cluster of differentiation (CD) 31, a VEC marker. By expanding these VICs, biochemical, genetic, and imaging studies can be performed to study and unravel the key mediators underpinning CAVD.

This protocol describes the isolation, culture, and calcification of rat-derived valve interstitial cells, a highly physiological in vitro model of calcific aortic valve disease (CAVD). Exploitation of this rat model facilitates CAVD research in exploring the cell and molecular mechanisms that underlie this complex pathological process.

בידוד ואפיון של החולדה הראשית שסתום תאים ביניים: מודל חדש ללמוד הסתיידות שסתום אבי העורקים

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

דור, Culturing של ראשי Keratinocytes האדם מן העור למבוגרים

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to manipulate gene expression in organoids have made limited progress in this arena. While CRISPR/Cas9 technology allows for precise genome editing of cells for organoid generation, this strategy requires extensive selection and screening by sequence analysis, which is both time-consuming and costly. Here, we provide a detailed protocol for efficient viral transduction of intestinal organoids. This approach is rapid and highly efficient, thus decreasing the time and expense inherent in CRISPR/Cas9 technology. We also present a protocol to generate frozen sections from intact organoid cultures for further analysis with immunohistochemical or immunofluorescent staining, which can be used to confirm gene expression or silencing. After successful transduction of viral vectors for gene expression or silencing is achieved, intestinal stem cell and crypt function can be rapidly assessed. Although most organoid studies employ in vitro assays, organoids can also be delivered to mice for in vivo functional analyses. Moreover, our approaches are advantageous for predicting therapeutic responses to drugs because currently available therapies generally function by modulating gene expression or protein function rather than altering the genome.

We describe step-by-step instructions to: 1) efficiently engineer intestinal organoids using magnetic nanoparticles for lenti- or retroviral transduction, and, 2) generate frozen sections from engineered organoids. This approach provides a powerful tool to efficiently alter gene expression in organoids for investigation of downstream effects.

הנדסה גנטית של מעיים עכבר ראשי אורגנואידים באמצעות מגנטית ננו-חלקיק התמרה וקטורים ויראלי עבור הקפאת שימוש

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a hallmark of various pathophysiological conditions including tumor suppression, tissue remodeling and aging. The inducers of cellular senescence in vivo are still poorly characterized. However, a number of stimuli can be used to promote cellular senescence ex vivo. Among them, most common senescence-inducers are replicative exhaustion, ionizing and non-ionizing radiation, genotoxic drugs, oxidative stress, and demethylating and acetylating agents. Here, we will provide detailed instructions on how to use these stimuli to induce fibroblasts into senescence. This protocol can easily be adapted for different types of primary cells and cell lines, including cancer cells. We also describe different methods for the validation of senescence induction. In particular, we focus on measuring the activity of the lysosomal enzyme Senescence-Associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the rate of DNA synthesis using 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay, the levels of expression of the cell cycle inhibitors p16 and p21, and the expression and secretion of members of the Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP). Finally, we provide example results and discuss further applications of these protocols.

Here, we discuss a series of protocols for induction and validation of cellular senescence in cultured cells. We focus on different senescence-inducing stimuli and describe the quantification of common senescence-associated markers. We provide technical details using fibroblasts as a model, but the protocols can be adapted to various cellular models.

אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית הסלולר העיקרי בתאי אדם

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד Keratinocytes האנושי העיקרי של רקמת עור מבוגר

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...