המחברים רוצה להודות הארגונים הבאים: הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31171018, 31171355), מדע, טכנולוגיה החלוקה של גואנג-דונג (2013KJCX0054), בסיס מדעי הטבע של בפרובינצית גואנג-דונג ( 2014A030313418, 2014A030313440), ואת גואנגג'ואו מדע, טכנולוגיה הלשכה (201607010320).

דיור חיה ובהמה כל הניסויים נערכו בהתאם לנהלים אושרו על ידי ועדת האתיקה לחקר בעלי חיים באוניברסיטה רגילה סין דרום, על פי הנחיות חיה אכפת שהוקם על ידי המכון הלאומי של בריאות-
 1. ההכנה של פתרונות <ol><li>להכין 500 מל סטנדרטי מלאכותי השדרתי (כלנית חדד) המכיל את הרכיבים שמתואר שלנו עבודה שפורסמה 7 כמפורט בטבלה 1.
	<ol><li>זכוכית נקי שימוש בקבוקונים עם מים יונים להכין פתרון חנה המבר טריים. יבש לפני השימוש כדי להוסיף NaH NaCl, אשלגן כלורי, ונקי שפכטלים עם מים יונים 2 PO 4, NaHCO 3, MgSO 4, D-גלוקוז, ולהוסיף את CaCl 2 לאחר נתקל מבעבע הפתרון עם 95% O 2 / 5% CO 2 התערובת ~ 20 דקות (כמו טבלה מפורטת ב 1) 500 מ של מים יונים. מערבבים עד להתמוססות מלאה.</li>
		<li>ודא חנה המבר אינו לגמרי נקה ללא משקעים כלשהם. ואז להתאים את ה-pH ל 7.2-7.4. בועה עם תערובת גז המורכבת של 95% O 2 ו- 5% CO 2 ~ 20 דק...</li>
	</ol></li> <li>להכין 250 מ של פתרון חיתוך פרוסה המכיל כימיקלים 7 המתוארות בטבלה 2.
	<ol><li>להוסיף אשלגן כלורי, MgCl 2, 2 PO NaH 4, NaHCO 3, choline·Cl, D-גלוקוז, להוסיף CaCl 2 אחרונה כמצוין ב 1.1.1, 250 מ של מים יונים, להתמוסס כפי שמתואר ב 1.1.1 ו 1.1.2.</li>
		<li>לאחר שמבעבע עם 95% O 2 / 5% CO 2, המקום הפתרון במקפיא למשך 15-20 דקות כך הפתרון חיתוך הופך קר כקרח, קפוא חלקית. 
		הערה: אנו משתמשים פתרון חיתוך זה בעת ביצוע פרוסות מהחודש 1-2-עכברים הישן; הנוסחה עשויים להיות שונים עבור עכברים שגילן עולה על 2 חודשים-</li>
		<li>LPS להכין פתרון על ידי המסת בתוך תמיסת מלח ללא אנדוטוקסין מול סטרילי (0.9% NaCl). LPS הוא מנוהל intraperitoneally (0.5 מ ג/ק ג) ולהתחיל הקלטה שעתיים מאוחר יותר.</li>
	</ol></li></ol> 2. הכנה של פרוסת קליפת המוח הקדם חזיתית <ol><li>הפתרון חיתוך מוציאים מהמקפיא, homogenize כדי להשיג את הרפש. למקם את הפתרון על קרח, בועה כל הזמן עם 95% O 2 / 5% CO 2.</li>
	<li>באמצעות מספריים גדולים, חדה, במהירות לערוף עכבר כפי שמתואר 9, מיד לשים את הראש לתוך גביע מלא קפואים (0-4 ° C) חיתוך פתרון.</li>
	<li>העליון של הגולגולת לאורך הקו האמצעי בכיוון סימטרית-כדי-אפיים עם מספריים בסדר גזורה להסיר את החלקים הגולגולת לרוחב. מסירים את המוח עם מרית בסדר, ירידה אל תוך קר כקרח חיתוך פתרון. 
	הערה: השלבים 2.2-2.3 חייב להיעשות במהירות (אידיאלי &#60; 1 דקות).</li>
	<li>במקום את המוח על המכסה של צלחת פטרי 9 ס מ מלא קרח. יש לשטוף את המוח עם פתרון חיתוך קר כקרח. לחתוך את המוח ואת הריח הנורה עם סכין גילוח.</li>
	מחזיק <li>החל הדבק דבק מגע אל הדגימה vibratome. בזהירות המקום הרחוב המוח על המסירה של דבק, rostral לקצה, ואני מיד לטבול בתמיסה קרה כקרח חיתוך.</li>
	<li>להתאים בעל להב vibratome כדי זווית של 15° ביחס במישור האופקי ולהכין 350-מיקרומטר פרוסות המוח הילתית (תדר הרטט להב = 85 הרץ, מהירות = 0.1 מ מ/s).</li>
	<li>משתמש של פיפטה, העברת הפרוסות לחדר התאוששות מלאה כלנית חדד, דגירה עבור 1 h (RT) עם בעבוע מתמדת של 95% O 2 / 5% CO 2.</li>
</ol> 3. הקלטה תיקון שלם-תא micropipettes <ol><li>להפוך זכוכית בורוסיליקט עבור משתמשים כמו הקלטה אלקטרודות או פחזנית micropipettes על פי הנחיות ספציפיות במדריך מבצע פולר. הקלטה אלקטרודות, עצה התנגדויות הן בטווח 4-6 מ' &#8486;, בעוד עלים micropipettes יש עצה קטרים בטווח של 2-5 מיקרומטר.</li>
	<li>להוסיף חוסם ערוץ Na + (TTX, 1 מיקרומטר), רחוב Na + מהיר ערוץ ובכך פוטנציאל פעולה, כדי כלנית חדד, לשמור על קצב זרימה מתמדת של פתרון זה של 2-3 mL/min בתא ההקלטה, על ידי משאבת סחרור לתוך החדר שאיפה מזה. בועה של כלנית חדד עם 95% O 2 / 5% CO 2 כל הזמן כדי להבטיח את הכדאיות של הפרוסות.</li>
	<li>העברת פרוסה המוח אל החדר הקלטה באמצעות פיפטה פסטר ששונה עצה בסדר אשר נחתך כדי להתאים את גודל הפרוסה. לכסות את הפרוסה עם עוגן פרוסה פלטינה עם חוטי ניילון מקבילים במרווחים &#8805; 2 מ מ לגזרים, להחזיק את הפרוסה על הרציף.</li>
	<li>למלא את micropipette הקלטה עם הפתרון הפנימי 7 (טבלה 3), ולמלא את micropipettes עלים עם GABA-10 מיקרומטר, 50 מיקרומטר, ו 100 מיקרומטר (מומס כלנית חדד), או חנה המבר כפקד הרכב.</li>
	<li>כדי למנוע סתימה עם פסולת, החל לחץ חיובי קל באמצעות מזרק 1 מ"ל לפני הטבעית האלקטרודה הקלטה ב חנה המבר. שימוש של micromanipulator תחת מיקרוסקופ (עדשה המטרה x 4), מקם את ההקלטה אלקטרודה ואת פאף micropipette כך הטיפים מופיעים במרכז של תמונת הוידיאו על המסך ( איור 1 א').</li>
	<li>להתאים את המוקד מיקרוסקופ (40 x עדשה המטרה) תוך כדי הנמכת בהדרגה את micropipette עלים ומניחים אותו מעל נוירון הקלטה בזווית של 45°. שמור על המרחק בין קצה micropipette עלים נוירון שנרשם בין 20-40 µm ( איור 1 B). לאט ובזהירות לגשת הנוירון עם האלקטרודה הקלטה ולאחר מכן שחרר את הלחץ. החלת יניקה חלש ולא קצרה דרך הצנרת מחובר למחזיק אלקטרודה ליצירת גושפנקה גיגה אוהם.</li>
	<li>שמור על המתח ב 0 mV. לאחר היווצרות החותם גיגה אוהם, לפצות על מהר ולאט קיבוליות באופן ידני או אוטומטי. לאחר מכן החל יניקה קצר וחזק דרך הצנרת הנ ל כדי להגיע למצב השלם-תא.</li>
	מצב <li>eIPSC רשומה במתח-קלאמפ. חלות לחץ דלק נמוך (חנקן, 4-6 psi) micropipette עלים באמצעות Picospritzer הנשלט על-ידי גנרטור שלב מתח מאסטר 8 כדי לספק יחיד או מזווג גאבא פחזניות ( איור 2).</li>
	<li>לשנות את המשך עלים כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר eIPSC ( איור 3) ולמדוד את eIPSC במודל דיכאון LPS-induced ( איור 4).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres.">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li><li>Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+used+for+studying+synaptic+transmission+in+slices+of+mammalian+brain.">Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain.</a> Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).</li><li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+hyperactivity+recruits+microglial+processes+via+neuronal+NMDA+receptors+and+microglial+P2Y12+receptors+after+status+epilepticus.">Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus.</a> J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).</li><li>Dickinson, G. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+determining+the+recruitment+of+inositol+trisphosphate+receptor+channels+during+calcium+puffs.">Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs.</a> Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Columnar+distribution+of+activity+dependent+gabaergic+depolarization+in+sensorimotor+cortical+neurons.">Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons.</a> Mol Brain. 5, 33 (2012).</li><li>Glykys, J., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+main+source+of+ambient+GABA+responsible+for+tonic+inhibition+in+the+mouse+hippocampus.">The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus.</a> J Physiol. 582, 1163-1178 (2007).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+modulates+KCC2+expression+and+function+in+hippocampal+GABAergic+inhibition.">APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+interleukin-1+and+endotoxin+in+the+forced+swim+and+tail+suspension+tests+in+mice.">Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice.</a> Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).</li><li>Engel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+Patch-clamp+Recordings+from+the+Somatodendritic+Domain+of+Nigral+Dopamine+Neurons.">Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Wondolowski, J., Frerking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit-dependent+postsynaptic+expression+of+kainate+receptors+on+hippocampal+interneurons+in+area+CA1.">Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1.</a> J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).</li><li>Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+regulates+Cav1.2+L-type+calcium+channel+levels+and+function+to+influence+GABAergic+short-term+plasticity.">Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity.</a> J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).</li><li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+Cortical+GABAergic+Dysfunction+Contributes+to+Aberrant+UP-State+Duration+in+APP+Knockout+Mice.">Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice.</a> Cereb Cortex. , (2016).</li><li>Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine+Acts+through+Nicotinic+Receptors+to+Enhance+the+Firing+Rate+of+a+Subset+of+Hypocretin+Neurons+in+the+Mouse+Hypothalamus+through+Distinct+Presynaptic+and+Postsynaptic+Mechanisms.">Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms.</a> eNeuro. 2 (1), (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

עלים היישום נעשה שימוש נרחב כדי להעריך את קולטן postsynaptic פונקציה3,4,7, אך דורש שליטה מדויקת ניסוי. נתאר כאן הליך לערב שלם-תא תיקון מחבר חובק למעקה, אשר מדגים ש-GABA-פאף המושרה IPSCs (קרי eIPSCs) פרוסות המוח הקדם חזיתית בקליפת המוח. התנגדותם של האלקטרודה הקלטה MΩ כ-5, בעוד הקוטר עצה של עלים micropipettes היא על 2-5 מיקרומטר. פאף לחץ הוא בין 4-6 psi: טווח זה הוא קריטי, כמו לחץ גבוה עלול לגרום נזקים עצביים, בזמן לחץ נמוך יכול לגרום לא מספיק הפעלה של קולטני GABA postsynaptic. המרחק האופקי קצה micropipette עלים נוירון הקליט הוא על 20-40 µm (הקוטר של נוירונים 1-2), הזווית בין השטח micropipette ופרוסות פאף הוא בערך 45°. קצה micropipette פאף היא אנכית 20-40 µm מעל הפרוסה (ציר z). משך עלים צריך להיות בטווח של 10-150 גב' בנסיבות לעיל, נשיפה של 10-50 מיקרומטר גאבא זירוז עצביים מענה הולם והמרביים eIPSC קינטי פרמטרים שהושג הם לשחזור. למרות הפרוטוקול המתוארים כאן מתמקדת על עלים ליישום תיקון פרוסה, הוא גם מתאים להקלטות בתרבויות עצביים, כפי שמוצג שלנו עבודה שפורסמה7.
אנו גם מראים פה eIPSCs כתוצאה מיישום לזווג-עלים של חומצת אמינו גלוטמט. פרוטוקולים לזווג...-הדופק היה בשימוש נרחב כדי להעריך את מאפייני presynaptic7,11, אבל אפשרי postsynaptic אפקטים, כגון שינויים קולטן עצבי קצב ואיגוד זיקה מחייבת, אשר עשויה להשפיע דופק לזווג יחסי, לא יכול להיקבע על ידי גירוי לזווג...-הדופק presynaptic. הפרוטוקול המתואר במאמר זה מספק דרך להבהיר שינויים postsynaptic בתגובה לגירויים לזווג ואפילו הדופק-הרכבת. הקטנת משרעת eIPSC של קליפת המוח הקדם חזיתית של עכברים הזרקת LPS עולה כי רמות מסולף או פעילות של קולטני GABA אולי ביסוד LPS-induced שינויים התנהגותיים.
למרות, כמו עם רוב טכניקות משלוח סמים, קשה לדעת את הריכוז גאבא המדויק להגיע לתא המטרה, שזה עדיין אפשרי לשמור על הריכוז של גאבא ברמות מסוימות בתוך הרקמה על ידי להיות עקבי עם הסוג של micropipettes להשתמש, ולא עם פרמטרים כאלה כמו פחזנית נסיעה בלחץ ומרחק. במקרה שלנו, שאמצעי האחסון של פתרון נשענתי על 1.1 µL ב-100 מילישניות משך. לפיכך, הנעוצה מאפשר מחקרים כמותיים כדי להיות שבוצעו7,12.
הכנת פרוסות המוח בריא של קליפת המוח הקדם חזיתית חריפה היא קריטית עבור אצלם הקלטה הליך נתאר, צריך לזכור את הנקודות הבאות. ראשית, לנתח את המוח, להפריד בין קליפת המוח הקדם חזיתית במהירות (&#60; 1 דקות) ואז תשמור את הבלוק המוח בתמיסה קרה כקרח חיתוך עבור לא יותר מ- 1 דקות. בשלב הבא, בחוזקה להדביק בלוק המוח על המחזיק הדגימה vibratome, או אחרת הרחוב המוח עלול לצוף במהלך חלוקתה. המהירות ואת התדירות של vibratome להגדיר לייצר אפילו, פרוסות בריא. המאמץ חייבים להיעשות לנהל הכל מעל הליכים-0-4 ° C כדי למזער דעתנית עצביים.
ראוי לציין כי הפתרון חיתוך נתאר במאמר זה אמור לשמש לחודש 1-2-עכברים הישן. עבור עכברים בוגרים (דהיינו &#62; 3 חודשים), הפתרון חיתוך יוחלף כמו שמתואר13. הטכניקה עלים החלים על מגוון של תיקון-קלאמפ ניסויים הכוללים טיפולי תרופתי, יכול לשמש גם כדי לבחון את ההשפעה של תרופות על הפעילות החשמלית של נוירונים כלשהו.

הטכניקה תיקון-קלאמפ, כלי ראשי עבור חוקרים אותות חשמליים בנוירונים, פותחה בשנות ה-701,2. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא מספקת ידע על טיפולים כמה ספציפית (למשל, תרופתי) רשאית לשנות פונקציות עצביים או ערוצים בזמן אמת3. תרופתי הערכה של תפקוד במהלך הקלטת בפרוסה במוח תאים כל דורש היישום של תרופות, כגון אגוניסטים או היריבים של רצפטורים ספציפיים, כדי הנוירונים מוקלטת. שיטה זו מאפשרת זיהוי שינויים עצביים להתרחש בעקבות בקשה של תרופה ספציפית, ובכך מוביל הבנה טובה יותר של מאפיינים פיזיולוגיים ופתולוגיים של נוירונים4. למרות ניהול תרופתי יכול להתבצע באמצעות גם זלוף5 או עלים6, האחרון הוא טכניקה מעולה. בפרט: (i) פחזנית יישומים במהירות מגביר סמים ריכוז סביב מוקלטת הנוירון לרמה כזאת הפחתת רגישות של קולטני ממברנה נמנעת; (ii) את עוצמת הקול של סמים נשענתי הוא נמוך ביותר, כך שקיימת השפעה מועטה על הפתרון אמבט, ולפיכך מפחית תופעות בלתי רצויות של הכימיקלים מנוהלת על פרוסות המוח; (iii) פרוטוקול עלים ניתן להגדיר ונשמר, ביצוע הניסוי ברמת דיוק גבוהה ביותר לשחזור; (iv) עלים יישום מייצג שימוש חסכוני אגוניסטים/antagonists, במיוחד כאלה ריאגנטים איפה יקר או קשה להשיג.
כאן, אנו נתמקד להקליט זרמים שלמים-תא המושרה על-ידי נשיפת גאבא פרוסות המוח בחריפות מוכן, הכנה זה יש את היתרון של מעגלים המוח יחסית שמור היטב. התנהלותינו פאף-induced זרמי מעכבות7 שמתואר במאמר זה. באמצעות צסיום (Cs+)-מבוסס פתרונות פנימי, והחזקת הנוירונים ב 0 mV, תציג לנו גאבא. פאף עורר זרמי postsynaptic מעכבות (eIPSCs) עם הפרטים הטכניים המתאימים. באמצעות מודל של העכבר של דיכאון הנגרם על ידי הזרקת ליפופוליסכריד (LPS)8, אנו מראים את eIPSC משרעת עורר על ידי שאיפה גאבא פוחת באופן משמעותי בפרוסות של הזרקת LPS עכברים לעומת הרכב שולט. הכוונה שלנו היא כי מאמר זה צריך להראות איך הטכניקה עלים ישימה באופן נרחב על מחקרים שמטרתם הערכת ההשפעה של כימיקלים, תרכובות או סמים על הפעילות העצבית במוח פרוסות.

<table style="border-collapse:collapse;width:665pt" width="887">
	<colgroup>
		<col style="width:161pt" width="214" />
		<col style="width:140pt" width="187" />
		<col style="width:155pt" width="206" />
		<col style="width:210pt" width="280" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="214">Glass Borosilicate micropipettes</td>
			<td class="xl20" style="width:140pt" width="187">Shutter Instruments</td>
			<td class="xl20" style="width:155pt" width="206">BF150-86-10</td>
			<td class="xl18" style="width:210pt" width="280">1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="214">Micropipette Puller</td>
			<td class="xl20" style="width:140pt" width="187">Shutter Instruments</td>
			<td class="xl20" style="width:155pt" width="206">MODEL P-97&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:210pt" width="280">Flaming/Brow Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="214">Micromanipulators</td>
			<td class="xl20" style="width:140pt" width="187">Shutter Instruments</td>
			<td class="xl20" style="width:155pt" width="206">MP-285</td>
			<td class="xl18" style="width:210pt" width="280"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="214">Computer controlled Amplifier&#160;&#160;&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:140pt" width="187">Molecular Devices</td>
			<td class="xl20" style="width:155pt" width="206">Multiclamp 700B</td>
			<td class="xl18" style="width:210pt" width="280"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="214">Digital Acquisition system&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:140pt" width="187">Molecular Devices</td>
			<td class="xl20" style="width:155pt" width="206">Digidata 1440A</td>
			<td class="xl20" style="width:210pt" width="280"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="214">Imaging Camera</td>
			<td class="xl20" style="width:140pt" width="187">Nikon&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:155pt" width="206">2115001</td>
			<td class="xl18" style="width:210pt" width="280">Inspection equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="214">Microscopy&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:140pt" width="187">Nikon&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:155pt" width="206">Eclipse FN1&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:210pt" width="280"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="214">Master 8</td>
			<td class="xl20" style="width:140pt" width="187">A.M.P.I.</td>
			<td class="xl20" style="width:155pt" width="206">Master-8 Pulse stimulator</td>
			<td class="xl18" style="width:210pt" width="280"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="214">Vibratome Slicer</td>
			<td class="xl20" style="width:140pt" width="187">Leica</td>
			<td class="xl20" style="width:155pt" width="206">VT 1000S</td>
			<td class="xl18" style="width:210pt" width="280"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="214">Picospritzer &#8546;</td>
			<td class="xl20" style="width:140pt" width="187">Parker Hannifin</td>
			<td class="xl20" style="width:155pt" width="206"></td>
			<td class="xl18" style="width:210pt" width="280">Pressure Systems for Ejection of 
			Picoliter Volumes in Cell Research</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="214">Razor blade</td>
			<td class="xl20" style="width:140pt" width="187">Gillette</td>
			<td class="xl20" style="width:155pt" width="206">74-S</td>
			<td class="xl20" style="width:210pt" width="280">FLYING EAGLE</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="214">Video monitor</td>
			<td class="xl20" style="width:140pt" width="187">Panasonic</td>
			<td class="xl20" style="width:155pt" width="206">WV-BM 1410</td>
			<td class="xl20" style="width:210pt" width="280"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="214">502 Glue</td>
			<td class="xl20" style="width:140pt" width="187">Deli</td>
			<td class="xl18" style="width:155pt" width="206">7146</td>
			<td class="xl20" style="width:210pt" width="280">Cyanoacrylate Glue</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="214">Peristaltic pump</td>
			<td class="xl20" style="width:140pt" width="187">Shanghai JIA PENG Corporation</td>
			<td class="xl20" style="width:155pt" width="206">BT100-1F</td>
			<td class="xl20" style="width:210pt" width="280"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="214">Video Camera</td>
			<td class="xl20" style="width:140pt" width="187">Olympus America Medical</td>
			<td class="xl20" style="width:155pt" width="206">OLY-150</td>
			<td class="xl20" style="width:210pt" width="280"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="214">Transfer Pipets</td>
			<td class="xl18" style="width:140pt" width="187">Biologix</td>
			<td class="xl18" style="width:155pt" width="206">30-0138A1</td>
			<td class="xl20" style="width:210pt" width="280"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-cell currents induced by puff application of gaba in brain slices

ניהול תרופתי הוא נפוץ בעת עריכת תיקון שלם-תא-הקלטה לפרוסות המוח קלאמפ. אחת השיטות הטובות ביותר של יישום סמים במהלך ההקלטה אלקטרופיזיולוגיות היא הטכניקה פאף, אשר יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של ריאגנטים תרופתי על הפעילות העצבית במוח פרוסות. היתרון הגדול ביותר של יישום פאף הוא כי ריכוז התרופה סביב האתר הקלטה מגביר במהירות, ובכך למנוע הפחתת רגישות של קולטני ממברנה. שימוש מוצלח של יישום עלים כרוך תשומת-לב רבה הרכיבים הבאים: ריכוז התרופה, הפרמטרים של micropipette עלים, המרחק בין הקצה של micropipette עלים, נוירון מוקלט, וכן את משך הזמן ואת הלחץ נהיגה אצלם (פאונד לאינץ ' מרובע, psi). מאמר זה מתאר הליך שלב אחר שלב עבור הקלטה זרמים שלמים-תא המושרה על-ידי נשיפת גאמא אמינו בוטירית (GABA) אל נוירון פרוסת קליפת המוח הקדם חזיתית. ראוי לציין, ניתן להחיל את ההליך עם שינויים מזעריים באזורים אחרים במוח כגון ההיפוקמפוס סטריאטום את, תכשירים שונים, כגון תרביות תאים.

הטכניקה עלים מאפשר לחוקרים לחקור את השפעת הסמים על קולטנים מסוימים על פני השטח של נוירון מסוים. במאמר זה, אנו מתמקדים זרמי מתווך על ידי קולטני GABA. איור 1 מציג את micropipettes הקלטה של עלים. כדי למנוע השפעה על נוירונים מוקלטות של הלחץ הפיזי שנוצר על ידי והגראס, חנה המבר ומשמשים פחזניות סוכרוז (איור 2א) כפקדים. התגובה המושרה על ידי שאיפה גאבא (שחור) יכול להיחסם על ידי מעכב קולטן GABA, כגון picrotoxin כמו שדווח10, ואילו התנאי בסיסית יכול להיות התאושש על ידי חנה המבר שטיפת-אאוט (כחול), כפי שמוצג באיור 2B. ראוי לציין, לא של חנה המבר ולא פולטת סוכרוז גורם לתגובה, רומז כי תגובות המושרה על ידי GABA פחזניות הן פיזיולוגיות, מתווכת על ידי קולטני GABA הממוקם על פני השטח של התא המוקלט. עקומות תגובת המינון ומשך עלים מוצגים באיור3.
LPS הוכח לשנות את הפעילות העצבית והתנהגות בעלי חיים, אך השפעתו על תגובות בתיווך קולטן GABA היה לא ידוע. כאשר אנו משווים את הזרם המושרה על ידי GABA פחזניות פרוסות המוח של הזרקת LPS ועכברים שליטה ברכב, אנו מבחינים amplitudes IPSC מופחתת באופן משמעותי עקב טיפול LPS (איור 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56387/56387fig1.jpg"> 
איור 1 . דיאגרמה של האלקטרודה micropipette הקלטה של עלים.  
(א) המרחק בין עלים הקלטה micropipettes. (ב') את micropipette עלים (משמאל), האלקטרודה הקלטה (מימין) על פני השטח של פרוסה המוח. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56387/56387fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56387/56387fig2.jpg"> 
איור 2 . Picrotoxin המצור IPSC המושרה על ידי GABA עלים.  
(א) נשיפת חנה המבר וסוכרוז (50 מיקרומטר) גורם ללא תגובה. (B) נשיפת 50 מיקרומטר גאבא המניע של IPSC (שחור) (פחזנית משך = 200 ms, 4-6 psi) בחנה המבר המכיל TTX (1 מיקרומטר), CNQX (20 מיקרומטר) ו AP5 (50 מיקרומטר) כדי לחסום את פוטנציאל פעולה ומעודכנים סינאפסות מתווך על ידי קולטנים אמפא ו- NMDA. IPSC GABA-induced חסומה על-ידי יישום אמבט של מעכב קולטן GABA, 100 picrotoxin מיקרומטר (אדום). IPSC שחזור לאחר שטיפת-אאוט של picrotoxin. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56387/56387fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56387/56387fig3.jpg"> 
איור 3 . עקומות תגובת המינון ומשך עלים.  
(א) מדגם IPSCs המושרה על ידי 10, 50 ו- 100 מיקרומטר גאבא (פחזנית משך = ms 50, 4-6 psi). (B) עלים-משך התגובה עקומות. שחור, n = 11; . רד, n = 8; כחול, n = 10; להתאים פולינום. הנתונים מוצגים כאמצעי של ניסויים מרובים (8 ≤ n ≤11); קווי שגיאה מציינים ב- SEM. (ג) הזרמים חוזרים עורר על ידי GABA פחזניות (50 מיקרומטר) במרווחים הבין-עלים של s 1, 2 או 3 (פחזנית משך = ms 100, 4-6 psi). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56387/56387fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56387/56387fig4.jpg"> 
איור 4 . eIPSC משרעת מצטמצם בעכברים הזרקת LPS לעומת הרכב שולט. נשיפת גאבא המניע של משרעת IPSC מופחתת באופן משמעותי בהזרקת LPS לעומת שליטה נוירונים (תמיסת מלח, הרשות הפלסטינית ± 1.93 19.74/pF; LPS, הרשות הפלסטינית ± 1.30 14.10/pF; p = 0.02). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56387/56387fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>חומר</td>
			<td>גר'/מול</td>
			<td>ריכוז (מ מ)</td>
			<td>משקל (g/L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>58.443</td>
			<td>119</td>
			<td>6.9547</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אשלגן כלורי</td>
			<td>74.551</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.1864</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2PO NaH4</td>
			<td>137.99</td>
			<td>1</td>
			<td>0.1380</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>84.007</td>
			<td>26.2</td>
			<td>2.2010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>120.366</td>
			<td>1.3</td>
			<td>0.1565</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-גלוקוז</td>
			<td>198.17</td>
			<td>11</td>
			<td>2.1799</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>110.98</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.2775</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1. חנה המבר הקלטה.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>חומר</td>
			<td>גר'/מול</td>
			<td>ריכוז (מ מ)</td>
			<td>משקל (g/L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אשלגן כלורי</td>
			<td>74.551</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.1864</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>95.211</td>
			<td>7</td>
			<td>0.6665</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2PO NaH4</td>
			<td>137.99</td>
			<td>1.25</td>
			<td>0.1725</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>84.007</td>
			<td>25</td>
			<td>2.1002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline· Cl</td>
			<td>139.63</td>
			<td>115</td>
			<td>16.0575</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-גלוקוז</td>
			<td>198.17</td>
			<td>7</td>
			<td>1.3872</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>110.98</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.0555</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
בטבלה 2. פתרון חיתוך פרוסה.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>חומר</td>
			<td>גר'/מול</td>
			<td>ריכוז (מ מ)</td>
			<td>משקל (g/L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cs gluconate</td>
			<td>328.052</td>
			<td>100</td>
			<td>32.8052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>168.36</td>
			<td>5</td>
			<td>0.8418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>238.301</td>
			<td>10</td>
			<td>2.3830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>95.211</td>
			<td>2</td>
			<td>0.1904</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>110.98</td>
			<td>1</td>
			<td>0.1110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAPTA</td>
			<td>476.43</td></tr></tbody></table>3
			<td>11</td>
			<td>5.2408</td>
		
		<tr>
			<td>נה2ATP</td>
			<td>551.1</td>
			<td>4</td>
			<td>2.2044</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>נה2GTP</td>
			<td>523.2</td>
			<td>0.4</td>
			<td>0.2093</td>
		</tr>
	

בטבלה 3. פתרון פנימי עבור תיקון כל-תא הקלטות.

Watch this Scientific Journal Video about Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices at JoVE.com

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

זרמים שלמים-תא המושרה על ידי יישום עלים של GABA במוח פרוסות

אנו מתארים את הטכניקה פאף, שלפיו ריאגנטים תרופתי יכול להינתן במהלך ההקלטה תאים כל תיקון-קלאמפ, להאיר היבטים שונים של תכונות חיוניות להצלחתו.

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

whole-cell-currents-induced-puff-application-gaba-brain

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.3K Views.  South China Normal University. אנו מתארים את הטכניקה פאף, שלפיו ריאגנטים תרופתי יכול להינתן במהלך ההקלטה תאים כל תיקון-קלאמפ, להאיר היבטים שונים של תכונות חיוניות להצלחתו.

Video: Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, respectively 4,5,6,7 The GABAA channel is a pentameric GABA-gated chloride channel. The channel subunits are grouped into 8 families (&alpha;1-6, &beta;1-3, &gamma;1-3, &delta;, &#949;, &theta;, &pi; and &rho;). Two alphas, two betas and one 3rd subunit form the functional channel 8. By combining studies of sub-type specific GABA-activated single-channel molecules with studies including all populations of GABAA channels in the neuron it becomes possible to understand the basic mechanism of neuronal inhibition and how it is modulated by pharmacological agents.
We use the patch-clamp technique 9,10 to study the functional properties of the GABAA channels in alive neurons in hippocampal brain slices and record the single-channel and whole-cell currents. We further examine how the channels are affected by different GABA concentrations, other drugs and intra and extracellular factors. For detailed theoretical and practical description of the patch-clamp method please see The Single-Channel Recordings edited by B Sakman and E Neher 10.

We use the patch-clamp technique to measure GABA-activated single-channel currents (GABAA channels, GABAA receptors) and the synaptic and tonic currents they generate in neurons. Activation of the channels decreases neuronal excitability in health and disease 1,2,3,4.

GABA המופעל זרמים ערוץ בודד וטוניק פרוסות המוח עכברוש

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, ...

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent neuropsychiatric disorder that stems from the biophysical and cellular actions of nicotine on nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) throughout the central nervous system. Understanding the various nAChR subtypes that exist in brain areas relevant to nicotine addiction is a major priority.
Experiments that employ electrophysiology techniques such as whole-cell patch clamp or two-electrode voltage clamp recordings are useful for pharmacological characterization of nAChRs of interest. Cells expressing nAChRs, such as mammalian tissue culture cells or Xenopus laevis oocytes, are physically isolated and are therefore easily studied using the tools of modern pharmacology. Much progress has been made using these techniques, particularly when the target receptor was already known and ectopic expression was easily achieved. Often, however, it is necessary to study nAChRs in their native environment: in neurons within brain slices acutely harvested from laboratory mice or rats. For example, mice expressing "hypersensitive" nAChR subunits such as &alpha;4 L9&prime;A mice 1 and &alpha;6 L9&prime;S mice 2, allow for unambiguous identification of neurons based on their functional expression of a specific nAChR subunit. Although whole-cell patch clamp recordings from neurons in brain slices is routinely done by the skilled electrophysiologist, it is challenging to locally apply drugs such as acetylcholine or nicotine to the recorded cell within a brain slice. Dilution of drugs into the superfusate (bath application) is not rapidly reversible, and U-tube systems are not easily adapted to work with brain slices.
In this paper, we describe a method for rapidly applying nAChR-activating drugs to neurons recorded in adult mouse brain slices. Standard whole-cell recordings are made from neurons in slices, and a second micropipette filled with a drug of interest is maneuvered into position near the recorded cell. An injection of pressurized air or inert nitrogen into the drug-filled pipette causes a small amount of drug solution to be ejected from the pipette onto the recorded cell. Using this method, nAChR-mediated currents are able to be resolved with millisecond accuracy. Drug application times can easily be varied, and the drug-filled pipette can be retracted and replaced with a new pipette, allowing for concentration-response curves to be created for a single neuron. Although described in the context of nAChR neurobiology, this technique should be useful for studying many types of ligand-gated ion channels or receptors in neurons from brain slices.

In this paper, we describe a useful method to study ligand-gated ion channel function in neurons of acutely isolated brain slices. This method involves the use of a drug-filled micropipette for local application of drugs to neurons recorded using standard patch clamp techniques.

יישום מקומי של תרופות לללמוד לתפקד קולטן אצטילכולין ניקוטינית בפרוסות מוח עכבר

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

הקלטות תא כל לזווג בפרוסות בהיפוקמפוס Organotypic

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenetic Dissection של מעגלי פחד פרוסות המוח

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a challenging and low-throughput technique due to its complexity and high reliance on user operation and control. This manuscript demonstrates an image-guided automatic patch clamp system for in vitro whole-cell patch clamp experiments in acute brain slices. Our system implements a computer vision-based algorithm to detect fluorescently labeled cells and to target them for fully automatic patching using a micromanipulator and internal pipette pressure control. The entire process is highly automated, with minimal requirements for human intervention. Real-time experimental information, including electrical resistance and internal pipette pressure, are documented electronically for future analysis and for optimization to different cell types. Although our system is described in the context of acute brain slice recordings, it can also be applied to the automated image-guided patch clamp of dissociated neurons, organotypic slice cultures, and other non-neuronal cell types.

This protocol describes how to conduct automatic image-guided patch-clamp experiments using a system recently developed for standard in vitro electrophysiology equipment.

יישום אוטומטי של תמונה מודרך תיקון מהדק לחקר נוירונים של פרוסות המוח

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

הערכה של צפיפות סינפסה פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

הכנה של חוט השדרה חריפה פרוסות תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה בנוירונים הסובסטנציה Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...