The authors gratefully acknowledge Ms. Cynthia DeKay for the preparation of the figures.

<ol>
	<li>Yusen, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Registry+of+the+International+Society+for+Heart+and+Lung+Transplantation:+Thirty-second+official+adult+lung+and+heart-lung+transplantation+report--2015.">Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015.</a> J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).</li><li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics--2014+update:+A+report+from+the+american+heart+association.">Heart disease and stroke statistics--2014 update: A report from the american heart association.</a> Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).</li><li>Kapelios, C. J., Nanas, J. N., Malliaras, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+cardiosphere-derived+cells+for+myocardial+regeneration:+current+progress+and+recent+results.">Allogeneic cardiosphere-derived cells for myocardial regeneration: current progress and recent results.</a> Future Cardiol. 12 (1), 87-100 (2016).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+decellularized+matrix:+Using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Porrello, E. R., Olson, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neonatal+blueprint+for+cardiac+regeneration.">A neonatal blueprint for cardiac regeneration.</a> Stem Cell Research. 13 (3 Pt B), 556-570 (2014).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart.">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li><li>Polizzotti, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin+stimulation+of+cardiomyocyte+regeneration+in+mice+and+human+myocardium+reveals+a+therapeutic+window.">Neuregulin stimulation of cardiomyocyte regeneration in mice and human myocardium reveals a therapeutic window.</a> Sci Transl Med. 7 (281), 281ra45 (2015).</li><li>Jesty, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-kit++precursors+support+postinfarction+myogenesis+in+the+neonatal,+but+not+adult,+heart.">c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).</li><li>Ambrosy, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Global+Health+and+Economic+Burden+of+Hospitalizations+for+Heart+Failure:+Lessons+Learned+From+Hospitalized+Heart+Failure+Registries.">The Global Health and Economic Burden of Hospitalizations for Heart Failure: Lessons Learned From Hospitalized Heart Failure Registries.</a> J Am Coll Cardiol. 63 (12), 1123-1133 (2014).</li><li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Executive+Summary:+Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2012+Update+A+Report+From+the+American+Heart+Association.">Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics-2012 Update A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 125 (22), 188-197 (2012).</li><li>Kennedy-Lydon, T., Rosenthal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration:+epicardial+mediated+repair.">Cardiac regeneration: epicardial mediated repair.</a> Proc R Soc B. 282 (1821), 2147-2172 (2015).</li><li>Williams, C., Sullivan, K., Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partially+Digested+Adult+Cardiac+Extracellular+Matrix+Promotes+Cardiomyocyte+Proliferation+In+Vitro.">Partially Digested Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Cardiomyocyte Proliferation In Vitro.</a> Adv Healthcare Mat. 4 (10), 1545-1554 (2015).</li><li>Borg, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+extracellular+matrix+components+by+neonatal+and+adult+cardiac+myocytes.">Recognition of extracellular matrix components by neonatal and adult cardiac myocytes.</a> Dev Biol. 104 (1), 86-96 (1984).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immnol. 111, A3-B1-3 (2015).</li><li>Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+DNA+in+biologic+scaffold+materials.">Quantification of DNA in biologic scaffold materials.</a> J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).</li><li>Akhyari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+an+optimized+protocol+for+whole-heart+decellularization:+a+comparison+of+three+popular+and+a+novel+decellularization+technique+and+their+diverse+effects+on+crucial+extracellular+matrix+qualities.">The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17 (9), 915-926 (2011).</li><li>Lu, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+of+decellularized+mouse+heart+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+progenitor+cells.">Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells.</a> Nat Commun. 4 (2307), 1-11 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

התלות של טכניקה זו על perfusions החוזרת והנשנית של הלב הופכת את ההימנעות של תסחיף מרכיב קריטי של תוצאה מוצלחת. מתוך הצנתור הראשוני של לב שלבי 2.2-2.6, לשינויים של פתרון בין שלבי 2.8-2.14, יש מניפולציות שיכולים לאפשר כניסתה של בועות אוויר אשר פשר זרימת perfusate לתוך שריר הלב. בשל גודלו הזעיר של הלב בילוד, אפילו בועות דקות בכלי הדם יכולות לגרום אוטם טכני, ובכך הופך decellularization שלם. בנוסף, בשלבים לשטוף אחר כך, זלוף שלם יכול לגרום שאריות דטרגנט כי משפיע לרעה התאמה ביולוגית. יתר על כן, שינויים מהירים בטמפרטורה, כגון בעת ​​הסרת מטריקס מאחסון 4 מעלות צלזיוס כפי שהוצעו בשלב 2.14, צריכים לגשת בזהירות כי זה גם יכול להיות מקור של היווצרות בועת אוויר כאשר מומס מהלכי גז מתוך פתרון עם השינוי בטמפרטורה. Wהליך תרנגולת recellularization, טיפול נוסף צריך להיות מיושם, בעת הכנת המזרק עם השעית התא, כדי להבטיח את העירוי הוא בועה חינם (שלב 6.4). זה עשוי להיות נחוץ כדי לתפעל את הפרטים של פרוטוקול זה כדי להכיל סוגים ברקמות אחרות. ישנם מספר פרוטוקולי decellularization דיווח 4,9,11 אשר יכול לספק הדרכה. המטרה הסופית (ים) של כל פרוטוקול decellularization צריך לכלול את התחזוקה של מבנה החלבון ECM וביוכימיה הקשורות, והסרה נאותה מרכיבים תאיים הילידים כפי שהודגם על ידי DNA שיורית. בהגדרה זו, הפעלת לחץ זלוף מופרזת גורמת שיבוש ultrastructure ECM, אשר ניתן דמיינו היסטולוגית. גודלו של לב עכבר P3 מכניס כמה מגבלות על ממשל תא לעומת רקמות מבוגרות. בעוד לבבות מבוגרים מציגים קיר חדר מספיק עבה שגורם transmural Injectioשיטת משלוח תא אפשרי נה, בלב P3 הוא קטן מספיק כי מחט, שגודלה לא lyse ההשעיה תא, עושה נזק משמעותי ללב. זלוף היא אסטרטגית משלוח קיימא, אך הדבר תלוי תאים של גודל וצורה מסוימים כדי להיות מועבר באופן יעיל. מיוציטים murine ילודים לעבוד גם בעניין זה. תאים עגולים קטנים אחר גם הוכחו לשרת מטרה זו 11. סולם הגודל של לבבות אלה מונע את השימוש של אנליזה פונקציונלית קונבנציונלית פיזיולוגית, כמו קטטרים לנפח בלחץ. בניגוד לגישות אחרות מבוססים על לכידת וידאו יכול להיות כדי להיחשב. נתונים אלה תומכים ההיתכנות של decellularization ו recellularization של לב עכבר בילוד. מחקרים קודמים הדגימו את שימוש לבבות מבוגרים לצורך מחקרי decellularization / recellularization. המטריצות המופק מלבבות המבוגרות אלה כבר אוכלסו מחדש עם cardiomyocytes בילוד 4 ואנושיתאי גזע מושרים (hiPSCs) 17. במקרה של hiPSCs, הלבבות אוכלסו מחדש מציגים ירידה בסמני pluripotency כגון NANOG, Sox2, ו Oct4 ומבני שריר דמוי נוצרו; כולן עדות של התבגרות. הרמזים התאיים של ECM, לעומת זאת, הוכחו לשחק תפקיד קריטי בהתפתחות של תאים, רקמות, ואיברים אשר הניעו אותנו מנסה ליצור מטריצות מרקמות שידועות כתומכי יכולת התחדשות. במחקרים שלנו, אנו מראים כי לבבות recellularized עדיין מבטאים סמנים cardiomyocyte, גם לאחר התרבות ממושכת. נתונים אלה מצביעים על כך, באמצעות מטריצות הרומן, cardiomyocytes יכול להישמר במשך פרקי זמן ארוכים בלי לאבד את זהותם כמו cardiomyocytes. הנתונים שלנו לתמוך את הטכניקה ואת היתכנות decellularizing לב עכבר בילוד. המטריצות בילוד להחזיק את הפוטנציאל למתן בונת רומן ללימודים ואכלוס וכן לייצור ג&#39;לים שיש superior יכולת התחדשות. שימוש ECMS בילוד אלה, אנו נמצאים כעת בהתמודדות עם העליונות של פיגומים אלה כדי ליצור רקמות פונקציונליות עם מגוון רחב של סוגי תאים, כולל hiPSCs.

אי ספיקת לב היא נפוצה וקטלנית. זוהי מחלה פרוגרסיבית כי תוצאות התכווצות ירד של הלב, אשר משבש את זרימת דם לאיברים ועוזב את הדרישות המטבוליות של הגוף מסופק. ההערכה היא כי 5.7 מיליון אמריקנים סובלים מאי ספיקת לב וזה הגורם העיקרי של אשפוז בארצות הברית 9. העלות הקולקטיבית של טיפול בחולים באי ספיקת לב בארצות הברית עולה על 300 $ מיליארדים דולרים בשנת 9-10. הטיפול סופי רק עבור אי ספיקת לב סופנית הוא השתלת לב orthotopic. בכל שנה, ההערכה היא כי יותר מ -100,000 לבבות תורמים נדרשים נהלים השתלה לב בארצות הברית 1-2. לאור המספרים של תורמים המוגבלים, רק כ -2,400 השתלות מבוצעות מדי שנה בארה&quot;ב 2. ברור, מחסור האיבר הזה צריך להיות מטופל כמו אסטרטגיות אחרות נדרשות לייצר איברים נוספים transplantation, באופן אידיאלי, איברים אלה יהיו עצמיים כדי למנוע סיבוכים הקשורים דחיית דיכוי חיסוני בחיים. Cardiomyocytes המבוגר יונק להפגין יכולת התחדשות מוגבלת על פגיעה, אך הראיות אחרונות עולה כי לבבות בילוד יונקים לשמור על יכולת התחדשות מדהימה בעקבות פציעת 5-8. באופן ספציפי, לאחר כריתה כירורגית חלקית, חלון משוב התגלה בין יום לידה ואחרי הלידה 7. זה תקופת משובי מאופיין בחוסר צלקת פיברוטית, היווצרות נאווסקולריזציה, שחרור גורמי angiogenic מן epicardium, ו cardiomyocyte התפשטות 5-8 , 11. חלון משוב זה זמן מספק את הפוטנציאל לשימוש בלב בילוד כמקור רומן של חומר לפיתוח לב bioartificial. מטריקס ידוע לספק רמזים חשובים לקדם cardiomyocytהתפשטות וצמיחה דואר. הבדלים ברורים בזמינויות מולקולות מטריצות הילודים מבוגרים 12 ויכולנו לקדם התחדשות נחקרו 13. מטריצות מבוגרות decellularized שמשו מספר מחקרים לספק פיגום ECM עבור ואכלוס הסלולר והדור של לב bioartificial. בעוד שמחקרים אלה, ותגליות חדשות בטכנולוגיות תאי גזע, מתקדמים במהירות, מספר משוכות טרם נפגשו. לדוגמא, מגבלות בשימור מבנה יליד המטריצה, אינטגרציה הסלולר בקיר מטריקס, ואת היכולת לתמוך התפשטות וצמיחה כל להגביל את ההצלחה של גישה זו. בעוד תכונות התחדשות מעולות כבר ייחסו ללב בילוד, על ההיבטים המעשיים של שימוש ברקמות כגון מוגבל החיפושים שלה. בהתבסס על יכולת ההתחדשות הפגינה הלב בילוד, פתחנו מטריצות רומן על ידי פיתוחטכניקה של decellularization ללב עכבר P3. לב P3 נבחר ללימודים אלה כפי שהוא בתוך החלון של התחדשות לב כמו בעבר נקבע 6 אבל הלב הוא גדול מספיק כדי קציר, decellularize ו recellularize. מטרת המחקר הנוכחי היא להוכיח את ההיתכנות של יצירת מטריצת מלב עכבר בילוד. המחקרים שלנו לספק ראיות על היתכנותו של decellularizing דקה, לב בילוד תוך שמירה על שלמות מבני חלבוניים של ECM. כמו כן, אנו מדגימים את היכולת recellularize ECM לב זה עם cardiomyocytes mCherry לבטא ואנחנו בחנו cardiomyocytes אלה עבור ביטוי של סמנים לבביים שונים הבאים recellularization. טכנולוגיה זו תאפשר בדיקה של עליונות של מטריצה ​​בילוד לפיתוח לב bioartificial.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1054">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">1. Materials For Mouse Heart Isolation</td>
			<td style="width:323px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>21577</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm Culture dish</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Single Use Blade</td>
			<td>Stanley</td>
			<td>28-510</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard Scissors</td>
			<td>Moria Bonn (Fine Science Tools)</td>
			<td>14381-43</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring Scissors 10 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#5 Forceps</td>
			<td>Dumnot (Fine Science Tools)</td>
			<td>11295-00</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2. Materials For Decellularization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inlet adaptor</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-1013</td>
			<td>autoclavable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Septum</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-3022-99</td>
			<td>autoclavable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing</td>
			<td>Cole-Parmer&#160;</td>
			<td>EW-06422-10</td>
			<td>autoclavable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Male luer to 1/8&#34; hose barb adaptor</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K33</td>
			<td>autoclavable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Female luer to 1/8&#34; hose barb adaptor</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K26</td>
			<td>autoclavable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prolene 7-0 surgical suture&#160;</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8648G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ring stand</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S47807</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-769-6Q</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clamp regular holder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-754Q</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 cc syringe barrel&#160;</td>
			<td>Coviden</td>
			<td>1186000777T</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beaker</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>14000250</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">22g x 1 Syringe Needle&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305155</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 cc syringe&#160;</td>
			<td>Coviden</td>
			<td>8881512878</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-way stop cock&#160;&#160;</td>
			<td>Smith Medical&#160;</td>
			<td>MX5311L</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">22 x 1 g needle&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305155</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE50 tubing&#160;</td>
			<td>BD Clay Adams Intramedic</td>
			<td>427411</td>
			<td>Must be formable by heat. Polyethylene recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1% SDS&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15525-017</td>
			<td>Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1% Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Sterile dH2O</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30538.02</td>
			<td>Or MilliQ system purified water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pen/Strep&#160;</td>
			<td>Corning CellGro</td>
			<td>30-001-Cl</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3. Materials For DNA Quantitation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1700</td>
			<td>&#62;30U/mg activity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl*6H2O</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5958-04</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris base/hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503/T5941</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pico-Green dsDNA assay kit</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>P7589</td>
			<td>requires fluorimeter to read</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4. Method for fixation and sectioning of tissue.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin Type A from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td>must be 300 bloom or greater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5. Method for tissue histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryomolds 10 x 10 x 5mm</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4565</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat</td>
			<td>Hacker/Bright</td>
			<td>Model OTF</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Slides&#160; 25 x 75 x 1 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-19</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematoxylin 560&#160;</td>
			<td>Surgipath/Leica Selectech&#160;</td>
			<td>3801570</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2701</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Define</td>
			<td>Surgipath/Leica Selectech&#160;</td>
			<td>3803590</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue buffer&#160;</td>
			<td>Surgipath/Leica Selectech&#160;</td>
			<td>3802915</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alcoholic Eosin Y 515&#160;</td>
			<td>Surgipath/Leica Selectech&#160;</td>
			<td>3801615</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formula 83 Xylene substitute&#160;</td>
			<td>CBG Biotech&#160;</td>
			<td>CH0104B</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Permount Mounting Medium&#160;</td>
			<td>Fisher Chemical&#160;</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen IV Antibody</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>600-401-106.1</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Actinin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB9465</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mCherry Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB205402</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NKX2.5 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-8697</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey anti-mouse AF488 Antibody</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>&#160;A21202&#160;</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey anti-chicken AF594 Antibody</td>
			<td>Jackson Immunoresearch&#160;</td>
			<td>703-585-155&#160;</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey anti-goat CY5 Antibody</td>
			<td>Jackson Immunoresearch&#160;</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594</td>
			<td>Jackson Immunoresearch&#160;</td>
			<td>111-587-003&#160;</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS (Ca, Mg Free)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30031.02</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (1M)</td>
			<td>Corning CellGro</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primeria 100 mm plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353803</td>
			<td>Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Difco</td>
			<td>215240</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8764</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (Delbecco&#39;s Minimal Essential Media)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitamin B12&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V6629</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibronectin coated plates&#160;</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>354501</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heart bioreactor glassware</td>
			<td>Radnoti Glass Technology</td>
			<td>120101BEZ</td>
			<td>Must be sterilizable by autoclaving or gas.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neonatal cardiac scaffolds: novel matrices for regenerative studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

<html> decellularization בממוצע, זמן decellularization של לב P3 באמצעות פרוטוקול זה הוא כ 14 שעות. מקבלת משקל לב ממוצע של 23 מ&quot;ג עבור ילוד P3. Acellularity איור 3 א מדגימים לב בילוד P3 במלואו ללא פגם (הר שלם). איור 3B מראה את אותו בלב הבא decellularization. איורי 4 א ו -4 להראות מכתים hematoxylin ו eosin של לבבות שלמים decellularized, בהתאמה. הערת העדר גרעיני hematoxylin חיובי על הקטנת מבנים אאוזינופילית בלב decellularized. בנוסף, התוכן DNA של הלב decellularized מצטמצם משמעותית מ 68.08 ± 2.25 מיקרוגרם בלב שלם (n = 6) כדי 4.73 ± 2.27 מיקרוגרם בלב decellularized (n = 5). דק-page = &quot;1&quot;&gt; immunoreactivity קולגן התחזוקה של תאי מטריקס (ECM) הבאים decellularization חיוני Repopulation עם תאים אקסוגניים לפונקציונליות של מטריקס. כדי להעריך את התוכן של ECM בילוד ב ECM שלם decellularized, חיסונית מכתים עבור קולגן IV בוצע. איור 4C ו- D להוכיח כי קולגן IV מתבטא וחסונה בשני בלב שלם decellularized וכי לוקליזציה של החלבון הזה נשמר לאחר הסרת תאים, בעוד גרעינים חיוביים DAPI יוסרו באופן יעיל (איור 4E-ח). תוכן DNA הנוכחות של ה- DNA משמש כאינדיקציה נוספת של cellularity. באיור 5, DNA מוכח להיות ירידה של 93% בלבבות בילוד הבאים decellularization דטרגנט מבוסס. דרגה זו של הפחתת DNA עולה בקנה אחד עםדיווחים בספרות באמצעות decellularization דטרגנט מבוסס ברקמות אחרות 15-16. Recellularization ביצענו אימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע את הביטוי של סמנים cardiomyocyte שונים בלב recellularized. איור 6 ממחיש תאים היגרו לתוך הקיר של החדר השמאלי (איור 6 א ו 6 ב). איור 6 ג מדגים את תיוג DAPI של הלב recellularized. איור 6D-G ממחיש תאים, כי הם חיוביים עבור 2.5 NKX, mCherry, α-actinin ו DAPI, בהתאמה. NKX2.5 ידוע לתייג ובתאי לב, ואילו-actinin α הוא חלבון sarcomeric מסמן cardiomyocytes המובחן. צפינו רוב התאים המבטאים כל סמנים אלה (ורוד; איור 6 שעות), המציין כי התאים האלה ממשיכים להביע סמנים cardiomyocyte even לאחר 23 ימים של זלוף. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54459/54459fig1.jpg" /> איור 1. סכמטי של decellularization חומרה. A. 60 סמ&quot;ק מזרק חבית המאגר עבור בתמיסת דטרגנט. B. הרכבת צנתר עם מזרק השקיה כמפורט. C. פרט קצה הצנתר צינורות PE נמשך. D. קאמרי מחץ Decellularization עם ניקוז. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54459/54459fig1large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54459/54459fig2.jpg" /> איור 2. ייצוג סכמטי של bioreactor לב. 1. לחות של גז carbogen (קווים ירוקים מייצגים זרימת הגז). 2. כונן משאבת Peristaltic זלוף תקשורתחמצון (קווים סגולים לייצג זרימת מדיה דרך oxygenator). 3. oxygenator קיר דק. 4. oxygenator גיליון מאגר תקשורת. 5. תא Preload מלכודת בועה. 6. תא לב (קווים אדומים מייצגים זרימת מדיה אל מהלב). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54459/54459fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54459/54459fig3.jpg" /> איור 3. הר שלם של הלב עכבר בילוד P3 לפני (א) ואחרי decellularization (B). לב זה decellularized בשיטת זלוף Langendorff כמתואר בשיטה 2. שים לב הלב הופך שקוף ומעט מוגדל הבאים זלוף (B) . סולם = 2 מ&quot;מ. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54459/54459fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <pclass = &quot;jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54459/54459fig4.jpg" /> איור 4. היסטולוגיה של הלב עכבר בילוד P3 יליד decellularized. בסעיף cryostat (10 מיקרומטר) הוכתמו H &amp; E (A, B), קולגן IV (C, D, G, H) ו DAPI (E, F, G, H ). תמונות ממוזגות מיוצגות G ו- H. H &amp; E מכתים מראה עדר גרעין תא ואת הציטופלסמה ברקמת decellularized (B) בהשוואה בלב הילידים (א). בעוד תוכן קולגן IV נשאר decellularization הבאה (D), מכתים DAPI (סמן של גרעינים) הוא בוטל. התמונות הממוזגות להדגים את colocalization של קולגן IV ו DAPI בלב התם (G) והיעדר colocalization זה בלב decellularized (H). נתונים אלה מצביעים על כך תאים לא<html> עוד לאכלס את מטריצת הקולגן של הלב. סולם = 500 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54459/54459fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54459/54459fig5.jpg" /> איור 5. הערכת תוכן DNA. הביקורת (n = 6) ו decellularized (n = 5) לבבות assayed עבור תוכן DNA בשיטת פיקו-ירוק. כימות מבוטא מיקרוגרם של ה- DNA לכל לב ± סטיית התקן. כוכבית מציינת p &lt;0.01 לעומת שליטה. נתונים אלו מעידים כי decellularization מפחית תוכן DNA משמעותית בלב בילוד P3. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54459/54459fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> oad / 54,459 / 54459fig6.jpg &quot;/&gt; איור 6. היסטולוגיה של P3 מטריקס הלב 23 הימים הבאים recellularization עם P1 mCherry לבטא cardiomyocytes. מוכתם H &amp; E (A, בקנה מידה = 250 מיקרומטר, B, בקנה מידה = 50 מיקרומטר), DAPI (C, בקנה מידה = 250 מיקרומטר), NKX 2.5, mCherry, α-actinin, DAPI, והתמזגו (D, E, F, G, H, בקנה מידה = 50 מיקרומטר). אנחנו הוכחנו את והאכלוס היעיל של מטריקס קולגן עם cardiomyocytes P1 (AC). בנוסף, אנו ציינו כי cardiomyocytes החיובית מ-הדובדבן להביע Nkx2.5 ו α-actinin 23 ימים לאחר הקדמה לתוך מטריצת קולגן. נתונים אלו מעידים כי תאים אלה לשמר את הזהות cardiomyocyte שלהם לפרקי זמן. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54459/54459fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של f זה</a>igure.

Watch this Scientific Journal Video about Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies at JoVE.com

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

במחקרים אלה, אנו מספקים מתודולוגיה חדשנית, בילוד, פיגומי לב בעכברים לשימוש במחקרים רגנרטיבית.

Neonatal לב פיגומים: מטריצות Novel ללימודי הרגנרציה

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

neonatal-cardiac-scaffolds-novel-matrices-for-regenerative-studies

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.7K Views.  University of Minnesota.  במחקרים אלה, אנו מספקים מתודולוגיה חדשנית, בילוד, פיגומי לב בעכברים לשימוש במחקרים רגנרטיבית. 

Video: Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

הכנת מטריצות תלונה לכימות התכווצות נייד

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

PGS אלסטומרי פיגומים להנדסת רקמות העורקים

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix structure (e.g. composition, concentration, or stiffness of the matrix) vary over space, would enable a wide range of investigations concerning how these variables affect cell differentiation, migration, and other phenomena. The major challenge in creating layered matrices is maintaining the structural integrity of layer interfaces without diffusion of individual components from each layer1. Current methodologies to achieve this include photopatterning2-3, lithography4, sequential functionalization5, freeze drying6, microfluidics7, or centrifugation8, many of which require sophisticated instrumentation and technical skills. Others rely on sequential attachment of individual layers, which may lead to delamination of layers9. 
DGMP overcomes these issues by using an inert density modifier such as iodixanol to create layers of varying densities10. Since the density modifier can be mixed with any prepolymer or bioactive molecule, DGMP allows each scaffold layer to be customized. Simply varying the concentration of the density modifier prevents mixing of adjacent layers while they remain aqueous. Subsequent single step polymerization gives rise to a structurally continuous multilayered scaffold, in which each layer has distinct chemical and mechanical properties. The density modifier can be easily removed with sufficient rinsing without perturbation of the individual layers or their components. This technique is therefore well suited for creating hydrogels of various sizes, shapes, and materials.
A protocol for fabricating a 2D-polyethylene glycol (PEG) gel, in which alternating layers incorporate RGDS-350, is outlined below. We use PEG because it is biocompatible and inert. RGDS, a cell adhesion peptide11, is used to demonstrate spatial restriction of a biological cue, and the conjugation of a fluorophore (Alexa Fluor 350) enables us to visually distinguish various layers. This procedure can be adapted for other materials (e.g. collagen, hyaluronan, etc.) and can be extended to fabricate 3D gels with some modifications10.

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Here we describe a unique strategy for creating biocompatible, layered matrices with continuous interfaces between distinct layers for tissue engineering. Such a scaffold could provide an ideal customizable environment to modulate cell behavior by various biological, chemical or mechanical cues

שיפוע צפיפות רבה שכבתי פלמור (DGMP): שיטה חדשנית ליצירת תא בעל מספר, פיגומים להנדסת רקמות להתאמה אישית

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

התקן תזרים הלשכה תלת ממדי רומן ללמוד chemokine ביים-extravasation של תאים במחזור בתנאי זרימה פיסיולוגיים

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation nanoparticles (HNPs). The latter are a new family of probes recently introduced for labeling biological samples for multi-photon imaging. HNPs are capable of doubling the frequency of excitation light by the nonlinear optical process of second harmonic generation with no restriction on the excitation wavelength.
Multi-photon based methodologies for hESC differentiation into cardiac clusters (maintained as long term air-liquid cultures) are presented in detail. In particular, evidence on how to maximize the intense second harmonic (SH) emission of isolated HNPs during 3D monitoring of beating cardiac tissue in 3D is shown. The analysis of the resulting images to retrieve 3D displacement patterns is also detailed.

Protocol details are provided for in vitro labeling human embryonic stem cells with second harmonic generating nanoparticles. Methodologies for hESC investigation by multi-photon microscopy and their differentiation into cardiac clusters are also presented.

הרמוני חלקיקים למחקר הרגנרציה

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

Electrospun nanofiber פיגומים עם דרגות בארגון סיבים

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues. 
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRP&#945; and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

בניית רקמות לב Engineered האנושית תחם לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds &#8212; Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.
This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.

Here we present a fluorophore based imaging technique to detect cell viability on a non-transparent titanium scaffold as well as to detect glimpses of the scaffold impurities. This protocol troubleshoots the drawback of imaging cell-cell or cell-metal interactions on non-transparent scaffolds.

כדאיות התא הדמיה על פיגומים ללא שקוף - לפי הדוגמה של שתל טיטניום סרוגה Novel

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in ...

Anatomically Realistic Neonatal Heart Model for Use in Neonatal Patient Simulators

Neonatal patient simulators (NPS) are artificial patient surrogates used in the context of medical simulation training. Neonatologists and nursing staff practice clinical interventions such as chest compressions to ensure patient survival in the case of bradycardia or cardiac arrest. The simulators used currently are of low physical fidelity and therefore cannot provide qualitative insight into the procedure of chest compressions. The embedding of an anatomically realistic heart model in future simulators enables the detection of cardiac output generated during chest compressions; this can provide clinicians with an output parameter, which can deepen the understanding of the effect of the compressions in relation to the amount of blood flow generated. Before this monitoring can be achieved, an anatomically realistic heart model must be created containing: two atria, two ventricles, four heart valves, pulmonary veins and arteries, and systemic veins and arteries. This protocol describes the procedure for creating such a functional artificial neonatal heart model by utilizing a combination of magnetic resonance imaging (MRI), 3D printing, and casting in the form of cold injection molding. Using this method with flexible 3D printed inner molds in the injection molding process, an anatomically realistic heart model can be obtained.

This protocol describes a procedure for creating functional artificial neonatal heart models by utilizing a combination of magnetic resonance imaging, 3D printing, and injection molding. The purpose of these models is for integration into the next generation of neonatal patient simulators and as a tool for physiological and anatomical studies.

מודל הלב Neonatal מציאותי אנטומית לשימוש ב- Neonatal סימולטורים החולה

Neonatal patient simulators (NPS) are artificial patient surrogates used in the context of medical simulation training. Neonatologists and nursing staff ...

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can provide mechanical stability similar to native tissue while biologic agents offer compositional cues to progenitor cells, leading to their migration, proliferation, and differentiation to reconstitute the original tissues/organs1,2. Unfortunately, many 3D printing compatible, bioresorbable polymers (such as polylactic acid, PLA) are printed at temperatures of 210 &#176;C or higher - temperatures that are detrimental to biologics. On the other hand, polycaprolactone (PCL), a different type of polyester, is a bioresorbable, 3D printable material that has a gentler printing temperature of 65 &#176;C. Therefore, it was hypothesized that decellularized extracellular matrix (DM) contained within a thermally protective PLA barrier could be printed within PCL filament and remain in its functional conformation. In this work, osteochondral repair was the application for which the hypothesis was tested. As such, porcine cartilage was decellularized and encapsulated in polylactic acid (PLA) microspheres which were then extruded with polycaprolactone (PCL) into filament to produce 3D constructs via fused deposition modeling. The constructs with or without the microspheres (PLA-DM/PCL and PCL(-), respectively) were evaluated for differences in surface features.

This protocol describes the production of polycaprolactone (PCL) filament with embedded polylactic acid (PLA) microspheres which contain decellularized matrices (DM) for 3D printing of structural tissue engineering constructs.

הרומן תהליך הדפסת תלת-ממד Decellularized מטריצות

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...