שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות חשובות בתחום הלב וכלי הדם על ההשפעה מטריצה חוץ תאית יש בשלבים פיזיולוגיים והתפתחותיים שונים של הלב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ניתוח השוואתי בין מטריסות עובריות למבוגרים חוץ תאיים על ידי החלת שיטת דקלולריזציה דומה על שני סוגי הרקמה. אז שיטה זו הוחלה בהצלחה על איברים אחרים כגון כריתות כירורגיות של חולי סרטן להקל על המחקר של מטריצה חוץ תאית בהקשרים שונים.
התחל על ידי שטיפה קצרה של לבבות העכבר העוברי והמבוגר עם PBS קר כקרח. לאחר מכן מניחים את הרקמות תחת מיקרוסקופ לנתח ולהשתמש מספריים קטנים ישר כדי להסיר את האטריה, החדר הימני, ואת septa מלבבות העכבר הבוגר. מעבירים את החדר השמאלי לצלחת פטרי חדשה ומחלקים את הקיר השמאלי ללא החדר לשתי רצועות אורך עבות מילימטר.
השימוש בעכבר בוגר משמאל explants בגודל הומוגני הוא חיוני עבור יעילות דקלולריזציה עקבית. השתמש אזמל פינצטה משונן עם קצה מעוקל כדי להסיר את שריר papillary לפני השימוש ברשת שני על שני מילימטר כדי לטחון עוד יותר את הרצועות לתוך שברי רקמה קטנים יותר. כאשר כל הרקמה כבר טחון, בקצרה לשטוף את החלקים עם מספיק PBS כדי לכסות את explants.
ולהעביר את הלבבות העובריים וחתיכות של רקמת לב בוגרת לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים 1.5 מיליליטר המכיל 250 microliters של טמפרטורת חיתוך אופטימלית או תרכובת OCT לכל צינור. לאחר מכן, להקפיא את דגימות רקמת הלב בקרח יבש מקורר isopentane לאחסון ב 80 מעלות צלזיוס שלילי. כדי לדקלולריזציה של הרקמות שהשתמרו בהקפאה מניחים את הדגימות הקפואות בצלחת פטרי המכילה מספיק PBS כדי לכסות לחלוטין את המתפוצצים.
לאחר OCT נמס, להטביע את הדגימות בצלחת פטרי חדשה של PBS ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים על שייקר במשך 10 עד 15 דקות ב 60 סל"ד לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ היפוטוני עובד לכל באר של צלחת תרבות רקמות סטרילית 24 באר ולהשתמש מדפים עדין להעביר שבר אחד לכל באר. הדגירה את הצלחת ב 25 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות, ב 165 סל"ד ואחריו שלוש שטיפות של שעה אחת במיליליטר אחד של PBS לגם, לכל לשטוף.
לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים מיליליטר אחד של נתרן דודיסל סולפט או SDS טרי מוכן לכל באר עבור דגירה 24 שעות ביממה ב 25 מעלות צלזיוס. למחרת, לשטוף את הדגימות עם שלוש 20 דקות שוטף במיליליטר אחד של חיץ לשטוף היפוטוני לכל לשטוף ואחריו תוספת של מיליליטר אחד של פתרון טיפול DNase לכל באר עבור דגירה של שלוש שעות, ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, הדגימות המפורקות צריכות לאבד את העקביות דמוית הג'לטין שלהן.
לאחר מכן לשטוף את שברי הרקמה שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS במשך 20 דקות לשטוף ואחריו לשטוף לילה במיליליטר אחד של PBS טרי לגם בטמפרטורת החדר ו 60 סל"ד. כדי להעריך את הסרת שרידים הסלולר מן הרקמה decellularized, למחרת בבוקר לתקן את הדגימות במיליליטר אחד של חיץ טרי מוכן 10% נוסחה ניטרלי בתוספת 0.03% של אאוסין מים ל הבאר במשך 2.5 עד שלוש שעות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות במיליליטר אחד של PBS לגם.
ולהשתמש בתבנית ויניל חד פעמית כדי encapsulate שברים decellularized בג'ל עיבוד היסטלולוגיה על פי מפרט היצרן. לאחר מכן, העבר את השברים המוקפצים לקלטת הטבעה לעיבוד ביופסיה. ולעבד את הדגימות עבור פרפין הטמעות דרך דגירה רצופה של 30 דקות בריכוזים עולים של אתנול, פתרון פחמימנים אליפטיים isoparaffinic ושני 56 מעלות צלזיוס פרפין עולה.
לאחר פרפין השני מגיח, להרכיב דגימות בבלוק פרפין ולהשתמש microtome כדי להשיג קטעים בעובי שלושה מיקרומטר. לאחר מכן לאמת את יעילות decellularization על ידי הכתמת החלקים עם haematoxylin ו eosin וכתמי trichrome של מאסון על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. לאחר לשטוף את ה-PBS בן הלילה ברעידות, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של DPBS טרי, בתוספת 2.5 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיטריסין B 1% פתרון אנטיביוטי לכל פיגום.
ולאחסן את הדגימות במשך יום עד שבעה ימים בארבע מעלות צלזיוס. לפני הישיבה את התאים, להחליף את פתרון DPBS עם 500 microliters של מדיום בסיס התא בתוספת אנטיביוטיקה. ולדגר את הפיגומים במשך שעה אחת ב37 מעלות צלזיוס.
בסוף הדגירה, השתמש במיקרוסקופ כדי להוסיף טיפת ארבעה מיקרוליטר של DPBS למרכז באר אחת של צלחת 96 באר לכל פיגום. ולהשתמש פינצטה ישר דק להעביר פיגום אחד decellularized לראש כל טיפה. הסר כל DPBS נוסף על ידי שאיפה ולאשר כי הפיגום אינו מקופל או מקומט.
כאשר הפיגומים התייבשו בקצוות, מושב לאט מתלה תא אחד של התאים של עניין בחלק העליון של כל פיגום. יום עוברי 18 רקמות decellularized מאופיינים על ידי מבנה שקוף מאוד בעוד explants מבוגרים להפגין מראה שקוף ללבן. המטוקסילין וכתמי טריכום של אאוסין ומאוסון מאשרים הסרת תא יעילה על ידי רשת נקבובי נוכחות.
החומר הגרעיני מצטמצם בכ-99.8% לאחר ההפחתה, בהשוואה לרקמות שאינן מניפולציות החיוניות למניעת תגובה דלקתית לא רצויה בעת ההשתלה. הכדאיות התא בתוך פיגומים יושבים ניתן לפקח במהלך תרבות במבחנה על ידי כתמי קלסין. ניתוח מסוף של אכלס מחדש של התא והפצה על פני פיגומים, יכול להתבצע גם לאחר עיבוד פרפין כפי שנצפה בתמונות מייצגות אלה של סעיף bioscaffold מרכזי.
אז טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בחקר המאפיינים הביו-אקטיביים של המטריצה החוץ-תאית מלבבות עכבר עובריים ומבוגרים אך גם מרקמות אחרות.
