Этот метод может помочь решить важные вопросы в сердечно-сосудистой области о воздействии внеклеточной матрицы имеет во время различных физиологических и стадий развития сердца. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет сравнительный анализ между плода и взрослых внеклеточных матриц, применяя аналогичный метод децеллюляризации для обоих типов тканей. Таким образом, этот метод был успешно применен к другим органам, таким как хирургические ресекции от онкологических больных, облегчающих изучение внеклеточной матрицы в различных контекстах.
Начните с краткого полоскания плода и взрослых мышей сердца с ледяной PBS. Затем поместите ткани под рассечение микроскопа и использовать прямые маленькие ножницы, чтобы удалить атрию, правый желудочек, и септа из сердца взрослых мышей. Перенесите левый желудочек в новую чашку Петри и разделите левую стенку свободного желудочка на двухмиллиметровые продольные полосы.
Использование взрослых мыши левого желудочка explants однородного размера имеет важное значение для последовательной эффективности децеллюляризации. Используйте скальпель и зубчатый пинцет с изогнутым кончиком, чтобы удалить папиллярную мышцу перед использованием сетки размером два на два миллиметра для дальнейшего фарша полосы на более мелкие фрагменты тканей. Когда все ткани были фарш, кратко промыть куски с достаточным PBS для покрытия explants.
И передать плода сердца и куски ткани сердца взрослого человека в отдельных 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки, содержащие 250 микролитров оптимальной температуры резки или OCT соединения на трубку. Затем заморозить образцы сердечной ткани в сухом охлажденом льду изопентане для хранения при отрицательных 80 градусах по Цельсию. Для децеллюляризации крио-сохраненных тканей поместите замороженные образцы в чашку Петри, содержащую достаточно PBS, чтобы полностью покрыть экспланты.
После того, как OCT расплавится, погрузите образцы в новую чашку Петри PBS и мыть образцы три раза на шейкере в течение 10 до 15 минут при 60 об/мин за стирку. После последней стирки добавьте один миллилитр рабочего гипотонического буфера к каждому колодец стерильной пластины культуры тканей 24-хорошо и используйте тонкие типсы, чтобы передать один фрагмент каждой хорошо. Инкубировать пластину при 25 градусах по Цельсию в течение 18 часов, при 165 об /мин, а затем три часа моет в один миллилитр PBS на колодец, за стирку.
После последней стирки добавьте по миллилитр свежеприготовленного додекилового сульфата натрия или раствора SDS в каждую колодец в течение 24-часовой инкубации при 25 градусах Цельсия. На следующий день, промыть образцы с тремя 20 минут моет в один миллилитр гипотонической мыть буфера на стирку следуют добавление одного миллилитра DNase лечения раствора для каждой хорошо в течение трех часов инкубации, при 37 градусов по Цельсию. В конце инкубации децеллюляризованные образцы должны терять желатиновую консистенцию.
Затем мыть фрагменты ткани три раза с одним миллилитром PBS в течение 20 минут за стирку с последующим ночью мыть в один миллилитр свежего PBS на хорошо при комнатной температуре и 60 об /мин. Для оценки удаления клеточных остатков из децеллюляризованной ткани, на следующее утро исправить образцы в один миллилитр свежеприготовленных 10%формула нейтрального буфера дополняется 0,03% aqueous эозин на колодец в течение 2,5 до трех часов при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть образцы в один миллилитр PBS на колодец.
И использовать одноразовые виниловые формы образца инкапсулировать децеллюлярных фрагментов в гистологии обработки геля в соответствии со спецификациями производителя. Затем перенесите инкапсулированные фрагменты на биопсию, встраивая кассету. И обработать образцы парафина встраивания через последовательные 30-минутные инкубации в восходящих концентрациях этанола, изопарафинического алифатического углеводородного раствора и двух парафинов 56 градусов по Цельсию.
После того, как появился второй парафин, крепление образцов в парафиновом блоке и использование микротома для получения секций толщиной три микрометра. Затем проинтрошите эффективность децеллюляризации, окрашивая секции гематоксилином и эозином и трихромными пятнами Массона в соответствии со стандартными протоколами. После ночной промывки PBS при встряхивании добавьте 500 микролитров свежеприготовленного DPBS, дополненного 2,5 микрограммами на миллилитр амфотерицина B 1%антибиотикного раствора на каждый эшафот.
И хранить образцы в течение одного-семи дней при четырех градусах по Цельсию. Перед тем, как рассадить клетки, замените раствор DPBS 500 микролитров клеточной базальной среды, дополненной антибиотиками. И инкубировать леса в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию.
В конце инкубации используйте микроскоп, чтобы добавить четыре капли микролитров DPBS к центру одного колодец 96-хорошо пластины на эшафот. И использовать тонкие прямые пинцеты для передачи одного decellularized эшафот в верхней части каждой капли. Удалите любые дополнительные DPBS стремлением и подтвердить, что эшафот не складывается или морщинистой.
Когда леса высохли по краям, медленно место одной ячейки подвески клеток интереса на верхней части каждого эшафота. Эмбриональные день 18 децеллюляризованных тканей характеризуются весьма полупрозрачной структуры в то время как взрослые экспланты проявляют полупрозрачный белый вид. Гематоксилин и эозин и трихом пятна Массона подтверждают эффективное удаление клеток наличием пористой сетки.
Ядерный материал уменьшается примерно на 99,8% после децеллюляризации, по сравнению с неуманипулятивными тканями, что необходимо для предотвращения нежелательной воспалительной реакции при имплантации. Жизнеспособность клеток в сидячих лесах можно контролировать во время культуры in vitro путем окрашивания кальцина. Терминальный анализ перенаселения клеток и распределения по лесам, также может быть выполнен после обработки парафина, как это наблюдается в этих репрезентативных изображений центрального биосхемы разделе.
Этот метод проложил путь для исследователей в исследовании биологически активных свойств внеклеточной матрицы сердца плода и взрослых мышей, а также других тканей.
