עבודה זו נתמכה על ידי MRC את האיחוד האירופי FP7, ARUK, טרסט, בבריטניה פרקינסון. כן נרצה להודות גב' ג'ואנה סרויה שלה התרומה של תמונות קונאפוקלית ואנשי המעבדה לקלט בונה שלהם על כתב היד, מתודולוגיה.

כל הניסויים באמצעות עכברים וחולדות אושרו, שנערך באמצעות לוח זמנים 1 הליכים מכוסה תחת חוק משרד הפנים חיות (וצפייה) 1986. ניתן למצוא את המתכון נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד) טבלה 1-
 1. הכנה חריפה פרוסה בהיפוקמפוס <ol><li>מסירים את המוח העכבר מהר ככל האפשר, באמצעות מרית, מספריים לחתוך את הגולגולת, ולמקם אותו תוך קר כקרח, חמצן (95% או 2, 5% CO 2), חנה המבר בסוכרוז (~ 100 מ"ל).</li>
	<li>מקום במוח העכבר על צלחת פטרי ולהסיר את המוח הקטן, קטע קטן של קליפת חזיתית עם איזמל לפני hemisecting את האמצע של המוח-</li>
	<li>למקם את שתי האונות בצד שהיה מכריתת והדבק האונה כל לבמה של vibratome.</li>
	<li>לחתוך 200-300 סעיפים מיקרומטר בעובי של האזור מלא עניין. במקרה של ההיפוקמפוס, כ 3-4 פרוסות לכל האונה צריכה להתקבל.</li>
	<li>באמצעות פיפטה פלסטיק של פסטר, להעביר את הפרוסות אל. התא שקועים מחומצן (95% או 2, 5% CO 2) חנה המבר. לשמור על 34 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות 
	הערה: הטיפול של פרוסות עם סוכנים תרופתי פעיל, כגון חומרים Dkk1, ניתן לבצע בשלב זה על-ידי הוספת הסוכנים לתא פרוסה.</li>
	<li>להסיר את הפרוסות מן החדר באמצעות מברשת, למקם אותם לתוך צלחת 24-ובכן, תקן עבור 20 דקות ל- 1 h ב- 4% paraformaldehyde (סוכרוז PFA)/4% בטמפרטורת החדר (RT). 
	התראה: PFA רעיל, ללבוש הגנה הולמת.</li>
	<li>לרחוץ את הפרוסות שלוש פעמים ב- X 1 PBS (10 דקות כל אחד). 
	הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות כאן 1-2 ימים, כל עוד הפרוסות נשמרים ב 4 ° C ב- 1 X PBS-</li>
</ol> 2. Immunofluorescence עבור סמני סינפטית הערה: ניתן למצוא את המתכונים של כל מאגרי להשתמש בטבלה מס ' 2-
<ol><li>להחליף את PBS עם מאגר חוסם/permeabilizing (טבלה 2) הבארות פרוסה, דגירה-RT עבור 4-6 ח'</li>
	<li>לדלל הנוגדן שפן polyclonal נגד vGlut1-1:2,000 לדילול במאגר חוסם/permeabilization. 
	הערה: vGlut1 הוא סמן קדם סינפטיים הדמיית מסוף סינאפסות. עבור זיהוי סינפסה סינאפסות הפוסט-סינפטית, להשתמש עם נוגדנים polyclonal נגד PSD-95, שבערך שתדללו הפתרון אותו. השתמש נפח מינימלי של 300 µL כל טוב. כדי לזהות את המיקום האנטומי של ההיפוקמפוס, השתמש נוגדן זה ניתן לזהות את מבנה עצביים, כגון MAP2 או טובולין. לסדר את ריכוזי הנכון לכל הנוגדנים העיקרי עבור הסמנים סינפטית של בחירה (קדם, הפוסט-סינפטית) ורכים במאגר טריים חוסם/permeabilizing.</li>
	<li>דגירה הפרוסות בפתרון נוגדן ראשוני למשך הלילה (או 1-2 ימים) ב-4 ° C. שימוש פלטפורמה חזק עם תנועה נמרצת.</li>
	<li>לרחוץ את הפרוסות שלוש פעמים ב- PBS (10 דקות כל אחד).</li>
	<li>לדלל את שבערך נוגדנים משניים המתאימים במאגר חסימה. לדוגמה, בעת השימוש הנוגדן שפן vGlut1, להחיל נוגדנים משניים מזהה את הרכיב שפן (למשל, החמור אנטי-guinea-חזיר) מצומדת כדי fluorophore ספציפיים. בעת השימוש הנוגדן ארנב PSD-95, החל נוגדנים משניים מזהה את הרכיב הארנב (למשל, החמור נגד הארנב) מצומדת כדי fluorophore ספציפיים שונים.</li>
	<li>דגירה הפרוסות בפתרון זה עבור 2-3 h-ודא RT. כי הפרוסות מוגנים מפני האור, כמו נוגדנים משניים הם רגיש אור.</li>
	<li>לרחוץ את הפרוסות שלוש פעמים ב- PBS (10 דקות כל אחד).</li>
	<li>בזהירות להסיר את הפרוסות מהצלחת 24-ובכן שימוש במכחול ולמקם אותם באופן שווה על גבי מדרון זכוכית עם תוויות ברורות מראש. להוסיף טיפה של הרכבה בינונית מעל כל פרוסה ולאחר מכן מקם בעדינות coverslip זכוכית מעל הפרוסות. למנוע היווצרות של בועות אוויר. שמור לשימוש מספיק הרכבה בינונית (300-400 µL), כמו כמות לא מספקת עלולה להוביל לייבש פרוסות.</li>
	<li>השאירו יבש למשך תקופה מינימלית של 1-2 ימים ב- RT ולשמור את השקופיות מוגן מפני אור.</li>
	<li>לאחסן את השקופיות ב 4 ° C בטווח הקצר, אבל לאחסון לטווח ארוך, לשמור אותם ב-20 מעלות צלזיוס</li>
</ol> 3. ייבוא תמונות וניתוח קונאפוקלית <ol><li>הדמיה באמצעות סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי.
	<ol><li>לזהות את האזור של ההיפוקמפוס לדימות (למשל, ammonis cornu 1 ו- 3 (CA1, CA3) או הפיתול משוננת (ג'י)) באמצעות 10 x או 20 x המטרה.</li>
		המטרה שמן-טבילה <li>שינוי סימן x 40 או 63 x כדי לוודא האנטומיה פרוסה לא נפגע על-ידי זיהוי רציפה neurites ומאורגן מבנה. להשתמש את סמן עצביים, כגון MAP2, כהפניה ( איור 1 א').</li>
		<li>לאחר מכן לעבור 60 x שמן-טבילה אובייקטיבי (NA = ~1.3 - 1.4) והתאם את ההגדרות לכל ערוץ כדי להשיג אופטימלי איתות והחדות. להגדיר את עוצמת הלייזר כל כדי למנוע את הרוויה של פיקסלים באמצעות אפשרות גבוהה- / עם ניגודיות נמוכה. 
		הערה: אלה ההגדרה תלויה המיקרוסקופ משמש, אלא להפנות הטבלה של חומרים הגדרות צריכת החשמל הלייזר בשימוש איור 2, איור 3, ו- איור 4. לקבלת תוצאות מיטביות, השתמש ברזולוציה 1024 x 1024 פיקסלים. ההגדרות צריכים להישאר קבועה לאורך כל תנאי אחר אותו ניסוי. יכול להיות מיושם זום נוספים אם יש צורך.</li>
		<li>להעריך את עומק ההכתמה איפה אפילו ולרכוש אוספי תמונות לפחות 8 קו מקביל (250 ננומטר) מטוסים. אז קח 3 ערימות סמוכים להחליפן בתמונות מאותו עניין לחתיכה. 
		הערה: העומק עשוי להשתנות מפרוסה אחת לאחרת, אבל תמיד צריך להיות כ- 2-5 מיקרומטר מפני השטח של הפרוסה.</li>
		<li>חוזר הרכישה לפחות 3 פרוסות לכל תנאי, מבעלי 6-8 לכל קבוצה הטיפול.</li>
	</ol></li> <li>ניתוח תמונה. 
	הערה: השתמש תוכנה ניתוח תמונה אוטומטית (ראה את הטבלה של חומרים). שימו לב כי חלק ממערכות דורשים רישיון, ואילו אחרים הם חינם, כגון ImageJ. התוכנה ששימשה יש לנתח את התמונות ב- 3D תוך התחשבות כל המטוסים של המחסנית עם תמונה. עיין בטבלה של חומרים עבור הפרטים של התוכנה ששימשה בניתוח התמונה ( איור 1).
	<ol><li>שימוש מותאם אישית המבוסס על עוצמת סף פרוטוקול כדי לזהות כל puncta סינפטית של סמנים עצביים, אשר באופן ידני אופטימיזציה ו נבחר בתוך התוכנה [ראה את הטבלה של חומרים עבור התוכנה ספציפיים השתמשו בזה פרוטוקול]. 
		הערה: התוכנה מזהה את עוצמת מינימום ומקסימום עבור כל fluorophore ומשייך אחוז של העוצמה עבור כל אובייקט מוכר. שימו לב: האחוז של עוצמת ישתנה בהתאם fluorophore להשתמש, הנוגדן נגד דה מרקר סינפטית.</li>
		<li>עבור סמני סינפטית, ודא כי גודל מסננים (&#62; 0.1µm 3, &#60; 0.8µm 3) נבחרים בתוך התוכנה ו להחיל על התמונה. כוונן את הפרמטרים כדי להבטיח האובייקטים שנבחרו לא חופפות. לא לכלול כל אובייקט גדול מדי או קטן מדי כדי להיחשב puncta סינפטית (ראה איור 2B). 
		הערה: לאחר אופטימיזציה, ערכי סף זהים יוחלו על כל התמונות בתוך ניסוי נתון.</li>
		<li>לכמת את המספר אומר בעוצמה, נפח של הפרט puncta סינפטית (קדם או הפוסט-סינפטית) באמצעות פרוטוקולים הסף ממוטבת נבחר בתוך התוכנה. לנרמל את מספר puncta לנפח של שדה התמונה (בערך 16,928 מיקרומטר 3 במערכת המשמש כאן). לנרמל את העוצמה puncta סינפטית ללחץ של דה מרקר עצביים הפניה. 
		הערה: הסינפסות מוגדרים לוקליזציה שיתוף בין סמנים מראש והן הפוסט-סינפטית. פעם הסף פרוטוקולים עבור h puncta מראש, הפוסט-סינפטיתave כבר הוקמה, התוכנה עליך לזהות לוקליזציה משותף של puncta סינפטית כמו החפיפה של 1 פיקסל או יותר מטוס בודד. 
		הערה: עבור ניתוח סטטיסטי, לאשר כי כל הערכות של דגימות בצע נורמליות והומוגניות השונות, כפי שנקבע על-ידי Lilliefords במבחני χ2, בהתאמה. צריך להיות מנותח דגימות מראה של התפלגות נורמלית והומוגניות השונות עם בדיקות פרמטרית, כמתואר להלן. לדוגמה, ניתוח puncta סינפטית סינאפסות צריכה להתבצע באמצעות חד-כיווני אנובה עם חסימת ושכפול. ניסוי בודדות צריך להיחשב בלוק; בדרך כלל, ישנם 3 ניסויים עצמאי, כל אחד עם 1-3 עכברים מן כל תנאי-</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig1.jpg" /> איור 1: ניתוח של puncta סינפטית באמצעות ניתוח תמונה תוכנת. (א) צילום מסך של עוצמת סף פרוטוקול ההתאמה האישית. הדוגמה בהתחשב מיועד PSD-95, שבה puncta שנבחר יש גודל מוגדר של &#62; מיקרומטר 0.1 3 ו &#60; 0.8 מיקרומטר 3 ו נוכח ממוזער לאובייקטים חופפים. שימו לב כי התמונה המוצגת עבור מטוס קונאפוקלית אחד לאפשר את החזיית קל יותר puncta סינפטית ומבחר פרמטר מדויק. צילום מסך של ניתוח פלט מתוך התוכנה (בעקבות הבחירה של פרוטוקול ממוטב) (B). דוגמה של raw puncta סינפטית מספר מדידות בהתבסס על הכמות. ערכים אלה מיוצאים ואז תוכנת הגיליון האלקטרוני. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56153/56153fig1large.jpg" target="_blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
 <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig2.jpg" /> איור 2: בדיקת איכות של ההגדרות פרוסה של פרמטר עבור סינפטית puncta. (א) נציג קונאפוקלית תמונות (40 x המטרה) באזור עניין: CA1 שכבה radiatum (sr) של הרובד oriens (כך) על נתח בהיפוקמפוס מזוהים על-ידי MAP2 מכתים. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. (B) קונאפוקלית תמונות (60 x אובייקטיבית, 1.3 נוספים של X הגדלה על התוכנה רכישה) של radiatum הרובד CA1, עם סמנים סינאפסות-(ירוק) vGlut1 ו- PSD-95 (אדום)-מ פרוסות בהיפוקמפוס. הערה הזיהוי של puncta ברור מראש, פוסט-סינפטיים. Puncta גדול יותר מיקרומטר 0.8 3 אינם נכללים כימות (החצים הלבנים). סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר (ג) Confocal תמונות (60 x אובייקטיבית, 1.3 נוספים של X הגדלה על התוכנה רכישה) של radiatum הרובד CA1, עם סמנים סינאפסות-vGlut1 (ירוק)-ממקטעים בהיפוקמפוס cryostat-גזור מן המוח כולו קבוע בכדורגלן. הערה על הימצאות חורים גדולים והוא vGlut1 לא סדיר, גושית מכתים. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56153/56153fig2large.jpg" target="_blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<ol>
	<li>Malenka, R. C., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+and+LTD:+an+embarrassment+of+riches.">LTP and LTD: an embarrassment of riches.</a> Neuron. 44 (1), 5-21 (2004).</li><li>Arendt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+degeneration+in+Alzheimer's+disease.">Synaptic degeneration in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathol. 118 (1), 167-179 (2009).</li><li>Missler, M., Sudhof, T. C., Biederer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+cell+adhesion.">Synaptic cell adhesion.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (4), a005694 (2012).</li><li>Chua, J. J., Kindler, S., Boyken, J., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+architecture+of+an+excitatory+synapse.">The architecture of an excitatory synapse.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 6), 819-823 (2010).</li><li>Dobie, F. A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+synapse+dynamics:+coordinated+presynaptic+and+postsynaptic+mobility+and+the+major+contribution+of+recycled+vesicles+to+new+synapse+formation.">Inhibitory synapse dynamics: coordinated presynaptic and postsynaptic mobility and the major contribution of recycled vesicles to new synapse formation.</a> J Neurosci. 31 (29), 10481-10493 (2011).</li><li>Jackson, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tau+increases+amyloid+beta+plaque+size+but+not+amyloid+beta-mediated+synapse+loss+in+a+novel+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Human tau increases amyloid beta plaque size but not amyloid beta-mediated synapse loss in a novel mouse model of Alzheimer's disease.</a> Eur J Neurosci. 44 (12), 3056-3066 (2016).</li><li>Heck, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+automated+3D+detection+of+synaptic+contacts+reveals+the+formation+of+cortico-striatal+synapses+upon+cocaine+treatment+in+vivo.">A new automated 3D detection of synaptic contacts reveals the formation of cortico-striatal synapses upon cocaine treatment in vivo.</a> Brain Struct Funct. 220 (5), 2953-2966 (2015).</li><li>Sultana, R., Banks, W. A., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+levels+of+PSD95+and+two+associated+proteins+and+increased+levels+of+BCl2+and+caspase+3+in+hippocampus+from+subjects+with+amnestic+mild+cognitive+impairment:+Insights+into+their+potential+roles+for+loss+of+synapses+and+memory,+accumulation+of+Abeta,+and+neurodegeneration+in+a+prodromal+stage+of+Alzheimer's+disease.">Decreased levels of PSD95 and two associated proteins and increased levels of BCl2 and caspase 3 in hippocampus from subjects with amnestic mild cognitive impairment: Insights into their potential roles for loss of synapses and memory, accumulation of Abeta, and neurodegeneration in a prodromal stage of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci Res. 88 (3), 469-477 (2010).</li><li>Harwell, C. S., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptophysin+depletion+and+intraneuronal+Abeta+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures+from+huAPP+transgenic+mice.">Synaptophysin depletion and intraneuronal Abeta in organotypic hippocampal slice cultures from huAPP transgenic mice.</a> Mol Neurodegener. 11 (1), 44 (2016).</li><li>Marzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+Synapse+Degeneration+by+Restoring+Wnt+Signaling+in+the+Adult+Hippocampus.">Reversal of Synapse Degeneration by Restoring Wnt Signaling in the Adult Hippocampus.</a> Curr Biol. 26 (19), 2551-2561 (2016).</li><li>Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+dysfunction+in+neurodevelopmental+disorders+associated+with+autism+and+intellectual+disabilities.">Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), (2012).</li><li>Janezic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficits+in+dopaminergic+transmission+precede+neuron+loss+and+dysfunction+in+a+new+Parkinson+model.">Deficits in dopaminergic transmission precede neuron loss and dysfunction in a new Parkinson model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), E4016-E4025 (2013).</li><li>Caricasole, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Dickkopf-1,+a+negative+modulator+of+the+Wnt+pathway,+is+associated+with+neuronal+degeneration+in+Alzheimer's+brain.">Induction of Dickkopf-1, a negative modulator of the Wnt pathway, is associated with neuronal degeneration in Alzheimer's brain.</a> J Neurosci. 24 (26), 6021-6027 (2004).</li><li>De Ferrari, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+genetic+variation+within+the+low-density+lipoprotein+receptor-related+protein+6+and+late-onset+Alzheimer's+disease.">Common genetic variation within the low-density lipoprotein receptor-related protein 6 and late-onset Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9434-9439 (2007).</li><li>Liu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+in+LRP6-mediated+Wnt+signaling+contributes+to+synaptic+abnormalities+and+amyloid+pathology+in+Alzheimer's+disease.">Deficiency in LRP6-mediated Wnt signaling contributes to synaptic abnormalities and amyloid pathology in Alzheimer's disease.</a> Neuron. 84 (1), 63-77 (2014).</li><li>Purro, S. A., Dickins, E. M., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Secreted+Wnt+Antagonist+Dickkopf-1+Is+Required+for+Amyloid+beta-Mediated+Synaptic+Loss.">The Secreted Wnt Antagonist Dickkopf-1 Is Required for Amyloid beta-Mediated Synaptic Loss.</a> J Neurosci. 32 (10), 3492-3498 (2012).</li><li>Rosi, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Dickkopf-1+expression+in+transgenic+mouse+models+of+neurodegenerative+disease.">Increased Dickkopf-1 expression in transgenic mouse models of neurodegenerative disease.</a> J Neurochem. 112 (6), 1539-1551 (2010).</li><li>Budnik, V., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+during+synaptic+development+and+plasticity.">Wnt signaling during synaptic development and plasticity.</a> Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 151-159 (2011).</li><li>Ciani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+tunes+neurotransmitter+release+by+directly+targeting+Synaptotagmin-1.">Wnt signalling tunes neurotransmitter release by directly targeting Synaptotagmin-1.</a> Nat Commun. 6, 8302 (2015).</li><li>Dickins, E. M., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnts+in+action:+from+synapse+formation+to+synaptic+maintenance.">Wnts in action: from synapse formation to synaptic maintenance.</a> Front Cell Neurosci. 7, 162 (2013).</li><li>Inestrosa, N. C., Varela-Nallar, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+in+neuronal+differentiation+and+development.">Wnt signalling in neuronal differentiation and development.</a> Cell Tissue Res. 359 (1), 215-223 (2015).</li><li>Galli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+Wnt+signalling+triggers+striatal+synaptic+degeneration+and+impaired+motor+behaviour+in+adult+mice.">Deficient Wnt signalling triggers striatal synaptic degeneration and impaired motor behaviour in adult mice.</a> Nat Commun. 5, 4992 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

הערכת סינפסה מספר מדויק חיוני בתחום מדעי המוח. כאן, אנו מראים כיצד להעריך את הצפיפות של סינפסות האזור radiatum CA1 שכבה של פרוסות בהיפוקמפוס כמערכת מודל. המשמעות לגבי שיטות קיימות מומחש במאמר מחקר האחרונות שלנו על ההשפעה של מחסור ונ ט בהיפוקמפוס, שבו אנו גם מוערכים סינפסה מספר EM יחיד-סעיף10. סדר הגודל של אובדן סינפסה דומים בין יחיד-סעיף EM פרוסות המוח של השיטה המתוארת כאן10. לפיכך, ממצא זה מדגים את הדיוק והאמינות של הטכניקה.
חשוב, מגבלה של יחיד-סעיף EM והן immunostaining הסינפסות, כפי שהוצג כאן, היא חוסר היכולת לאמוד במדויק את מספר סינפסה מוחלטת עבור אזור מסוים במוח. אכן, חשוב לזהות שינויים מורפולוגיים הכללית, כפי שינויי הנפח הכולל יכול להשפיע מספר סינפטית. מגבלה נוספת היא כי נוגדנים מסוימים הם פחות יעילים צביעת אזורים במוח ללא פגע, חלקית עקב הצפיפות הקיצונית של קשרים סינפטיים. שחווינו באיכות גבוהה יותר כתמים של vGlut1, gephyrin באמצעות זו פרוסה והכנה קיבוע PFA עוקבות לכל היותר 1 h, לעומת הקיבעון מיידית של המוח כולו בכדורגלן (איור 2C). האחרון הובילו גושית סינפטית מכתים, עם חורים ברקמה. למרות זאת, החדירה נוגדן vGlut1 הוא עדיין מוגבל בשתי השיטות (כמה עשרות מיקרונים). אנחנו לא להתגבר על מגבלה זו, אפילו עם נוגדן מוגברת דגירה, אבל מתן החדירה נוגדן הוא גדול יותר עומק סה כ זה הוא עם תמונה, צריכה להיות כל השפעה על התוצאה הסופית. יתר על כן, טיפול מיוחד יש לנקוט על מנת להבטיח כי ההכתמה אפילו במהלך רכשה הערימה כולה.
במחקר שלנו, רצינו להבחין סינאפסות בין הסינפסות מעכבות. כתוצאה מכך, בחרנו vGlut1/PSD-95 ו- vGAT/gephyrin, בהתאמה, כפי חלבונים אלה באים לידי ביטוי מאוד בהיפוקמפוס עכבר מבוגרים והם ספציפיים עבור כל סוג של סינפסה4,5. סמנים אחרים סינפטית סינאפסות יכול השתמשו כדי לזהות כל סינפסה המתאימים, כגון קולטנים מועשר ב כל סינפסה, כולל קולטני NMDA, אמפא סינאפסות, קולטני GABAA הסינפסות מעכבות. גם להיות מזוהה עם פרוטוקול שלנו, ולהבטיח כי נוגדנים ספציפיים זמינים, כפי שמוצג עבור וכולינרגיים הסינפסות סטריאטום22נוירוטרנסמיטרים או neuromodulators אחרים. בנוסף, הפחתת עובי כל פרוסה 120 מיקרומטר יכול חלקית להתגבר על כמות נמוכה של דגימות שהושג עם פרוסות חריפה, אשר הכרחי ללימודי מוח קטן מבנים כגון האמיגדלה.
ניתן ליישום יישומים עתידיים של פרוטוקול שלנו במחקר של אזורים שונים במוח והפרעות. לדוגמה, ב- סטריאטום (אזור של המוח הקשורים עם מחלת פרקינסון), שילוב של vGlut2/PSD-95 או vGlut1/PSD-95 יכול לשמש כדי להבדיל בין הסינפסות סינאפסות מ afferents מגיע קליפת או התלמוס, בהתאמה22.
לסיכום, אנחנו הראו שיטה אמינה כדי לבדוק את המספר של הסינפסות ברקמות המוח באמצעות סמנים מראש ו פוסט-סינפטיים להגדרת סינפסה. שלבים קריטיים כוללות הכנת פרוסות בהיפוקמפוס טוב, זמן קיבעון של עד 1 h מחברים, היישום של מדיום מספיק הרכבה, השימוש של נוגדנים אמין, הגדרות רכישת תמונה המתאימה, וזיהוי מחמירים puncta סינפטית. בסופו של דבר, בשיטה זו הוא מהיר יחסית והוא לשחזור בקלות על ידי כל מעבדות יש גישה מיקרוסקופ קונפוקלי.

המוח האנושי מורכב כ 1014 הסינפסות. סינפסה מספר מוסדר בחוזקה במהלך ההתפתחות וההתבגרות של מערכת העצבים המרכזית (CNS). במהלך פיתוח, סינפסה מספר הוא מווסת על ידי synaptogenesis וגיזום כדי ליצור רשתות עצביים פונקציונלי. למידה וזיכרון נתמכים על ידי ויסות סינפסה מספר כוח, תהליך המכונה potentiation סינפטית, דיכאון1. חשוב, הייצוב של הסינפסות בוגר הוא חיוני לשמירה על חיבורי הרשת העצבית. יתר על כן, גירעונות בצפיפות סינפסה דווחו כבר בשלבים מוקדמים של התנאים ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD)2. לכן, היכולת לזהות ולהעריך במדויק מספר סינפסה הוא היסוד ההערכה של המוח פיזיולוגיה פתולוגיה.
צפיפות קיצונית והטבע קומפקטי של הסינפסות להגיע מאתגר כדי להעריך את המספר המדויק שלהם באזורים במוח ללא פגע שני נוירונים בתמורה קרוב, מופרדים על-ידי שסוע סינפטית3עשויים כימי סינפסות מערכת העצבים. מסוף סינפטית מראש, או בוטון סינפטית, מגיח האקסון והיא מורכבת שלפוחית שהצטברו, המכילים נוירוטרנסמיטורים המגדירים יחודיות של סינפסה — כלומר, גלוטמט וגאמא אמינו בוטירית (GABA) עבור סינאפסות, מעכבות synapses, בהתאמה. הקרומים של השלפוחיות המוגלתיות מכילים ספיציפית כל עצבי vesicular מובילים: vesicular גלוטמט טרנספורטר (vGlut) עבור גלוטמט וטרנספורטר גאבא vesicular (vGAT) עבור GABA. הטרמינל הפוסט-סינפטית היא מבנה צפופה מורכב של חלבונים מרובות, כולל רצפטורים, מולקולות אדהזיה חלבונים לגרדום. הסינפסות סינאפסות, חלבונים צפיפות-95 פוסט-סינפטיים (PSD-95) הוא הנפוץ ביותר לגרדום חלבון4, להתכוונן סינאפסות N-methyl-D-aspartate(NMDA-), חומצה α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (נולד באמפא) קולטן לפעול, ואילו gephyrin עוגנים קולטנים מעכבות5מעכבות הפוסט-סינפטית מסוף. בסך הכל, יחודיות של חלבונים תאים טרום, פוסט-סינפטיים הסיוע בידול, זיהוי של סוגי סינפסה.
ניתן לבצע הערכת מספר סינפסה עם טכניקות שונות. הנפוץ ביותר הוא השימוש של מיקרוסקופ אלקטרונים (EM), המאפשרת הניתוח של הסינפסה באזורי המוח קומפקטי ללא פגע ועם בהגדלה ברזולוציה. עם זאת, טכניקה זו יקר מאוד, מחייב הכנת הדוגמא מסובך, זמן רב מאוד. טכניקות אחרות כוללות את השימוש במערך טומוגרפיה6, שבו יש חיסרון גדול בכך שהיא דורשת ציוד מיוחדים ויקרים כדי לבצע את הניתוח. יתר על כן, קווים הטרנסגניים לבטא מסוימות סינפטיים סמנים שימושיים-הערכת סינפסה מספר7, אבל הדור של שורות חדשות יכול להיות מגבילים ויקרות, ביטוי של חלבונים עלול לגרום לא רצויים את המטרה פנוטיפים.
בשל מגבלות אלה, פשטות, חוקרים רבים להעריך מספר סינפסה על-ידי בדיקת רמות חלבונים סינפטיים הכולל. עם זאת, אובדן סינפסה יכול להיות שנצפו לפני שינויים משמעותיים חלבון, כתוצאות שיפוץ מבניות סינפטית במהלך פיזור תמורה מראש או הפוסט-סינפטית, עם אין השפלה של חלבונים סינפטיים. יתר על כן, במודעה, רמות חלבונים סינפטיים הן ניוון סינפסה הבאים מופחתת או מוות עצביים8,9. כימות של רמות הכולל אינו מאפשר הבחנה זו. לפיכך, יש צורך לפתח שיטה מדויקת, נגיש ואמין על ההערכה של מספר סינפסה במוח.
במאמר זה, אנו מתארים כיצד לזהות ולקבוע את המספר של הסינפסות באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס ביסודיות. הסינפסות מוגדרים על-ידי colocalization של סמנים מראש ו פוסט-סינפטיים המופיעים הפצה punctate. נדגים את תוקפו של טכניקה זו דרך המחקר של חגיגת איתות במוח. Wnts הם חלבונים המופרש חשוב עבור צורה, חיסול, תחזוקה של הסינפסות. אין ויוו אינדוקציה של אנטגוניסט המופרש של המפל ונ ט, Dickkopf-1 (Dkk1), מוביל לירידה סינפטית סינאפסות תוך שמירה על סינפסות מעכבות ההיפוקמפוס10. אנחנו להמחיש את זיהוי וספירה של סינאפסות סינפסות בהיפוקמפוס פרוסות העכבר למבוגרים לבטא Dkk1 וסמן את transferability של טכניקה זו לסוגים אחרים של רקמות/תרבות ההכנות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5905</td>
			<td>vGlut1 (1:2000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA1-046</td>
			<td>PSD-95 (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>131 004</td>
			<td>vGAT (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>147011</td>
			<td>Gephyrin (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td>MAP2 (1:10000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>706-545-148</td>
			<td>Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175470</td>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td>Fluoromount-G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td>FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Volocity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>203</td>
			<td>No 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1446875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2, 5% CO2</td>
			<td>BOC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Cylinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>7107</td>
			<td>08-1.0mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDkk1 mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKII&#945; rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKII&#945; rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for solutions:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V800372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S30-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices

הסינפסות במוח, הם צמתי מיוחדים בין נוירונים, הקובע את הכוח ואת התפשטות אותות עצביים. המספר של הסינפסות מוסדר בחוזקה במהלך ההתפתחות וההתבגרות עצביים. חשוב לציין, גירעונות במספר סינפסה יכול להוביל בתפקוד הקוגניטיבי. לכן, הערכת מספר סינפסה היא חלק אינטגרלי של הנוירו-ביולוגיה. עם זאת, כפי הסינפסות קטן וקומפקטי במיוחד במוח שלם, ההערכה של המספר המוחלט הוא מאתגר. פרוטוקול זה מתאר שיטה בקלות לזהות ולהעריך סינפסות בהיפוקמפוס פרוסות מכרסמים באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence. הוא כולל הליך שלושה שלבים כדי להעריך את הסינפסות בתמונות באיכות גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית על-ידי ניתוח לוקליזציה שיתוף של חלבונים קדם ו postsynaptic בפרוסות בהיפוקמפוס. זה גם מסביר איך הניתוח מבוצע ונותן דוגמאות מייצגות של הסינפסות סינאפסות והן מעכבות. פרוטוקול זה מספק בסיס מוצק לניתוח של הסינפסות, ניתן להחיל על כל מחקר חוקר את המבנה והתפקוד של המוח.

סינפסה אובדן מתרחשת בשלב מוקדם של מחלות ניווניות כגון AD ו מחלת פרקינסון2,11,12. עם זאת, המנגנונים המולקולריים שבבסיס גירעונות אלה נשארים ממעטים להבין. ליקויים ונ ט איתות קושרו עם AD13,14,15,16,17. Wnts glycoproteins המופרש, לשחק תפקיד חיוני סינפסה היווצרות של אפנון הסינאפסית18,19,20,21. לאחרונה, אנחנו מזוהות Wnts מפתח סמביוזה סינפטית תחזוקת מערכת העצבים בוגרת10,22. לחקור באופן מדויק את ההשפעה של חגיגת איתות על סינפסות ההיפוקמפוס של עכברים מהונדסים, לקחנו יתרון של המוח פרוסה הכנה ו מיקרוסקופיה קונפוקלית להעריך את השינויים במספר סינפסה. זיהינו פרוסות בריא שבו המבנה היה נשמר (איור 2 א). יתר על כן, הבחירה של puncta סינפטית בקפידה הוגדרה, בדחיקת אובייקטים מוכתם גדולים כנראה המייצג מצטברים חלבונים (איור 2B). קריטריון זה הוחל על כל התמונות, עם הפרמטרים באותו ניתוח קפדני.
השתמשנו מערכת מודל הטרנסגניים שגורם הביטוי של אנטגוניסט ונ ט Dkk1 מופרשים למבוגרים עכברים (iDkk1) תחת טטרציקלין לשלוט (ראה הטבלה של חומרים)10,22. להדגים כי המצור על חגיגת איתות בהיפוקמפוס למבוגרים מפעיל סינפסה סינאפסות אובדן במיוחד באזור CA1 שכבה radiatum (איור 3). איור 3A מדגים להחליפן בתמונות קונאפוקלית של סינאפסות סמנים מראש ו פוסט-סינפטיים (vGlut1 ו- PSD-95, בהתאמה) שנרכש בהיפוקמפוס פרוסות של עכברים iDkk1 לבטא Dkk1 שבועיים, כמו גם הפקדים המתאימים שלהם. אנו ניתח את התמונות האלה באמצעות תוכנת Volocity, הדגימו הפחתה משמעותית במספר של הסינפסות סינאפסות, לכמת על ידי לוקליזציה משותף של vGlut1 ו- PSD-95-שכותרתו puncta באזור CA1 ההיפוקמפוס של עכברים iDkk1 בעקבות אינדוקציה של Dkk1 במשך שבועיים (איור 3B, * p &#60; 0.05; מבחן Kruskal-איי ווליס; 6 עכברים לכל גנוטיפ). ב- radiatum הרובד CA1, צומצם המספר puncta סינפסה סינאפסות לכל מיקרומטר 1,0003 בין 500 בעכברים שליטה ל-300 בעכברים iDkk1. לעומת זאת, ביטוי Dkk1 מושרה לא השפיע על המספר של הסינפסות מעכבות (המזוהה על-ידי לוקליזציה שיתוף בין סמנים מראש ו פוסט-סינפטיים vGAT gephyrin, בהתאמה), כפי שמוצג באיור 4A-B (p &#62; 0.05; מבחן Kruskal-איי ווליס; 3 עכברים לכל גנוטיפ).
חשוב לנו לבצע ניתוח עוצמה סטטיסטית כדי להעריך מספר מתאים של פרוסות וחיות הנדרש להפקת תוצאות חזקות אלו. באמצעות R, אנו מחושב כ 35 פרוסות לכל תנאי היו נחוצים (3 תמונות x 3 פרוסות x 6 חיות = 36) כדי לזהות גודל האפקט גדול (f = 0.4) עם 80% ביטחון (כוח = 0.8) אנובה בכיוון אחד עם חסימת ושכפול, כפי שמתואר בשלב 3.2.6.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig3.jpg"> 
איור 3: אובדן של סינאפסות סינפסות בהיפוקמפוס פרוסות עכברים iDkk1. (א) נציג תמונות קונאפוקלית של CA1 שכבה radiatum הצג סינאפסות הסינפסות, המזוהה על-ידי לוקליזציה שיתוף בין vGlut1 ל- PSD-95 (החצים הלבנים). החלונית התחתונה מייצג של הגדלה גבוהה יותר של המלבן המסומן. גודל ברים = 2 מיקרומטר. (B) האחוז של סינאפסות הסינפסות בין שליטה iDkk1 הייתה לכמת באמצעות תוכנה המוזכרים בטבלה של חומרים (* p &#60; 0.05; מבחן Kruskal-איי ווליס; 6 עכברים לכל גנוטיפ). הנתונים הם מייצגים ± ב- SEM... איור זה השתנה בין התייחסות10. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56153/56153fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig4.jpg"> 
איור 4: הסינפסות מעכבות הם ללא שינוי בפרוסות בהיפוקמפוס של עכברים iDkk1. (א) נציג תמונות קונאפוקלית של radiatum הרובד CA1 של הסינפסות מעכבות המזוהה על-ידי לוקליזציה שיתוף בין vGAT לבין gephyrin (החצים הלבנים). החלונית התחתונה מייצג של הגדלה גבוהה יותר של המלבן המסומן. גודל ברים = 2 מיקרומטר. (B) אחוז מעכבות הסינפסות בין עכברים iDkk1 ובקרה, כפי לכמת באמצעות תוכנת Volocity (p &#62; 0.05; מבחן Kruskal-איי ווליס; 3 עכברים לכל גנוטיפ). הנתונים הם מייצגים ± ב- SEM... איור זה השתנה בין התייחסות10. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56153/56153fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>סוכרוז גבוהה חנה המבר רכיבים</td>
			<td>ריכוז</td>
			<td>הערות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>75 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אשלגן כלורי</td>
			<td>2.5 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2PO NaH4, 2 H2O</td>
			<td>1.25 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>חומצה Kynurenic</td>
			<td>1.25 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>פירובט</td>
			<td>2 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0.1 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 מ מ</td>
			<td>להוסיף לאחר חמצון של פתרון</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>4 מ מ</td>
			<td>להוסיף לאחר חמצון של פתרון</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-גלוקוז</td>
			<td>25 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>סוכרוז</td>
			<td>100 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>תא המשוקע רכיבים כלנית חדד</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>125 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אשלגן כלורי</td>
			<td>2.5 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2PO NaH4, 2 H2O</td>
			<td>1.25 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 מ מ</td>
			<td>להוסיף לאחר חמצון של פתרון</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
</tr></tbody></table>			<td>1 מ מ</td>
			<td>להוסיף לאחר חמצון של פתרון</td>
		
		<tr>
			<td>D-גלוקוז</td>
			<td>25 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
	

טבלה 1: חנה המבר ההרכב.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>מאגר חוסם/permeabilizing</td>
			<td>ריכוז</td>
			<td>הערות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>סרום חמור</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>טריטון-X</td>
			<td>0.50%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x PBS</td>
			<td></td>
			<td>ה-pH ל 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>1.37 מטר</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IC.</td>
			<td>27 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2PO NaH4</td>
			<td>100 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2פו ח'4</td>
			<td>18 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% סוכרוז PFA/4%</td>
			<td></td>
			<td>ה-pH ל 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td>לדלל מ 10 x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>כדורגלן</td>
			<td>1.33 מ'</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>סוכרוז</td>
			<td>117 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 2: מאגרים המשמשים immunofluorescent מכתים.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices at JoVE.com

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

נוהל לאיתור ואבחון מדויק סינפסות בהיפוקמפוס פרוסות באמצעות immunofluorescence הוא המתוארים במאמר זה.

הערכה של צפיפות סינפסה פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

evaluation-of-synapse-density-in-hippocampal-rodent-brain-slices

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.8K Views.  University College London. נוהל לאיתור ואבחון מדויק סינפסות בהיפוקמפוס פרוסות באמצעות immunofluorescence הוא המתוארים במאמר זה.

Video: Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

הכנת Oligomeric β עמילואיד 1-42 ו אינדוקציה של ירידת ערך הפלסטיות הסינפטית על Slices בהיפוקמפוס

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

תיוג DiOLISTIC של הנוירונים מפני מכרסמים שאינן פרוסות המוח האנושי הפרימאטים

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation של נוירונים בין פרוסות המוח מכרסמים לחקר הילוכים Synaptic ותמונה מסופי Presynaptic

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

הקלטות תא כל לזווג בפרוסות בהיפוקמפוס Organotypic

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

בהיפוקמפוס ראשי בצפיפות נמוכה תרבות Neuron

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

הקלטה הפלסטיות הסינפטית בפרוסות בהיפוקמפוס חריפה, בהשתתפות של מיחזור - בנפח מצומצם, זלוף- ומערכת ועלייתו-סוג תא

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) is a promising approach when pharmacological treatment fails or neurosurgery is not recommended. Acute brain slices coupled to microelectrode arrays (MEAs) represent a valuable tool to study neuronal network interactions and their modulation by electrical stimulation. As compared to conventional extracellular recording techniques, they provide the added advantages of a greater number of observation points and a known inter-electrode distance, which allow studying the propagation path and speed of electrophysiological signals. However, tissue oxygenation may be greatly impaired during MEA recording, requiring a high perfusion rate, which comes at the cost of decreased signal-to-noise ratio and higher oscillations in the experimental temperature. Electrical stimulation further stresses the brain tissue, making it difficult to pursue prolonged recording/stimulation epochs. Moreover, electrical modulation of brain slice activity needs to target specific structures/pathways within the brain slice, requiring that electrode mapping be easily and quickly performed live during the experiment. Here, we illustrate how to perform the recording and electrical modulation of 4-aminopyridine (4AP)-induced epileptiform activity in rodent brain slices using planar MEAs. We show that the brain tissue obtained from mice outperforms rat brain tissue and is thus better suited for MEA experiments. This protocol guarantees the generation and maintenance of a stable epileptiform pattern that faithfully reproduces the electrophysiological features observed with conventional field potential recording, persists for several hours, and outlasts sustained electrical stimulation for prolonged epochs. Tissue viability throughout the experiment is achieved thanks to the use of a small-volume custom recording chamber allowing for laminar flow and quick solution exchange even at low (1 mL/min) perfusion rates. Quick MEA mapping for real-time monitoring and selection of stimulating electrodes is performed by a custom graphic user interface (GUI).

We illustrate how to perform recording and electrical modulation of 4-aminopyridine-induced epileptiform activity in rodent brain slices using microelectrode arrays. A custom recording chamber maintains tissue viability throughout prolonged experimental sessions. Live electrode mapping and selection of stimulating pairs are performed by a custom graphical user interface.

הקלטה של אפנון של הפעילות פרוסות המוח מכרסמים מצמידים מערכים Microelectrode

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the dendritic filopodia establish contact with a target axon, they begin maturing into spines, leading to the formation of a synapse. Telencephalin (TLCN) is abundantly localized in dendritic filopodia and is gradually excluded from spines. Overexpression of TLCN in cultured hippocampal neurons induces dendritic filopodia formation. We showed that telencephalin strongly binds to an extracellular matrix molecule, vitronectin. Vitronectin-coated microbeads induced phagocytic cup formation on neuronal dendrites. In the phagocytic cup, TLCN, TLCN-binding proteins such as phosphorylated Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM), and F-actin are accumulated, which suggests that components of the phagocytic cup are similar to those of dendritic filopodia. Thus, we developed a method for purifying the phagocytic cup instead of dendritic filopodia. Magnetic polystyrene beads were coated with vitronectin, which is abundantly present in the culture medium of hippocampal neurons and which induces phagocytic cup formation on neuronal dendrites. After 24 h of incubation, the phagocytic cups were mildly solubilized with detergent and collected using a magnet separator. After washing the beads, the binding proteins were eluted and analyzed by silver staining and Western blotting. In the binding fraction, TLCN and actin were abundantly present. In addition, many proteins identified from the fraction were localized to the dendritic filopodia; thus, we named the binding fraction as the dendritic filopodia-rich fraction. This article describes details regarding the purification method for the dendritic filopodia-rich fraction.

In this protocol, we introduce a method for purifying the dendritic filopodia-rich fraction from the phagocytic cup-like protrusion structure on cultured hippocampal neurons by taking advantage of the specific and strong affinity between a dendritic filopodial adhesion molecule, TLCN, and an extracellular matrix molecule, vitronectin.

טיהור של הדנדריטים הדנדריפיאה-חלק עשיר

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

הערכה של האינדוקציה לטווח ארוך של דיכאון פרוסות למבוגרים בלבד

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...