מחקר זה מומן על ידי קרנות ההפעלה Southwestern UT (SK).

<ol>
	<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres.">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li><li>Cahalan, M., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques:+an+overview.">Patch clamp techniques: an overview.</a> Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).</li><li>Staley, K. J., Otis, T. S., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+properties+of+dentate+gyrus+granule+cells:+comparison+of+sharp+microelectrode+and+whole-cell+recordings.">Membrane properties of dentate gyrus granule cells: comparison of sharp microelectrode and whole-cell recordings.</a> J Neurophysiol. 67 (5), 1346-1358 (1992).</li><li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method.">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).</li><li>Pusch, M., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+diffusional+exchange+between+small+cells+and+a+measuring+patch+pipette.">Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette.</a> Pflugers Arch. 411 (2), 204-211 (1988).</li><li>Kandel, E. R., Dudai, Y., Mayford, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+systems+biology+of+memory.">The molecular and systems biology of memory.</a> Cell. 157 (1), 163-186 (2014).</li><li>Kourrich, S., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Synaptic+and+Neural+plasticity.">Chapter 5: Synaptic and Neural plasticity.</a> Neurobiology of Mental Illness. 4th edn. , (2013).</li><li>Mozzachiodi, R., Byrne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+synaptic+plasticity:+role+of+nonsynaptic+plasticity+in+learning+and+memory.">More than synaptic plasticity: role of nonsynaptic plasticity in learning and memory.</a> Trends Neurosci. 33 (1), 17-26 (2010).</li><li>Zhang, W., Linden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+other+side+of+the+engram:+experience-driven+changes+in+neuronal+intrinsic+excitability.">The other side of the engram: experience-driven changes in neuronal intrinsic excitability.</a> Nat Rev Neurosci. 4 (11), 885-900 (2003).</li><li>Kourrich, S., Calu, D. J., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+plasticity:+an+emerging+player+in+addiction.">Intrinsic plasticity: an emerging player in addiction.</a> Nat Rev Neurosci. 16 (3), 173-184 (2015).</li><li>Luscher, C., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-evoked+synaptic+plasticity+in+addiction:+from+molecular+changes+to+circuit+remodeling.">Drug-evoked synaptic plasticity in addiction: from molecular changes to circuit remodeling.</a> Neuron. 69 (4), 650-663 (2011).</li><li>McEwen, B. S., Morrison, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+on+stress:+vulnerability+and+plasticity+of+the+prefrontal+cortex+over+the+life+course.">The brain on stress: vulnerability and plasticity of the prefrontal cortex over the life course.</a> Neuron. 79 (1), 16-29 (2013).</li><li>Sandi, C., Haller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+the+social+brain:+behavioural+effects+and+neurobiological+mechanisms.">Stress and the social brain: behavioural effects and neurobiological mechanisms.</a> Nat Rev Neurosci. 16 (5), 290-304 (2015).</li><li>Kim, S. J., Linden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitous+plasticity+and+memory+storage.">Ubiquitous plasticity and memory storage.</a> Neuron. 56 (4), 582-592 (2007).</li><li>Ganguly, K., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neural+plasticity+from+bench+to+bedside.">Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside.</a> Neuron. 80 (3), 729-741 (2013).</li><li>Kullmann, D. M., Moreau, A. W., Bakiri, Y., Nicholson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+inhibition.">Plasticity of inhibition.</a> Neuron. 75 (6), 951-962 (2012).</li><li>Bar-Yehuda, D., Korngreen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Space-clamp+problems+when+voltage+clamping+neurons+expressing+voltage-gated+conductances.">Space-clamp problems when voltage clamping neurons expressing voltage-gated conductances.</a> J Neurophysiol. 99 (3), 1127-1136 (2008).</li><li>Williams, S. R., Mitchell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+somatic+voltage+clamp+errors+in+central+neurons.">Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons.</a> Nat Neurosci. 11 (7), 790-798 (2008).</li><li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments.">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods Enzymol. 207, 123-131 (1992).</li><li>Defelice, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electrical Properties of Cells-Patch Clamp for Biologists. , (1997).</li><li>Kornreich, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+patch+clamp+technique:+principles+and+technical+considerations.">The patch clamp technique: principles and technical considerations.</a> J Vet Cardiol. 9 (1), 25-37 (2007).</li><li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , (2003).</li><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+patch+clamp+technique.">The patch clamp technique.</a> Sci Am. 266 (3), 44-51 (1992).</li><li>Richerson, G. B., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing.">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Exp Neurol. 131 (1), 133-143 (1995).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> J Neurosci Methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li><li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices:+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons.">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> J Neurosci Methods. 158 (2), 251-259 (2006).</li><li>Kourrich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+interaction+between+sigma-1+receptor+and+Kv1.2+shapes+neuronal+and+behavioral+responses+to+cocaine.">Dynamic interaction between sigma-1 receptor and Kv1.2 shapes neuronal and behavioral responses to cocaine.</a> Cell. 152 (1-2), 236-247 (2013).</li><li>Kourrich, S., Klug, J. R., Mayford, M., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPAR-Independent+Effect+of+Striatal+aCaMKII+Promotes+the+Sensitization+of+Cocaine+Reward.">AMPAR-Independent Effect of Striatal aCaMKII Promotes the Sensitization of Cocaine Reward.</a> J Neurosci. , (2012).</li><li>Kourrich, S., Rothwell, P. E., Klug, J. R., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine+experience+controls+bidirectional+synaptic+plasticity+in+the+nucleus+accumbens.">Cocaine experience controls bidirectional synaptic plasticity in the nucleus accumbens.</a> J Neurosci. 27 (30), 7921-7928 (2007).</li><li>Kourrich, S., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+neurons,+opposite+adaptations:+psychostimulant+experience+differentially+alters+firing+properties+in+accumbens+core+versus+shell.">Similar neurons, opposite adaptations: psychostimulant experience differentially alters firing properties in accumbens core versus shell.</a> J Neurosci. 29 (39), 12275-12283 (2009).</li><li>Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+novelty+causes+stress-like+adaptations+at+nucleus+accumbens+synapses:+implications+for+studying+addiction-related+plasticity.">Environmental novelty causes stress-like adaptations at nucleus accumbens synapses: implications for studying addiction-related plasticity.</a> Neuropharmacology. 61 (7), 1152-1159 (2011).</li><li>Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+adaptations+in+the+nucleus+accumbens+caused+by+experiences+linked+to+relapse.">Synaptic adaptations in the nucleus accumbens caused by experiences linked to relapse.</a> Biol Psychiatry. 69 (11), 1124-1126 (2011).</li><li>Koya, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+synapses+in+selectively+activated+nucleus+accumbens+neurons+following+cocaine+sensitization.">Silent synapses in selectively activated nucleus accumbens neurons following cocaine sensitization.</a> Nat Neurosci. 15 (11), 1556-1562 (2012).</li><li>Conrad, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+accumbens+GluR2-lacking+AMPA+receptors+mediates+incubation+of+cocaine+craving.">Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving.</a> Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).</li><li>Kruskal, P. B., Jiang, Z., Gao, T., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+patch+clamp:+nanotechnologies+for+intracellular+recording.">Beyond the patch clamp: nanotechnologies for intracellular recording.</a> Neuron. 86 (1), 21-24 (2015).</li><li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale-targeted+patch-clamp+recordings+of+functional+presynaptic+ion+channels.">Nanoscale-targeted patch-clamp recordings of functional presynaptic ion channels.</a> Neuron. 79 (6), 1067-1077 (2013).</li></ol>

יש אף אחד מהמחברים אינטרסים מתחרים או אינטרסים מנוגדים.

פרוטוקול זה מתאר את ההליך הבסיסי ביצוע ניסויים תיקון- clamp כל תא על נוירונים פרוסות המוח. עם זאת, המורכבות, הפוטנציאל והרגישות של הטכניקה הזו לא יכולים להיות מתוארת בצורה מושלמת במאמר זה. הנה, יש לנו ניסינו להתוות את הצעדים הבסיסיים ביותר מדגיש פרמטרים חשובים חייבים להיות מבוקר להשגת הקלטות מוצלחות וקפדניות כל תא. ללמידה תיאורטיים נוספים, ספרים ומאמרים רבים פורסמו בשני הקלטה כל תא תיקון- clamp פרוסות המוח 3,21-24 ועל שיטות שיכולות לשפר את פתרונות המשמשים 25-27 כדי לשפר את כדאיות התא. על מנת לבצע הקלטות ראויות שגרתי, שיפור מיומנויות טכניות באמצעות תרגול אינטנסיבי נדרש. אף על פי כן, עם יישום נכון של השלבים שהוזכרו, תאים יכולים להיות תוקנו שעות שלאחר המוות, מתן מידע חשוב על שינויים פונקציות הסינפטי excitabi מהותיlity. באופן כללי, מלבד החשיבות של הכנה הוא פתרונות ACSF בזהירות micropipette הפנימי, כל שלב מן לנתיחת המוח, חיתוך, השיג תצורה כל תא מוצלחת, וקבלת נתונים קפדניים ובלתי משוחדים דורש תרגול אינטנסיבי. בראש ובראשונה, הוא קריטי כדי לייצר פרוסות מוח בריאות. בקצרה, דיסקציה המהירה של המוח (באופן אידיאלי &lt;45 שניות), החזקת טמפרטורה נמוכה (2 - 0 ° C) בזמן שחתך, ופתרונות חיתוך מתאים לכל תפקיד חשוב בהבטחת בריאות התא. ראוי לציין להזכיר כי פתרונות חיתוך עשויים להיות שונים בין מעבדות בהתאם לסוג התא ו / או אזור במוח כי ייחקר. כאשר מפלחים את הסטריאטום NAC או הגבה, המעבדה ואחרים שלנו להשתמש בחומצת kynurenic לפתרון החיתוך למזער תהליכי excitotoxic 28-33, לעומת זאת, שיטות אחרות יכולים לשמש גם, כגון פתרונות מבוססים סוכרוז 34, גבוה Mg 2+ </sup&gt; / פתרונות Ca 2 + נמוך 35, וכו &#39;. אלו הן רק כמה דוגמאות יכולות להיות מותאמות על פי הרגישות באזור המוח או מוח לתהליכי excitotoxic (למשל, עקב גיל). למידע נוסף על פתרונות כדאיים תא, עיין 25-27. בסופו של דבר, את הריכוז של אניונים, קטיונים, וסמים אחרים (למשל, ascorbate, אנטגוניסטים לקולטן גלוטמט) שמרכיבים פתרונות חיתוך נקבע כך שהוא מחק נוזל השדרתי וממזער ככל תהליכי excitotoxic אפשריים המתרחשים במהלך חיתוך. הפרוטוקול המובא במאמר זה מתאר פתרונות סטנדרטיים שהיו בשימוש שיגרתי במחקרים הקודמים של מחברי 28-31 כאשר הקלטה מ MSNs ב NAC או בסטריאטום הגבה פרוסות מוח. יתר על כן, התאמה נכונה של osmolarity הן פתרונות ACSF ו micropipette פנימי הן קריטיות עבור היווצרות חותם מוצלח ותחזוקה של conf כל תאiguration. כדי ליצור מפל ריכוזים מפתרון תאי פתרון התוך-פיפטה, osmolarity ACSF צריך להיות גבוה יותר עבור פתרונות micropipette פנימיים. באופן אידיאלי, ההבדל יכול לנוע בין 10 ל 30 mOsm. השיג תצורה כל תא מוצלחת הוא צעד חשוב נוסף עבור ביצוע הקלטות יעילות. ראשית, קיבול פיפטה יכול להיות מותאם פעם פיפטה להציב באמבטיה. למרות בהגדרות אוטומטיות בדרך כלל מוגדרות כהלכה, רצוי להשתמש התאמות מהירות ואיטיות של קיבול תא בזהירות כמו אלה עלולים לגרום ניזק לתא כאשר לא בצעו כראוי. שנית, יניקת קרום קצרה כי יש צורך לקרוע את הקרום יוביל פתח משמעותי של הקרום, ובכך לאפשר תקשורת טובה בין תאיים המילייה-micropipette התוך. פעולה זו תבטיח כי s R יישאר יציב יחסית לאורך כל ההקלטה. אם באמצעות פתרון micropipette מבוסס Cs,פוטנציאל נח הממברנה יש לבחון מיד עם הקמתה של תצורת כל תא (ראה שלב 5.8). ואכן, דיפוזיה של Cs + בתוך התא גורמת לאובדן פוטנציאל נח הממברנה. כדי לקבוע את פוטנציאל המנוחה הנכון, פוטנציאל צומת הנוזלים חייב להיות מוערך 20. עם זאת, הנסיין יכול לדווח על מתח המנוחה כי הוא ציין לאחר שבירת הממברנה (לאחר שלב 5.8) ולבחור לא להתאים עבור פוטנציאל צומת נוזלים. בכל המקרים, הוא חייב להיות מוזכר בסעיף השיטה של ​​המאמר. עם הקמתה של תצורת כל תא, C p יכול גם להיות מושגת והוא יכול לשמש כפרמטר עקיף להעריך בריאות התא ו / או סוג תא. שלישית, כאשר הקלטות החלו, ופרמטרים נוספים חייבים להיות פיקוח קפדני. גורמים קריטיים כי חייב להיות מבוקר כי בעת בחינת רגישות עצבית הם טמפרטורה, R s, ו- R i. כפי ששהוזכרו לעיל, R i ו- C p יכול להיות מעיד על בריאות התא ו / או סוג תא. לדוגמה, קרום הפלזמה, מתנהג כמו כמבודד, מפריד תשלום (הנובעות הרכב שונה של תאיים ופתרונות תאיים), אשר יחד מהווים את קיבול הממברנה. ככל שעולה משטח הממברנה (עצבי ספציפי), גבוה יותר את קיבול. זהו אז אין פלא כי p C תערוכת סוגים ספציפי עצביים R i (קשור מתמטי C p) כי הם בתוך אותו הטווח. R הים קשור ישירות לגודל של קצה פיפטה, ולכן בדרך כלל מעיד על האיכות או הגודל של פתיחת קרום. בקצרה, על הקמת תצורה כל תא, בציטופלסמה הופכת חשמלי רציפה עם הפתרון של micropipette ומבודד לחלוטין מן המדיום החיצוני. S R (או R) מקורו בהתנגדות עבור current לזרום פיפטה הציטופלסמה. עבור כמה תנאי הקלטה (למשל, במצב נוכחי מהדק או הקלטת מתח- clamp של זרמי יון מגודר מתח), R s חייב להיות מתוגמל כראוי (עיין Ref. 3,21-24 או הוראות שימוש במגבר לפיצוי של R היאות) . כמתואר באיור 4, R s חשוב במיוחד כפי שהוא יכול להשפיע על צורת גל האות החשמלי דרמטי, למשל, משרעת EPSC. אף על פי כן, R s חייב להיות במעקב צמוד לפרשנויות off-line של כל ההשפעות שנצפו. במקרה הממברנה טרם מהקרע כראוי, סתימת קצה micropipette או מחדש סגירת הקרום עלול להתרחש, ובמקרה העליות של R והטיית צורת הגל של האות החשמלי נחקר (איור 4 ב-ד). לסיכום, בעיות רבות ניתן נתקלו בעת הקלטה, ואלה בדרך כלל נופלים תחת שלוש קטגוריות: i) רקמות הקשורות, למשל, עליה בשיעור תמותת תאים עקב דיסקציה עניה, חוסר הסתגלות של osmolarity ACSF, היפוקסיה; ii) הקשורה ציוד, למשל, בעיות רעש הארקה, בקרת טמפרטורה, פורסים לפרוסות micropipette מיצוב, וכו.; פרשנות נתונים ו- III), למשל, שינויים שנצפתה יכולים להיות התוצאה של חפצי ניסיוני רצויי הטיית הנתונים כמו שינויי פרמטרים משני-גל חשמליים (R i, R s, טמפרטורה, ראה איור 3 ו -4) ולא התוצאה של ניסוי מניפולציות. למרות הקלטה כל תא פרוסות מוח הנה טכניקה להערכת פלסטיות תלוית ניסיון, גישה זו מגבילה את הפרשנות של נתונים. בפרט, שלוש מגבלות חשובות של טכניקת הקלטה כל תא הם כי: (i) שינויים ברמות תפקוד והביטוי של חלבונים ספציפיים (למשל, תעלות יונים) לא ניתן להבחין; (Ii) כי זהטכניקת מעריך זרימת זרם דרך הממברנה כולה (או חלק ניכר), הוא אינו מספק לוקליזציה משנה הסלולר מדויקת של זרמים היוניים או השינויים כי הם נצפו; הפולשנות וכן (iii) של תצורה כל תא מובילה הדיאליזה של תוכן התא, ובכך שיבוש המנגנון מולקולרי תאי צורך לתופעות כמה לפתח או להתבטא. אחת דרכים למנוע דיאליזה היא להשתמש הקלטות אלקטרודה חדות או טכניקת התיקון המחוררת 3,21,23. לגבי מולקולות אנטיביוטי האחרון, יוצרי הנקבוביות כגון nystatin ניתן להוסיף את הפתרון פיפטה. כינונה של הנקבוביות הללו תאפשר הקלטה של ​​זרמים מבלי לשבש את מנגנוני השליח השני בתוך התא. עם זאת, התקדמות האחרונות בננוטכנולוגיה והתפתחות nanoelectrodes 36 לספק כלים רבי עוצמה לשיפור ההקלטות עצביים. קידמה טכנולוגית כזה במדעי המוח עדיין תחת development ועכשיו מכניס להשגתנו את האפשרות לבצע תיקון- clamp והקלטות תאיות עם הפולשנות מינימאלי, כלומר, שמירה על הסביבה התאית ללא פגע, ואת חוקר את הפונקציות של תעלות יונים בתוך תאי משנה הסלולר שהיו עד כה לא נגישים עם קלסי תיקון- clamp אלקטרודות 37.

טכניקת תיקון- clamp, טכניקת אלקטרו אשר פותחה בסוף שנתי ה -1970 1,2, היא כלי עיקרי ללימוד פונקציות ערוץ יון בודדים או מספר רבות של רקמת חיה. בין תצורות תיקון השונות שניתן להשיג, כל תא הקלטות תיקון- clamp לאפשר בחקר ההתנהגות החשמלית של חלק ניכר של הנוירון. קלאסי, טכניקה זו מבוצעת במבחנה או על פרוסות המוח, נוירונים ניתק טרי, או על מודלים תרבית תאים 3. כאשר מבוצע על נוירונים פרוסות המוח, טכניקה זו מציגה מספר יתרונות. בפרט: (i) נוירונים נרשמים מעגלים במוח נשמרו יחסית כי במידה מסוימת, ולעומת הכנות תרבית תאים, לספק סביבה כי היא פיזיולוגית 3 רלוונטית. זה מאפשר לכיד מוקדם, או אפילו ניטור בזמן אמת, אירועים תאיים ומולקולריים שמופעלים על ידי כל סוג של pharmacolog החריפהמניפולציות iCal - החלטה זמנית כי לא יכול להיות מושגת באמצעות קלסי בתנאי vivo; (ii) יכולת לזהות באופן ויזואלי איזורים במוח אצל פרוסות מוח מאפשרת סגולי תיכון אזורי 3 הם באזור המוח למד נוירונים ספציפיים כשהם מבטאים סמני ניאון; (iii) גישה למרחב התאי של התא על ידי פתיחת חלק ניכר של קרום הפלזמה (בניגוד ניקוב הקרום עם micropipette חדה להקלטות תאיות) 4. לעומת זאת, זה מאפשר את התוכן או הריכוז של יונים ספציפיים להלחין הפתרון הפנימי להיות שונה כל כך מטרות מולקולריות או מנגנונים תאיים ניתן ללמוד בתנאים שונים. לדוגמה, על הקמת תצורה כל תא, כל סוכן תרופתי ספציפי (למשל, אנטגוניסטים) כי אחד יכול להוסיף את micropipette הקלטה (פיפטה תיקון) פתרון יהיה מפוזר ישירות לתוך הציטופלסמה ולפעול על putat שלהive מטרות תאיות מבלי לשנות את פונקצית יעד תאי שכנים. בנוסף, לעומת הקלטת micropipette חדה, הפתיחה הגדולה בקצה האלקטרודה מהדק תיקון מספקת התנגדות נמוכה, פחות רעש מתחרות, ולכן גישת חשמל טובה יותר לחלק הפנימי של התא 4. עם זאת, יש לציין כי הפתח הגדול בקצה פיפטה עלול להוביל דיאליזת תא, ובכך אובדן המנגנון מולקולרי תאי שעשויה להיות קריטי עבור הביטוי של התופעות הביולוגיות שאינן תחת 5,6 מחקר. במקרה זה, הקלטות אלקטרודה חד עשויות להיות מתאימות יותר. סוג זה של הקלטות דורש micropipettes עם נקבוביות כי הוא הרבה יותר מאלו המשמשים להקלטות כל תא, ובכך למנוע את רוב חילוף היונים בין שטח תאיים הפתרון פיפטה הפנימי. כל צורה של ניסיון (אקוטי או כרוני), כולל לימוד 7-10, חשיפה לתרופות של התעללות 11,12, מתח 13,14, וכו &#39;, יכול לשנות היבטים שונים של תפקוד עצבי באזורי מוח ספציפיים. בגלל שינויים אלה לעתים קרובות דורשים זמן לפתח (שעות עד ימים), כל תא הקלטות פרוסות מוח מחיות שעברו חוויה ספציפית מאפשרות לחוקרים לזהות את השינויים האלה. בעיקרון, רב (אם לא כל) רכיבים להשתתף פונקציות עצביות (למשל, תעלות יונים המופעל ליגנד, תעלות יונים מגודרות מתח, מובילי הנוירוטרנסמיטר), ובכך מוח מעגל פעילות והתנהגות, ניתן לשנות על ידי ניסיון (ניסיון תלוי פלסטיות) 10,15-17. ברמה העצבית, פעילות במעגל המוח עולה מן האינטראקציות מתמידות בין הסינפטי (למשל, העברת גלוטמט) וגורם רגישות הסלולר מהותית (למשל, תעלות יונים הדנדריטים-axosomato: נתרן, Na +; אשלגן, K +; וסידן, Ca 2 + ). בתנאים ספציפיים באמצעות וולדואר התא תיקון- clamp טכניקות אלקטרו, שינויי אות שמקורם במיוחד משינויים הרגישים מהותי לעומת הסינפטי יכול להיות מבודד. ברוב המקרים, רגישות הסינפטי נבחנת באמצעות טכניקת מתח- clamp כל התא. מצב הקלטה זה מאפשר מדידה של זרמי יון [למשל, בתיווכו של קולטני חומצת α-אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-isoxazolepropionic ( קולטני AMPA) ואת הקולטנים חומצה N-Methyl-D-אספרטית (קולטני NMDA)] דרך הממברנה פלזמה העצבית תוך כדי לחיצה על פוטנציאל הממברנה במתח סט. הנה, הנסיינים להשתמש בפתרונות micropipette פנימיים המכילים צזיום (Cs +), חוסם רחב של K + ערוצים (גורמים רגישים מהותיים מפתח). עם הקמתה של תצורה כל תא, דיפוזיה של Cs + בחלל תאי תחסום K + ערוצים, ובכך תאפשר גם מהדק שטח יעיל יחסית וטרוםלפרוק השפעת הגורמים רגישים מהותיים על מדידות אחרות. סוגיות שטח מהדק, כלומר, קושי מתח- clamp התא כולו, להתעורר בעת הקלטת תאים בצורה סדירה (למשל, נוירונים), ובמיוחד נוירונים עם הדנדריטים עצומים ומורכב סוכת 18,19. כיוון שבקרות גרועות מהדק מתח סומטיים מתח בעץ הדנדריטים של נוירונים, היבטים שונים של אותות חשמליים הדנדריטים נחקרים מעוותים באופן מרחק תלויה הדנדריטים. בשילוב עם כלים תרופתיים כגון (חומצת גמא-aminobutyric, GABA אנטגוניסט לקולטן) picrotoxin או חומצת kynurenic (חוסם רחב של קולטני גלוטמט) מומסים הפתרון התאי (נוזל מלאכותי שדרת Cerebro, ACSF), טכניקה זו מאפשרת המדידה של גלוטמט receptor- ו GABA A R בתיווך זרמים בהתאמה. לעומת זאת, רגישות מהותית בדרך כלל נבחנת במצב הקלטה הנוכחית מהדקת.בניגוד הקלטת מתח- clamp, מצב הקלטה זו מאפשר המדידה של וריאציות פוטנציאלי קרום המושרים על ידי זרמי יון זורמים דרך קרום התא העצבי. בדרך כלל, שינוי ב רגישות מהותית נבחן באמצעות שינויי יכולת נוירונים כדי ליצור פוטנציאל פעולה, מחייב הוא Na + ו- K + ערוצים. לכן, בעת ביצוע הקלטות מהדק הנוכחי, micropipettes מלא פתרון פנימי המכיל K + במקום Cs +. בשילוב עם סוכנים תרופתיים החוסמות גלוטמט GABA A זרמי קולטן בתיווך מומס ACSF, תכנון הניסוי הזה מאפשר מדידת התרומה של גורמים פנימיים (למשל, K + ערוצים) כדי ירי עצבי מבלי מזוהם שינויים פוטנציאליים רגיש הסינפטי גורמים. מאמר זה יתאר את השלבים פרוצדורליים צורך בסיסי to (i) להכין פרוסות מוח בריאות; (Ii) להשיג תצורת כל תא, וכן (iii) לפקח פרמטרים בסיסיים להעריך הסינפטי רגיש מהותי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="689">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Isolated pulse stimulus generator</td>
			<td style="width:183px;">A.M.P.I</td>
			<td style="width:139px;">Master-8</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isolation unit (ISO-Flex)</td>
			<td>A.M.P.I</td>
			<td>ISO-Flex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Computer controlled Amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Acquisition system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chamber and in-line Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome Slicer</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaging Camera</td>
			<td>Q Imaging</td>
			<td>QIClick-F-M-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Narishige pipette puller PC-10</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW150F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slice hold-down (harp)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slice Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonmetallic syringe needle</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF28G67-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filters</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>176-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glue Gun</td>
			<td style="width:183px;">Home Depot</td>
			<td style="width:139px;">various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas dispersion tube</td>
			<td>Ace Glass Inc.</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Decapitation scissors</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>100649198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel Handle #3</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small straight sharp tips scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vessel canulation forceps&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curved hemostatic forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Economy Tweezers #3</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501976-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14357Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scooping spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-357Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-747B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter paper</td>
			<td>Lab Depot</td>
			<td>CFP1-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2&#8211;7.3, 280&#8211;290 mOsm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-gluconic acid 50%&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>G1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cesium-OH (CsOH) 50%&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>232041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl, 2.8 mM</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES, 20 mM</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA, 0.4 mM</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tetraethylammonium-Cl, 5 mM</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>T2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2GTP, 0.3 mM</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgATP, 2 mM</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">K-Gluconate internal solution (pH 7.2&#8211;7.3, 280&#8211;290 mOsm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K D-gluconate, 120 mM</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl, 20 mM</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES, 10 mM</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA, 0.2 mM</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2GTP, 0.3 mM</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgATP, 2 mM</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity &#8776; 300-310 mOsm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl, 2.5 mM</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl, 119 mM</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4-H20, 1 mM</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3, 26.2 mM</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose, 11 mM</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4-7H2O, 1.3 mM</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2-2H20, 2.5 mM</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Additional compounds used for solutions preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KOH</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich/various</td>
			<td style="width:139px;">K3375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-cell patch-clamp recordings in brain slices

הקלטה כל תא מהדק תיקון היא טכניקה אלקטרו המאפשרת חקר את התכונות החשמליות של חלק ניכר של הנוירון. בתצורה זו, את micropipette נמצא בקשר הדוק עם קרום התא, אשר מונע דליפה נוכחית ובכך מספק מדידות זרם יוניות מדויקות יותר מאשר שיטת הקלטת אלקטרודה חד התאית השתמשה בעבר. קלאסי, הקלטה כל תא יכול להתבצע על נוירונים בסוגים שונים של ההכנות, כולל דגמים תרבית תאים, נוירונים ניתק, נוירונים פרוסות המוח, בבעלי חיים שלמים בהרדמה או ער. לסיכום, טכניקה זו תרמה מאוד להבנת מאפייני biophysical פסיביים ואקטיביים של תאים להתרגש. יתרון עיקרי של שיטה זו הוא בכך שהוא מספק מידע על איך מניפולציות ספציפיות (למשל, תרופתית, הנסיין נגרמת פלסטיות) רשאיות לשנות פונקציות עצביות ספציפיות או גhannels בזמן אמת. בנוסף, פתיחה משמעותית של קרום הפלזמה מאפשרת פתרון פיפטה הפנימי לפזר בחופשיות לתוך הציטופלסמה, מתן אמצעים לתרופות מציגות, למשל, אגוניסטים או אנטגוניסטים של חלבונים תאיים ספציפיים, מניפולצית מטרות אלה מבלי לשנות את תפקידיהן תאי שכנים. מאמר זה יתמקד הקלטה כל התא מבוצע על נוירונים פרוסות מוח, הכנה כי יש את היתרון של קלטת הנוירונים מעגלים עצביים במוח השתמרות טובה יחסית, כלומר, בהקשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. בפרט, כאשר הוא משולב עם פרמקולוגיה מתאים, טכניקה זו היא כלי רב עצמה המאפשר זיהוי של neuroadaptations הספציפי שאירע לאחר כל סוג של חוויות, כגון למידה, חשיפה לתרופות של התעללות, ומתח. לסיכום, כל תא הקלטות תיקון- clamp פרוסות המוח לספק אמצעים למדוד כהכנה vivo לשעבר שינויים ארוכי טווחבפונקציות עצביות שהתפתח חיות ערות ללא פגע.

טמפרטורה, גורם נשלטת בקלות על ידי הנסיין, משפיע על מאפייני biophysical של תעלות יונים ו קולטנים, ובכך צורת הגל של זרמים פוסט-סינפטי (PSCs) (EPSC ו iPSCs) ואת היכולת של נוירונים לעורר קוצים. איור 3 ואיור 4 מראים את השפעת הטמפרטורה על הירי העצבי ושיפוע EPSCs עורר (eEPSCs) בהתאמה. דפוס ירי (איור 3) (כלומר, חביון ספייק 1 st, ספייק מספר, תדירות, ואת צורת הגל פוטנציאל פעולה) מעוצבת על ידי פתיחת מתוזמן ומתואם וסגירה של תעלות יונים מתח מגודרת ספציפיים (Na +, Ca 2 +, ו- K +), תהליך רגיש לטמפרטורה. איור 3 מראה כיצד מספר ספייק הממוצע עולה עם טמפרטורה. שימו לב כי תנאי הניסוי המתוארים כאן (קלטות MSNs) למרות freque ספייקncy לא נראה להשתנות בטמפרטורת subphysiological (28 מעלות צלזיוס), זה מגביר באופן משמעותי כאשר הטמפרטורה מגיעה רמה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית (32 מעלות צלזיוס). איור 4 א מציג דוגמא כיצד שיפוע eEPSCs, פרמטר זה משמש בדרך כלל כדי להעריך כוח הסינפטי, עולה עם הטמפרטורה. למרות R s ניתן לשלוט במידת מה על ידי הנסיין, כלומר, דרך פתח קרום יעיל כאשר מעבר ממדינה חותם לתצורת כל תא, R S בדרך כלל עולה בהדרגה במהלך ההקלטה. זה יכול להיות תוצאה של אירועים שונים בלתי נשלט, למשל, קרום מחדש הסגירה או פסולת שסתמו את קצה פיפטה במהלך ההקלטה. ניסיון לפתוח מחדש את הממברנה על ידי החלת יניקה קלה, על אף שהוא עלול לסכן את התיקון, לפעמים יכול לעזור לשמור על ים R יציב. בכל המקרים, בגלל השינויים של R יכולים אלter צורת הגל של האות החשמלי נחקר, זה חייב להיות במעקב צמוד, ובמיוחד בעת הקלטת PSCs (במצב מתח- clamp). איור 4 מראה שכאשר העליות של R (איור 4B), משרעת של זרמי קולטן בתיווך גלוטמט (eEPSCs פוחתת) (איור 4 ג &#39;, ד&#39;). בדרך כלל, הנסיינים להשליך את הנתונים כאשר שינויי R S יעלו על 15% (למשל, במעבדה זו), אולם כמה מעבדות לעשות זאת משינוי 20%. קריטריון זה יש לציין בסעיף השיטה של ​​המאמר. עבור נוירון מוגדר, R אני יכול להיות מושפע על ידי מספר גורמים, כולל טמפרטורה, בריאות התא, ואיכות התיקון. באופן ספציפי, כאשר R i פוחתת, אמפליטודות PSC או יכולת של נוירונים כדי ליצור קוצים גם פוחתת. לדוגמה, איור 4E מראה שכאשר R i אינו משתנה באופן משמעותי, המספר קוצי דואר להישאר יציב יחסית (Neuron 1); וכאשר R i עליות, מספר גדל קוצים כמו גם (Neuron 2). לכן ובדומה R הים, R i חייב להיות במעקב צמוד, כמו 10% שינויים מספיקים לנתוני משוא פנים. כפי שתואר לעיל, חשוב לשלוט או לפקח טמפרטורה, R s, ו- R i במהלך ההקלטות. לדוגמא, ציין שינויי האות כי הוא נחקר (PSCs או ירי) יכול להיות בגלל שינויים (או חוסר השליטה) של גורמים אלה במקום את ההשפעה של מניפולציות ניסיון, למשל, מראש מול שלאחר שפעת יישום אמבטיה התרופה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54024/54024fig1.jpg" /> מחוייט באיור 1. שחזור קאמרית (AD) ותמונה של פרוסת המוח באוניברסיטת 400X מציג בריא המלח נוירונים (E). מוֹדָעָה)הנוהל לעשות בחדר התאוששות מנהג מתואר בשלב 2.1. ה) תמונה של MSNs פגז המדיאלי NAC ב פרוסת מוח 400X הצגת דוגמאות של חיצים בריאים (אדום) לעומת נוירונים מתים (חיצים כחולים). שים לב כי למרות כמה תאים מסומנים כבריא, ההיבט הכדורי שלהם מצביע על כך שהם לא יכולים להיות בריאים כמו רצוי (חצים אדומים עם כוכביות). מצב בריאות סופי מוערך בהתבסס על שאר V ו- R i לאחר השיג תצורת כל תא. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54024/54024fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחצי כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54024/54024fig2.jpg" /> תרשים איור 2. מצייר את הצעדים פרוצדורליים הבסיסיים כדי השג Gigaseal ולבסס את תצורת Whole-cell. כאשר micropipette הוא קרוב מספיק כדי thתא דואר כדי ליצור גומה הממברנה (שלב 1, גישה), להחיל יניקה קצרה ועדינה ליצור קשר הדוק בין micropipette ואת קרום הפלזמה. אם בצע כראוי, המגע יחזק וההתנגדות תגדל ולהגיע 1 GΩ (gigaseal) או יותר (שלב 2, היווצרות חותמת). כאשר הסוגר יציב ומעל 1 GΩ, להחיל יניקה קצרה וחזקה כדי לקרוע את קרום התא (שלב 3, Whole-cell תצורה). השגת תצורת התא כולו יאפשר המשכיות בין הציטופלסמה לבין הפנים micropipette. לפרטים, ראה שלב פרוטוקול 5.1-5.8. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54024/54024fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54024/54024fig3.jpg" /> איור 3. עצבי ירי (Intrinsic רגישה) נבחן צדף נוכחי<html> מצב p. הנה, סדרה מוגדרת מראש מצטבר של שלבים נוכחיים ניתנת על מנת לעורר משינוי המתח הממברנה, ובכך לעורר פוטנציאל פעולה. א) מספר ממוצע ספייק עולה עם הטמפרטורה. B) עקבות מדגם ב 280 לשנה מיום NAC MSNs פגז המדיאלי בשלוש הגדרות טמפרטורה שונות (24 מעלות צלזיוס, n = 9; 28 מעלות צלזיוס, n = 5; ו -32 מעלות צלזיוס, n = 6). הטמפרטורה בחדר ההקלטה משפיעה ישירות בתדירות ספייק. עם זאת, יש לציין כי למרות תדירות ספייק לא נראית להשתנות בטמפרטורת subphysiological, היא מגדילה באופן משמעותי כאשר הטמפרטורה מגיעה 32 מעלות צלזיוס, טמפרטורה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. נוירונים מוחזקים ב -80 mV. דו כיוונית ANOVA: אינטראקציה, p &lt;0.0001; השפעת הטמפרטורה, p = 0.0041; בדיקות פוסט הוק: 24 ° C ו- 28 ° C הן שונות באופן משמעותי מ -32 מעלות צלזיוס, ** p &lt;0.01. נתונים מיוצגים ממוצע ± SEM. כיול: 200 msec, 50 mV.jove.com/files/ftp_upload/54024/54024fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54024/54024fig4.jpg" /> אפקט איור 4. טמפרטורה, R s, ו- R i על צורת גל של לחקר תחת חשמל איתותים. א) דוגמה של משרעת eEPSC מתוך MSN פגז NAC יחיד. הגדלת הטמפרטורה מ 24 ל 28 מעלות צלזיוס ו 32 ° C מגביר את שיפוע eEPSCs. יצוין, כי שינויי מושרה טמפרטורת מדרון eEPSCs להתרחש במהירות. הנה, מדרון eEPSCs נבחן במצב מתח- clamp. כיול: 5 מילי-שניות, 100 pa BD) דוגמה של מדרון eEPSCs מתוך MSN פגז NAC יחיד.. כאשר עליות של R (B), שיפוע eEPSCs פוחתת (C). ד) ניתוח המתאם של מדרון eEPSC כפונקציה של Rים. R של פירסון = -0.5717, p &lt;0.0001. נוירונים הם-הדק מתח ב -80 mV. E) דוגמא של עקבות משני נוירונים מראות את ההשפעה של R i על היכולת של הנוירון ליצור קוצים. נוירונים הם שוטפים-הידק, והחזיק ב -80 mV. כיול:. 200 msec, 50 mV <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54024/54024fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices at JoVE.com

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

פרוטוקול זה מתאר צעדים פרוצדורליים בסיסיים לביצוע הקלטות תיקון- clamp כל תא. טכניקה זו מאפשרת חקר ההתנהגות החשמלית של נוירונים, וכאשר ביצע פרוסות המוח, מאפשר הערכה של פונקציות עצביים שונים מתא עצב שעדיין משולבים מעגלים במוח השתמרות טוב יחסית.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

whole-cell-patch-clamp-recordings-in-brain-slices

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

59.3K Views.  University of Texas Southwestern Medical Center.  פרוטוקול זה מתאר צעדים פרוצדורליים בסיסיים לביצוע הקלטות תיקון- clamp כל תא. טכניקה זו מאפשרת חקר ההתנהגות החשמלית של נוירונים, וכאשר ביצע פרוסות המוח, מאפשר הערכה של פונקציות עצביים שונים מתא עצב שעדיין משולבים מעגלים במוח השתמרות טוב יחסית...

Video: Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

הקלטות קלאמפ תיקון בתאי שיער באוזן פנימיים מבודדות מדג הזברה

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

הצמד תיקון נייד לכל חוקר את המנגנונים של גירוי עצבי אינפרא אדום

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

תיקון הקלטות קלאמפ מתאים עוברי דג הזברה מאוטנר

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

מערכת תיקון מהדק Multi-אלקטרודה בסיוע מחשב

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

הקלטות תא כל לזווג בפרוסות בהיפוקמפוס Organotypic

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

אלקטרו ומורפולוגי אפיון של שבבים עצביים במוח חריף Slices שימוש מותאם Patch-קלאמפ הקלטות

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

תא שלם תיקון מהדק הקלטות עבור קביעת electrophysiological של יון סלקטיביות ב Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a challenging and low-throughput technique due to its complexity and high reliance on user operation and control. This manuscript demonstrates an image-guided automatic patch clamp system for in vitro whole-cell patch clamp experiments in acute brain slices. Our system implements a computer vision-based algorithm to detect fluorescently labeled cells and to target them for fully automatic patching using a micromanipulator and internal pipette pressure control. The entire process is highly automated, with minimal requirements for human intervention. Real-time experimental information, including electrical resistance and internal pipette pressure, are documented electronically for future analysis and for optimization to different cell types. Although our system is described in the context of acute brain slice recordings, it can also be applied to the automated image-guided patch clamp of dissociated neurons, organotypic slice cultures, and other non-neuronal cell types.

This protocol describes how to conduct automatic image-guided patch-clamp experiments using a system recently developed for standard in vitro electrophysiology equipment.

יישום אוטומטי של תמונה מודרך תיקון מהדק לחקר נוירונים של פרוסות המוח

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

גזע המוח השמיעתית תגובה והקלטה החיצוני תא שיער תיקון שלם-תא קלאמפ בחולדות כמחנכת

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...