אנו אסירי תודה על התמיכה הכספית של קרן וייטהול. ברצוננו להודות לסמואל ט &#39;קיסינג&#39;ר על ההערות החשובות.

<ol>
	<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+liposome+preparation+for+imaging+and+patch-clamp+electrophysiology.">Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo.">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).</li><li>Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MATLAB-based+automated+patch-clamp+system+for+awake+behaving+mice.">MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice.</a> J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+operation+of+the+autopatcher+for+automated+intracellular+neural+recording+in+vivo.">Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo.</a> Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+autopatching+with+automated+pipette+and+cell+detection+in+vitro.">Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro.</a> J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).</li><li>Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computer-assisted+multi-electrode+patch-clamp+system.">A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system.</a> J Vis Exp. (80), e50630 (2013).</li><li>Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+cell+patch+clamp+recording+performed+on+a+planar+glass+chip.">Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip.</a> Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. (20), (2008).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACQ4:+an+open-source+software+platform+for+data+acquisition+and+analysis+in+neurophysiology+research.">ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research.</a> Front Neuroinform. 8 (3), (2014).</li><li>Kolb, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning+patch-clamp+pipettes+for+immediate+reuse.">Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li></ol>

בקשה לפטנט לא זמני &quot;מערכות ושיטות לאוטומציה ממוחשבת של תיקון אלקטרומגנטי אוטומטי ב- VITRO,&quot; מס &#39;קטלוגי: 15 / 353,719 בארה&quot;ב, הוגש ב -16 בנובמבר 2016, Ref. לא. PRF 67270-02.

כאן, אנו מתארים שיטה אוטומטית התמונה מונחה תיקון קלימפ הקלטות במבחנה . השלבים העיקריים בתהליך זה מסוכמים כדלקמן. ראשית, ראיית מחשב משמש באופן אוטומטי לזהות את קצה פיפטה באמצעות סדרה של תמונות שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ. מידע זה משמש לאחר מכן לחשב את הפונקציה שינוי הקואורדינטות בין המיקרוסקופ לבין מערכות לתאם מניפולטור. ראיית מחשב משמש באופן אוטומטי לזהות תאים שכותרתו fluorescently כדי לזהות את הקואורדינטות שלהם. שלבים אלה משולבים עם מיקוד פיפטה ואלגוריתם תיקון אוטומטי באמצעות שפת קוד פתוח שפת Python, PyQT, וספריות OpenCV. לעומת הקיים במבחנה תיקון שיטות מהדק, מערכת זו עושה שיפורים משמעותיים במספר תחומים. זה מקטין את ההתערבות האנושית. מערכת זו ממכן את רוב הצעדים של הניסוי מהדק תיקון, למזער את reqUirement עבור התערבות אנושית. חלק מהשלבים הידניים הנותרים, כולל מעבר בין עדשות המיקרוסקופ נמוכות / גבוהות, יכולות להיות אוטומטיות תוך שימוש בחומרה ממונעת נוספת. שיטת תיקון המדבקת משפרת את התפוקה. ניסויים של תיקון Clamp באמצעות מערכת זו השיגו שיעורי הצלחה גבוהים יותר וזמנים קצרים יותר עבור כל ניסוי, דבר שתרם לעלייה משמעותית בתפוקה הכוללת. אלגוריתם חזון המחשב עבור זיהוי תא ניאון זיהוי קצה פיפטה הוא חזק מאוד, ושיעור השגיאה היה נמוך מאוד. השגיאה הממוצעת עבור איתור קצה פיפטה היה 1.6 מיקרומטר, ושיעור חיובי שקר עבור זיהוי תא ניאון היה 4.9% ± 2.25%. השוואה מפורטת בין תיקון ידני מסורתי לבין תיקון אוטומטי נעשה 6 . תיעוד מפורט של ניסויים אפשרי. תיקון יומנים של כל משפט ניתן לשמור ולנתח פוסט הוק . כאלה מפורטיםתיעוד לא היה זמין בעבר עבור תיקון ידני. זה מאפשר ניתוח שיטתי של ניסויים תיקון בתנאים ניסויים ייחודיים, סוגי תאים, מינים, ההכנות פרוסה. שיטה זו מראה תאימות עם תקן במבחנה תיקון מתקן מהדק. המערכת שלנו, כפי שהוכח בכתב היד הזה, נועד להגדיל את הקיים במבחנה מהדק קלאס תיקון, נותן להם את היכולת לבצע תיקון אוטומטי. שלא כמו הגישה התיקון מישורי, מערכת זו מתאימה למעבדות כבר ביצוע תיקון הידוק קלמפינג כדי להמיר את הציוד שלהם במחיר מינימלי. יחד עם זאת, עדיין יש אפשרות לתקן באופן ידני או חצי אוטומטי באופן אוטומטי באמצעות אותה מערכת. בגלל יכולת ההסתגלות של המערכת שהוזכרה לעיל, חיבור החומרה והתצורה של התוכנה נדרש על ידי הנסיין כאשר המערכת מוגדרת בפעם הראשונה. בעיות עלולות לגרוםממשימות יציאה שגויות וספריות מנהלי התקנים לא מתאימות עבור בקרת חומרה מסוימת. עיין בצעדים 1.2 - 1.4 בעת פתרון בעיות. לעומת אוטומציה חלקית של מערכות קיימות, מערכת זו משיגה את הרמה המקסימלית של אוטומציה קונבנציונאלי במבחנה תיקון clamping של פרוסות המוח חריפה (ותכשירים אחרים במבחנה ). זה נכון עבור כל השלבים, החל זיהוי התא כדי כיול פיפטה כדי תיקון 7 , 11 . צוואר הבקבוק היחיד הוא תהליך ידני של מילוי ושינוי טפיחות תיקון בין שבילים. ההתפתחויות האחרונות בשימוש חוזר של טפיחות תיקון יכול לפתור את הבעיה הזאת 12 . מלבד איכות הכנה פרוסה, הסיבה הנפוצה ביותר עבור ניסויים מוצלחים נובע מניפולטור שגיאות מכניות התנועה של הפרוסה בחדר. מגבלות אלה הן מעבר לשליטתנוהמערכת הנוכחית. המאמצים נעשים כדי ליישם קרוב לולאה, בזמן אמת איתור ובקרה של תנועת פיפטה כדי להסביר את הבעיה. לפיתוח עתידי, אנו מעוניינים להרחיב את יכולות זיהוי התא הנוכחי ניאון לזיהוי התא הכללית תחת אופטיקה DIC.

הטכניקה מהדק תיקון פותחה לראשונה על ידי Neher ו Sakmann בשנות ה -70 ללמוד את הערוצים היוניים של ממברנות נרגש 1 . מאז, תיקון clamping הוחל על המחקר של נושאים שונים רבים ברמה התאית, הסינפטית והמעגלית - הן במבחנה והן ב- vivo - בסוגי תאים שונים, כולל נוירונים, קרדיומיוציטים, ביציות Xenopus וליפוזומים מלאכותיים 2 . תהליך זה כרוך זיהוי נכון ומיקוד של תא של עניין, שליטה micromanipulator מורכבים להעביר את פיפטה תיקון בקרבה לתא, היישום של לחץ חיובי ושלילי פיפטה בזמן הנכון להקים תיקון gigaseal הדוק, ואת הפריצה להקים תצורה שלמה תיקון התאים. תיקון clamping מתבצעת בדרך כלל ידני דורש הכשרה מקיפה כדי לשלוט. אפילו עבור חוקר מנוסה עם התיקוןמהדק, שיעור ההצלחה נמוך יחסית. לאחרונה, כמה ניסיונות נעשו כדי להפוך את הניסויים תיקון clamp. שתי אסטרטגיות עיקריות התפתחו כדי להשיג אוטומציה: הגדלת תקן מתקן מהדק תיקון לספק בקרה אוטומטית של תהליך התיקון ואת העיצוב של ציוד וטכניקות חדשות מהיסוד. האסטרטגיה לשעבר היא הסתגלות החומרה הקיימת ניתן להשתמש במגוון רחב של יישומים מהדק תיקון, כולל vivo עיוור תיקון מהדק 3 , 4 , 5 , מהדק תיקון במבחנה של פרוסות מוח חריפה, תרבויות פרוסה organotypic, נוירונים מנותקים תרבותית 6 . זה מאפשר חקירה של מעגלים מקומיים מורכבים באמצעות micromanipulators מרובים בו זמנית 7 . שיטת התיקון המישורית היא דוגמה לאסטרטגיית הפיתוח החדשה, אשר יכולה להשיג את התפוקה הגבוהה בו-זמניתאטך מהדק של תאים ההשעיה למטרות הסריקה תרופה 8 . עם זאת, שיטת תיקון מישורי אינו מתאים לכל סוגי התאים, במיוחד נוירונים עם תהליכים ארוכים או מעגלים שלמים המכילים חיבורים נרחבים. זה מגביל את היישום שלה כדי מיפוי מעגלים מורכבים של מערכת העצבים, המהווה יתרון מרכזי של הטכנולוגיה המסורתית תיקון מהדק. פיתחנו מערכת אשר ממכן את תהליך הידוק תיקון הידן במבחנה על- ידי הגדלת חומרה סטנדרטי תיקון מהדק. המערכת שלנו, Autopatcher IG, מספק כיול פיפטה אוטומטי, זיהוי תא פלואורסצנטי זיהוי, שליטה אוטומטית של תנועת פיפטה, תיקון אוטומטי כל התא, ואת נתוני רישום. המערכת יכולה באופן אוטומטי לרכוש תמונות מרובות של פרוסות המוח בעומקים שונים; לנתח אותם באמצעות ראיית מחשב; ו לחלץ מידע, כולל את הקואורדינטות של תאים שכותרתו fluorescently. מידע זה יכול להיותהמשמש לכוון תאים תיקון אוטומטי של עניין. התוכנה נכתבת בפייתון - שפת תכנות חופשית וקוד פתוח - באמצעות מספר ספריות קוד פתוח. זה מבטיח נגישות שלה חוקרים אחרים ומשפר את reproducibility וקשיחות של ניסויים electrophysiology. המערכת יש עיצוב מודולרי, כך חומרה נוספת יכולה בקלות להיות interfaced עם המערכת הנוכחית הפגינו כאן.

<table width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">CCD Camera</td>
			<td style="width:115px;">QImaging</td>
			<td style="width:147px;">Rolera Bolt</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="width:231px;height:101px;">Electrophysiology rig</td>
			<td style="width:115px;">Scientifica</td>
			<td style="width:147px;">SliceScope Pro 2000</td>
			<td style="width:256px;">Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is &#8220;Linlab2&#8221;.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Amplifier</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:147px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:256px;">computer-controlled microelectrode amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Digitizer</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:147px;">Axon Digidata 1550</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="width:231px;height:55px;">LED light source</td>
			<td style="width:115px;">Cool LED</td>
			<td style="width:147px;">pE-100</td>
			<td style="width:256px;">488nm wavelength</td>
		</tr>
		<tr height="98">
			<td height="98" style="width:231px;height:98px;">Data acquisition board</td>
			<td style="width:115px;">Measurement Computing</td>
			<td style="width:147px;">USB1208-FS</td>
			<td style="width:256px;">Secondary DAQ. 
			See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">Solenoid valves</td>
			<td style="width:115px;">The Lee Co.</td>
			<td style="width:147px;">LHDA0531115H</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Air pump</td>
			<td style="width:115px;">Virtual industry</td>
			<td style="width:147px;">VMP1625MX-12-90-CH</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Air pressure sensor</td>
			<td style="width:115px;">Freescale semiconductor</td>
			<td style="width:147px;">MPXV7025G</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Slice hold-down</td>
			<td style="width:115px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:147px;">64-1415 (SHD-40/2)</td>
			<td style="width:256px;">Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Python</td>
			<td style="width:115px;">Anaconda</td>
			<td style="width:147px;">version 2.7 (32-bit for windows)</td>
			<td style="width:256px;">https://www.continuum.io/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:231px;height:20px;">Screw Terminals</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:115px;height:41px;">Sparkfun</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:147px;height:41px;">PRT - 08084</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:256px;height:41px;">Screw Terminals 3.5mm Pitch (2-Pin)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">(2-Pin)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">N-Channel MOSFET 60V 30A</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM - 10213</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="75">
			<td height="75" style="width:231px;height:75px;">DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-07937</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">LED - Basic Red 5mm</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM-09590</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">LED - Basic Green 5mm</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM-09592</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="99" style="width:231px;height:99px;">DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-12748</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="99" style="width:231px;height:99px;">Wall Adapter Power Supply - 12VDC 600mA</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">TOL-09442</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="159">
			<td height="159" style="width:231px;height:159px;">Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-11367</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="75">
			<td height="75" style="width:231px;height:75px;">Locking Male x Female X Female Stopcock</td>
			<td style="width:115px;">ARK-PLAS</td>
			<td style="width:147px;">RCX10-GP0</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="width:231px;height:77px;">Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings</td>
			<td style="width:115px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:147px;">14-171-129</td>
			<td style="width:256px;">Outer Diameter: 1/8 in. 
			Inner Diameter: 1/16 in.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">BNC male to BNC male coaxial cable</td>
			<td style="width:115px;">Belkin Components</td>
			<td style="width:147px;">F3K101-06-E</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">560 Ohm Resistor (5% tolerance)</td>
			<td style="width:115px;">Radioshack</td>
			<td style="width:147px;">2711116</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">Picospritzer</td>
			<td style="width:115px;">General Valve</td>
			<td style="width:147px;">Picospritzer II</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices

מהדק תיקון של כל התא הוא שיטה סטנדרטית זהב למדוד את המאפיינים החשמליים של תאים בודדים. עם זאת, במבחנה תיקון מהדק נשאר מאתגר נמוך התפוקה הטכניקה בשל המורכבות שלה ואת ההסתמכות הגבוהה על פעולת המשתמש ושליטה. כתב יד זה מדגים תמונה מודרכת אוטומטית תיקון מערכת מהדק עבור במבחנה כולו תא תיקון ניסויים מהדק פרוסות המוח חריפה. המערכת שלנו מיישמת מחשב מבוסס חזון אלגוריתם כדי לזהות תאים שכותרתו fluorescently ו למקד אותם עבור תיקון אוטומטי מלא באמצעות micromanipulator ואת השליטה הפנימית פיפטה הלחץ. התהליך כולו הוא אוטומטי מאוד, עם דרישות מינימליות להתערבות אנושית. מידע ניסיוני בזמן אמת, כולל התנגדות חשמלית ולחץ פיפטה פנימי, מתועדים בצורה אלקטרונית לניתוח עתידי ולאופטימיזציה לסוגים שונים של תאים. למרות שהמערכת שלנו מתוארת בהקשר של בריאה חריפהN הקלטות פרוסה, זה יכול גם להיות מיושם על התמונה אוטומטית מודרך תיקון מהדק של נוירונים מנותקים, תרבויות פרוסות organotypic, וסוגים אחרים של תאים שאינם נוירונים.

<html> המערכת שלנו נבדקה על היכולת שלה תיקון תאים פרוסות מוח חריפה, עכבר המושרה Pluripotent תאי גזע (iPSCs) מובחנת לנוירונים, ו HEK 293 תאים באופן מלאכותי להביע ערוצים של עניין. איור 3 מראה ניסוי באמצעות Thy1-ChR2-YFP עכברים מהונדסים (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) מיקוד fluorescently שכותרתו שכבת 5 נוירונים פירמידליים בקליפה החזותית. תא המטרה היה אחד זיהו אוטומטית תאים ירוקים חיובי ניאון ( איור 3 ב ). איור 3 א הוא דיפרנציאלי התערבות ניגודיות (DIC) תמונה של נוירון טלאים. תצורת כל התא הושג על ידי פרוטוקול תיקון אוטומטי צעדים 2.5-2.6 ו תוקף על ידי הזרקת הזרם הנוכחי המושרה פוטנציאל פעולה ( איור 3 ג ) 1 &quot;&gt; כדי להדגים את הפונקציה&quot; רצף פקודה &quot;נוספת, סיפקנו 500 מ&quot;מ KCl עבור 200 ms לשלושה מיקומים על פרוסת המוח בזמן תיקון הטלאי ( איור 4 ). ראשית, בחרנו 3 מיקומים על פרוסת המוח: אחד סגור אל גוף התא המצולק ושניים רחוקים מהתא המוקפא.הקואורדינטות מאוחסנות בממשק הגרפי של &quot;Memory Position&quot; GUI. הקואורדינטות הועמסו ל GUI &quot;Command Sequence&quot; תחת &quot;Unit1&quot;, שהיה המניפולטור שה- KCl- המכיל פיפטה המכילה רכוב על.אנו להגדיר את הפקודות בעמודה השמאלית לשלוח אות 5 + V TTL עבור 500 ms, ואחריו 0 V במשך 10 שניות ( איור 4 א ), מן יציאה ערוץ 0 על לוח DAQ משני, אשר היה מחובר קלט &quot;התחל גורם&quot; digitizer איור 4c מראה כי התא תוקנו היה נוירון spiking רגיל.הפיפטה יישום סמים (יחידה 1) חצה את שלושת המיקומים שנבחרו אבאופן אוטומטי ( איור 4 ב ), והקלטנו 10 שניות עבור כל יישום תחת מתח מהדק ( איור 4 ד ). צבע העקבות באיור 4 ד מתאים לצבע הגבול בתרשים 4 ב . כאשר KCl היה נפוח על התא, זרם פנימי גדול שנצפתה, אשר הלך ופחת לאט כמו KCl מתפזרת. צבע פלואורסצנטי אדום נוסף לפתרון KCl כדי לציין את ההתפלגות המרחבית של מסירת התרופה, והוא צילם באמצעות הדמיה משולבת DIC ו- epifluorescent. ניסוי זה אייר את הקלות והגמישות של המערכת שלנו כדי לשלוט בתנועה מניפולטור / מיקרוסקופ וחומרה חיצונית באמצעות אותות TTL. <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig1.jpg" /> איור 1. יחידת בקרת לחץ. A: מעגל מודפס Board (PCB) לחיבור שסתומים, לחץחיישן, משאבת אוויר. משמאל מראה פרטים על PCB, תיוג מיקומים של פלטי המוזכרים בפרוטוקול. הימין מראה את החיבור בין PCB לבין משאבת אוויר, יציאת USB, ואת הצינור. B: מפת מעגל עבור PCB. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56010/56010fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig2.jpg" /> איור 2. Autopatcher GUI. הלחצנים שהוזכרו בפרוטוקול מוצגים בריבועים אדומים וממוספרים. 1: כיול כיול, 2: כיול כיול, 3: כיול עומס, 4: כיול משני, 5: זיהוי תא, 6: בקרת תיקון, 7: עבור אל (יעד תא תיאום), ו 8: תיקון. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56010/56010fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו</a>. <img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig3.jpg" /> איור 3. דוגמה של תא CHR2-YFP חיובי טלאים. A: הגדלה 40X תחת אופטיקה DIC. B: תמונה Epifluorescence של אותו תא בלוח A (תאורת LED ב 488 ננומטר). C: ההקלטה הנוכחית הקלטות מן התא טלאים במהלך סדרה של hyperpolarizing ו depolarizing צעד זריקות הנוכחי. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56010/56010fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig4.jpg" /> איור 4. ביצוע ניסוי אוטומטי משלוח סמים. ת: מיקומים נבחרים נטענים ל &quot;רצף פקודות&quot; GUI. העמודה השמאלית מראה<html> את רשימת הקואורדינטות, ואת העמודה הימנית מציגה את רשימת פקודות בצורה של אותות TTL עבור כל מיקום. ב &#39;: צילומי מסך במהלך הניסוי ליישומי סמים המתאימים לשלושת המיקומים שנבחרו. יחידה 1 היה פיפטה המכיל KCl ו יחידה 2 היה פיפטה תיקון. הפתרון KCl היה מעורבב עם צבע פלואורסצנטי אדום לצורך הדמיה. התמונות הושגו על ידי שילוב של DIC ו הדמיה פלואורסצנטי. C: הזרקת הזרם הנוכחי מראה נוירון קבוע spiking. D: מתח הקלטה מהדק עקבות מיישום מקומי של 500 מ&quot;מ פתרון KCl ב שלושה מקומות. עקבות אדום עם הזרם פנימה נרשם מן הניסוי כאשר יישום KCl היה קרוב לתא טלאים. החץ האדום מציין את התזמון של יישום KCl. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56010/56010fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" </html style=";text-align:right;direction:rtl">Fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot; עבור: keep-with-next.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <tbody><tr><td> מוצא על PCB </td><td> שם היציאה בלוח ה- DAQ </td><td> יציאה # על לוח DAQ </td><td> הֶעָרָה </td></tr><tr><td> DOUT V1 </td><td> ערוץ ערוץ 1 </td><td> 22 </td><td> שסתום בקרה 1 </td></tr><tr><td> DOUT V2 </td><td> ערוץ ערוץ 2 </td><td> 23 </td><td> שסתום בקרה 2 </td></tr><tr><td> ד </td><td> ערוץ ערוץ 3 </td><td> 24 </td><td> בקרת משאבת אוויר </td></tr><tr><td> Gr </td><td> קרקע, אדמה </td><td> 29 </td><td> קרקע, אדמה </td></tr></tbody></table> טבלה 1. מודפס מועצת המעגלים (PCB) כדי רכישת נתונים משנית (DAQ) תצורת חיבור הלוח. השתמש בטבלה זו לחיבור יציאות PCB (העמודה הראשונה משמאל) ליציאות בלוח ה- DAQ (העמודה השנייה משמאל)). שם היציאה ומספר ה- DAQ המשני מתייחסים למצב חד-פעמי. <img alt="שולחן 2" src="/files/ftp_upload/56010/56010table2.jpg" /> טבלה 2. חיבורי חיבורים מיחידת בקרת לחץ למחזיקי פיפטה. עבור כל חיבור, חבר את היציאות המתאימות, מסומן בקופסה אפורה, תוך שימוש בצינור רך (ראה טבלת החומרים ).

Watch this Scientific Journal Video about Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices at JoVE.com

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע אוטומטית תמונה מודרך תיקון ניסויים מהדק באמצעות מערכת שפותחה לאחרונה עבור תקן במבחנה electrophysiology ציוד.

יישום אוטומטי של תמונה מודרך תיקון מהדק לחקר נוירונים של פרוסות המוח

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

application-automated-image-guided-patch-clamp-for-study-neurons

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K Views.  Purdue University.  פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע אוטומטית תמונה מודרך תיקון ניסויים מהדק באמצעות מערכת שפותחה לאחרונה עבור תקן במבחנה electrophysiology ציוד. 

Video: Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

Culturing ו Electrophysiology של תאים על Patch-clamp צ&#39;יפס NRCC

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent neuropsychiatric disorder that stems from the biophysical and cellular actions of nicotine on nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) throughout the central nervous system. Understanding the various nAChR subtypes that exist in brain areas relevant to nicotine addiction is a major priority.
Experiments that employ electrophysiology techniques such as whole-cell patch clamp or two-electrode voltage clamp recordings are useful for pharmacological characterization of nAChRs of interest. Cells expressing nAChRs, such as mammalian tissue culture cells or Xenopus laevis oocytes, are physically isolated and are therefore easily studied using the tools of modern pharmacology. Much progress has been made using these techniques, particularly when the target receptor was already known and ectopic expression was easily achieved. Often, however, it is necessary to study nAChRs in their native environment: in neurons within brain slices acutely harvested from laboratory mice or rats. For example, mice expressing "hypersensitive" nAChR subunits such as &alpha;4 L9&prime;A mice 1 and &alpha;6 L9&prime;S mice 2, allow for unambiguous identification of neurons based on their functional expression of a specific nAChR subunit. Although whole-cell patch clamp recordings from neurons in brain slices is routinely done by the skilled electrophysiologist, it is challenging to locally apply drugs such as acetylcholine or nicotine to the recorded cell within a brain slice. Dilution of drugs into the superfusate (bath application) is not rapidly reversible, and U-tube systems are not easily adapted to work with brain slices.
In this paper, we describe a method for rapidly applying nAChR-activating drugs to neurons recorded in adult mouse brain slices. Standard whole-cell recordings are made from neurons in slices, and a second micropipette filled with a drug of interest is maneuvered into position near the recorded cell. An injection of pressurized air or inert nitrogen into the drug-filled pipette causes a small amount of drug solution to be ejected from the pipette onto the recorded cell. Using this method, nAChR-mediated currents are able to be resolved with millisecond accuracy. Drug application times can easily be varied, and the drug-filled pipette can be retracted and replaced with a new pipette, allowing for concentration-response curves to be created for a single neuron. Although described in the context of nAChR neurobiology, this technique should be useful for studying many types of ligand-gated ion channels or receptors in neurons from brain slices.

In this paper, we describe a useful method to study ligand-gated ion channel function in neurons of acutely isolated brain slices. This method involves the use of a drug-filled micropipette for local application of drugs to neurons recorded using standard patch clamp techniques.

יישום מקומי של תרופות לללמוד לתפקד קולטן אצטילכולין ניקוטינית בפרוסות מוח עכבר

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

בידוד של נוירונים חושיים של<em&gt; Aplysia californica</em&gt; להקלטות מהדק תיקון של זרמי glutamatergic

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

מערכת תיקון מהדק Multi-אלקטרודה בסיוע מחשב

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

אלקטרו ומורפולוגי אפיון של שבבים עצביים במוח חריף Slices שימוש מותאם Patch-קלאמפ הקלטות

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

הקלטות תיקון מהדק subcellular מן האחוזה Somatodendritic של נוירונים Nigral דופמין

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug application during electrophysiological recording is the puff technique, which can be used to study the effect of pharmacological reagents on neuronal activities in brain slices. The greatest advantage of puff application is that the drug concentration around the recording site increases rapidly, thus preventing desensitization of membrane receptors. Successful use of puff application involves careful attention to the following elements: the concentration of the drug, the parameters of the puff micropipette, the distance between the tip of a puff micropipette and the neuron recorded, and the duration and pressure driving the puff (pounds per square inch, psi). This article describes a step-by-step procedure for recording whole-cell currents induced by puffing gamma-aminobutyric acid (GABA) onto a neuron of a prefrontal cortical slice. Notably, the same procedure can be applied with minor modifications to other brain areas such as the hippocampus and the striatum, and to different preparations, such as cell cultures.

We describe the puff technique, by which pharmacological reagents can be administered during whole-cell patch-clamp recording, and highlight various aspects of the features that are crucial for its success.