Siamo grati per il sostegno finanziario della Fondazione Whitehall. Vorremmo ringraziare Samuel T. Kissinger per i preziosi commenti.

1. Impostazione del sistema <ol><li> Costruire l&#39;unità di controllo della pressione. <ol><li> Montare l&#39;unità di controllo della pressione in base alla mappa del circuito ( Figura 1 ). Saldare le parti necessarie sul circuito stampato (PCB) realizzato secondo gli schemi dei circuiti elettrici ( figura 1b ). Utilizzare resistori standard, LED, transistori campo-effetto (Semiconductor Metal-Oxide Semiconductor), condensatori e connettori (vedi tabella dei materiali ). Le elettrovalvole a saldare sul PCB. Collegare il sensore della pompa dell&#39;aria e della pressione dell&#39;aria al PCB con filo elettrico. NOTA: Dovrebbe impiegare circa 2 ore per costruire l&#39;unità di controllo pressione con tutte le parti necessarie messe a disposizione. </li></ol></li><li> Collegare la scheda di acquisizione dati secondaria (DAQ). <ol><li> Collegare le uscite dei dati dalla scheda a circuito stampato alla scheda DAQ, seguendo la tabella 1 . NOTA: La scheda DAQ wilSto eseguendo in modalità &quot;Single-ended&quot;. La mappa del porto può essere trovata nel manuale dell&#39;utente (vedi tabella dei materiali ). </li><li> Collegare &quot;AIn Pr S&quot; ad uno dei canali di ingresso analogico (AI) e &quot;R-Gr&quot; a uno dei motivi analogici della scheda secondaria DAQ. </li><li> Collegare l&#39;uscita primaria dall&#39;amplificatore a uno dei canali AI e il suolo al terreno analogico della scheda secondaria DAQ. NOTA: È possibile utilizzare un cavo BNC standard per collegare l&#39;uscita primaria dall&#39;amplificatore. </li><li> Strip l&#39;altra estremità e collegare il segnale positivo ( cioè il rame) al canale AI e al suolo ( cioè il filo sottile intorno al nucleo) al suolo analogico. Ripetere questo passaggio per un secondo canale se viene utilizzato più canali patch. NOTA: L&#39;ingresso analogico alla scheda DAQ verrà configurato in passaggi successivi. </li><li> Collegare l&#39;alimentazione alla potenza della scheda DAQ secondaria. Utilizzare un potere separato da 12 V cosìPer la pompa. </li></ol></li><li> Collegare il tubo. <ol><li> Collegare la pompa dell&#39;aria e le due valvole secondo la Tabella 2 . Utilizzare un connettore a 3 vie per collegare il tubo morbido dalla porta superiore valvola 2, dal sensore di pressione e dal porta pipetta nell&#39;ultimo passaggio. </li><li> Aggiungere un altro connettore a 3 vie al tubo collegato al porta pipetta se si usano due pipette. Passare manualmente tra le valvole e le pipette in uso durante la patch. </li></ol></li><li> Installare Autopatcher IG. NOTA: Requisiti di sistema: Autopatcher IG è stato testato solo su un PC con Windows 7. Non è stato convalidato per altri sistemi operativi. La procedura descritta si applica specificamente all&#39;hardware elencato nella tabella dei materiali. <ol><li> Scarica Autopatcher-IG da GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG). </li><li> Installare Python (vedere la tabella dei materiali per la versione e l&#39;indirizzo di download). </li><li> Disinstallare PyQt4Digitando &quot;pip disinstalla PyQt4&quot; in un terminale di riga di comando. NOTA: il sistema utilizza una versione precedente della libreria PyQt4 per ottenere la compatibilità con le librerie Qwt e Opencv. </li><li> Installare le librerie Python dai file delle ruote storiche (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Trovare i seguenti file: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none -win32.whl) e Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl). <ol><li> Per installare i file ruota, passare alla directory dove vengono salvati i file e digitare &quot;pip install *** wheelfilename ***. Whl.&quot; Sostituisci &quot;*** wheelfilename ***&quot; con il nome effettivo del file. NOTA: &quot;cp27&quot; nel nome del file ruota indica Python 2.7 e &quot;win32&quot; indicano Windows a 32 bit. Se &quot;win32&quot; non funziona, prova &quot;win64&quot;. </li></ol></li><li> Per controllare la telecamera CCD, scaricare e installare il programma di installazionePer 64 bit (https://www.qimaging.com/support/software/). Quindi scaricare MicroManager per 64 bit (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) per controllare la fotocamera in Python. </li><li> Per controllare i manipolatori e la fase del microscopio, installare il software di controllo fornito dal produttore. NOTA: In questo modo viene installato anche il driver necessario per controllare i manipolatori. Il pacchetto di installazione è comunemente fornito in un CD-ROM. </li><li> Per controllare la scheda secondaria DAQ, installare la libreria universale dal CD-ROM, purché l&#39;acquisto della scheda DAQ. </li></ol></li><li> Configurare l&#39;hardware per Autopatcher IG. <ol><li> Collegare lo stadio del microscopio e i manipolatori al computer tramite le porte USB. </li><li> Assegnare i numeri di porta COM all&#39;unità 0: stadio microscopio, unità 1: manipolatore sinistro e unità 2: manipolatore destro, in questo ordine, nel file di configurazione &quot;ports.csv&quot; nella cartella &quot;configurazione&quot;. LEva gli altri parametri nel file ports.csv ( cioè &quot;SCI&quot; ​​e &quot;1&quot;) invariati. NOTA: Le informazioni sul numero di porta COM possono essere trovate eseguendo il software di configurazione del manipolatore fornito dal produttore. Vai alla scheda &quot;Impostazioni&quot;, seleziona &quot;Impostazioni&quot; e la pagina &quot;Movimento&quot; e leggi le etichette per ogni scheda in alto. In alternativa, queste informazioni possono essere trovate nel PC Device Manager. </li><li> Assegnare numeri di canale di ingresso analogico sulla scheda DAQ per un sensore di pressione e il canale di patch 1 e 2 (corrispondente all&#39;unità 1 e 2). Immettere il numero del canale nel file &quot;DAQchannels.csv&quot; nella cartella &quot;configurazione&quot;. NOTA: Si consiglia di aprire i file .csv con l&#39;applicazione Notepad anziché un foglio di calcolo, in quanto potrebbe modificare le informazioni quando si salva le modifiche. </li></ol></li><li> Esegui Autopatcher IG. <ol><li> Accendere l&#39;amplificatore, il controllore del microscopio e il regolatore del manipolatore. EnsuChe il software dell&#39;amplificatore è in esecuzione. </li><li> Eseguire l&#39;Autopatcher IG con Python da un terminale di riga di comando come segue: prima, cambiare la directory (comando &quot;cd&quot; per i terminali più comuni) in cui è installato Autopatcher IG, digitare &quot;Python Autopatcher_IG.pyw&quot; nel terminale di riga di comando e premere &quot;Tasto Invio. NOTA: Non eseguire il software di controllo del manipolatore prima di eseguire Autopatcher IG perché occuperà lo stadio e il manipolatore del microscopio, causando che Autopatcher IG non riesce a trovare l&#39;hardware. Il software di controllo del manipolatore può essere eseguito dopo che Autopatcher IG è completamente avviato se ci sono ulteriori moduli da controllare ( ad esempio, il riscaldatore in linea). </li></ol></li><li> Calibrare la pipetta primaria. <ol><li> Tirare le pipette patch come descritto in precedenza 9 . Riempire una pipetta di vetro tirata con soluzione interna e caricarla sul piano di testa. NOTA: Le pipette vuote di vetro hanno diversi contrasti sottoIl microscopio e può portare a una calibrazione imprecisa. </li><li> Spostare la punta della pipetta nel campo visivo del microscopio e metterlo in messa a fuoco. Se il quadrante è utilizzato per spostare i manipolatori e / o lo stadio microscopico, aggiornare le coordinate premendo &quot;z&quot; sulla tastiera. NOTA: Questa azione non è necessaria se la tastiera (stadio microscopico: asse A / D - x, asse W / S - y, asse R / F - z, manipolatori: H / K - asse x, U / J - asse Y, O / L - asse z, 1/2 - numero di unità) viene utilizzato per controllare il movimento perché le coordinate saranno aggiornate in tempo reale. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Avvia calibrazione&quot; sull&#39;interfaccia grafica utente grafica (GUI) per l&#39;unità corrispondente su cui è caricata la pipetta ( Figura 2 ). NOTA: una finestra popup apparirà quando la calibrazione è terminata. NOTA: La calibrazione verrà eseguita automaticamente, che richiede circa 3,5 min. Cliccando sullo stesso pulsante (ora commutato per &quot;annullare la calibrazione&quot; afTer avviare la calibrazione) interromperà il tentativo di calibrazione. </li><li> Salvare la calibrazione facendo clic su &quot;salva la calibrazione&quot; nella parte inferiore della GUI principale (salva la calibrazione corrente per entrambi i manipolatori e può essere caricata in futuro). NOTA: Il campo visivo in basso (4 o 10 volte) e alto (40x) deve essere allineato per la calibrazione secondaria per funzionare correttamente. Fare riferimento al manuale d&#39;uso del sistema ottico in uso per le procedure di allineamento. </li></ol></li></ol> 2. Procedura di morsetto automatico di patch <ol><li> Preparare le fette acute del cervello, come descritto in precedenza 10 . </li><li> Preparare pipette di vetro per il morsetto patch. </li><li> Posizionare una fetta del cervello al centro della camera di registrazione. Stabilizzare la fetta con una fetta tenere premuta, o &quot;arpa&quot;. </li><li> Rileva la cella fluorescente. <ol><li> Trova l&#39;area di interesse sotto la lente 4X. Spostare la fase del microscopio accendendo il tasto cliCk-to-move (&quot;CTM&quot;) e fare clic sul centro dell&#39;area di interesse. In alternativa, utilizzare la tastiera per spostare la fase del microscopio (asse A / D - x, asse W / S - y, asse R / F - z). </li><li> Passare all&#39;obiettivo ad alto ingrandimento e regolare la messa a fuoco spostando il microscopio nell&#39;asse z, usando R / F sulla tastiera. NOTA: Si consiglia di regolare il livello del bagno d&#39;acqua in modo che il piano focale sotto le lenti a basso e alto ingrandimento siano uguali o simili nell&#39;asse z. </li><li> Fai clic sul pulsante &quot;Rileva cella&quot; nella colonna GUI principale, &quot;Unità 0.&quot; Se il LED o la sorgente luminosa laser dell&#39;impostazione non può essere controllata dal segnale TTL, accendere manualmente il LED / laser; Apparirà una finestra pop-up quando il rilevamento delle celle è terminato. <ol><li> Spegnere il LED / laser se necessario; Un elenco delle coordinate delle celle apparirà nella GUI &quot;Posizioni di memoria&quot;. Rimuovi le cellule indesiderate dall&#39;elenco facendo clic sul pulsante &quot;X&quot; accanto alle coordinate. </li><li>In alternativa, se le celle di destinazione non sono etichettate in fluorescenza, fare clic su &quot;Modalità mouse&quot; nella GUI principale. Clicca sulla cella di interesse; Sulla cella apparirà un punto giallo con un numero e le coordinate della cella appariranno nella GUI &quot;Posizioni di memoria&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Calibrare la pipetta secondaria. <ol><li> Riempire 1/3 di una pipetta di vetro con soluzione interna. Caricare la pipetta sul supporto della pipetta attaccato allo stadio della testa. </li><li> Utilizzare l&#39;obiettivo a basso ingrandimento. Portare la pipetta nel campo visivo e regolare la messa a fuoco usando la tastiera (H / K - asse x, asse U / J - y, asse O / L - z). Usare &quot;1&quot; e &quot;2&quot; per passare dall&#39;unità 1 all&#39;unità 2. </li><li> Caricare la calibrazione primaria facendo clic su &quot;Carica calibrazione&quot;. Fare clic sul pulsante &quot;Calibrazione secondaria&quot; nella GUI principale sotto l&#39;unità in uso. Ad esempio, se l&#39;unità 2 è in uso, fare clic sul pulsante &quot;Calibrazione secondaria&quot; nell&#39;unità &quot;Unit 2&quot;lumn. Seguire le istruzioni della finestra popup per passare all&#39;obiettivo ad alta magnificazione. </li></ol></li><li> Patch una cella di destinazione. <ol><li> Assicurarsi che il software &quot;MultiClamp&quot; (ad es. Amplificatore) sia in esecuzione. Fare clic sul pulsante &quot;Controllo patch&quot; per aprire la GUI &quot;Patch control&quot;; Potrebbe richiedere fino a pochi minuti per aprire questa GUI. </li><li> Utilizzare l&#39;obiettivo di ingrandimento 40X controllando &quot;40X&quot; nella colonna principale dell&#39;unità &quot;Unit 0&quot;. Fare clic sul pulsante &quot;vai a&quot; accanto alla cella di interesse nell&#39;elenco di coordinate nella GUI &quot;Posizione memoria&quot;; Il microscopio si sposterà verso la cella. </li><li> Fare clic sul pulsante CTM dell&#39;unità in uso nella GUI principale per abilitare il movimento dopo un clic del mouse. Clicca sulla cella di interesse; La punta della pipetta si sposterà nella cella. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Patch&quot; sulla GUI &quot;Patch control&quot;. NOTA: L&#39;avvio automatico avrà inizio e la pressione e la resistenza possono essere monitoratiLa GUI &quot;Patch control&quot;. <ol><li> Usare il pulsante &quot;Unit 1 selected&quot; per commutare il segnale di ingresso tra le due unità. NOTA: Il sistema si avvicinerà alla cella di destinazione, applica una pressione negativa, corrisponde al potenziale della membrana cellulare e rileva la formazione gigaseale basata su una serie di soglie di pressione e di resistenza e di logica. </li><li> Manipolare il processo automatico in qualsiasi momento facendo clic sui rispettivi pulsanti sulla GUI &quot;Controllo patch&quot;. Ad esempio, fare nuovamente clic sul pulsante &quot;Patch&quot; per annullare la prova di patch e fare clic su &quot;Prossima tappa&quot; per avanzare il processo di patching al passaggio successivo, indipendentemente dalla soglia. NOTA: Una finestra pop-up notificherà all&#39;utente quando si è formata una gigaseal e verrà presentata l&#39;opzione di applicare zap e una grande pressione negativa. </li></ol></li><li> Selezionare &quot;Sì&quot; per interromperla con zap e aspirazione combinata. In alternativa, selezionare &quot;No&quot; per rompersi solo con aspirazione. <br/&gt; NOTA: quando una riuscita patch di celle intero è completata, una finestra a comparsa ricorda all&#39;utente di salvare il log di patch di esperimenti. </li><li> Salva il registro patch di esperimenti. NOTA: se una prova di patch non è riuscita, una finestra popup informerà l&#39;utente e il processo di patch verrà ripristinato. </li><li> Tornate al punto 2.4 e ripetete i passaggi con una cella diversa. </li></ol></li><li> Raffinare le soglie di patch (opzionale). NOTA: Soglie per la resistenza iniziale della pipetta, pressione positiva e negativa, resistenza gigaseale, ecc . Può essere modificato da un file di configurazione. <ol><li> Aprire il file &quot;PatchControlConfiguration.csv&quot; nella cartella &quot;Configurazione&quot; nella destinazione in cui è installato il sistema. Modificare i numeri corrispondenti a ciascun valore di soglia. Non modificare i nomi dei valori; Ciò comporterà voci non riconoscibili nel sistema. </li><li> Attenersi immediatamente ai nuovi valori di soglia premendo &quot;CtRl + L &quot;senza riavviare il programma; il riavvio del programma implementerà il nuovo valore di soglia dal file. </li></ol></li></ol> 3. Effettuare le registrazioni NOTA: la modalità nell&#39;amplificatore microelettrodo controllato dal computer verrà impostata automaticamente su &quot;Current Clamp&quot; (&quot;IC&quot;) dal software di autopatcher una volta ottenuta una patch di successo. Le registrazioni a morsetto delle patch intere cellule possono essere eseguite usando il software di registrazione di scelta (questo sistema non include una funzione di registrazione). Se sono state identificate più celle di destinazione, dopo aver terminato una registrazione, tornare al passaggio 2.4 e provare un&#39;altra cella. <ol><li> Eseguire esperimenti automatici di applicazione di farmaci locali utilizzando un picospritzer (opzionale). NOTA: Qui viene utilizzato un esperimento di applicazioni locali di droga come esempio per descrivere come utilizzare la funzione &quot;Sequenza di comando&quot; aggiuntiva per controllare l&#39;hardware esterno tramite i segnali TTL. <ol><li> Collegare la porta A chaNnel 0 e il terreno sulla scheda DAQ secondaria all&#39;ingresso di trigger trigger sul digitizzatore utilizzando un cavo BNC spogliato (come descritto nel punto 1.2.3). Collegare un canale di uscita digitale sul digitizzatore al trigger esterno sul picospritzer. </li><li> Preparare il picospritzer secondo il manuale dell&#39;utente. Collegare l&#39;uscita dell&#39;aria picospritzer al supporto della pipetta di droga collegato ad un micromanipolatore. </li><li> Caricare una pipetta piena di un farmaco scelto. Fissarlo al porta pipetta. Calibrare la pipetta, come descritto nel punto 1.7. </li><li> Dopo aver patchato una cella come descritto al passaggio 2.6, selezionare la posizione desiderata per la somministrazione di droga cliccando con il mouse nella GUI della visualizzazione della fotocamera in &quot;modalità mouse&quot; (commutata dalla GUI principale). In alternativa, utilizzare la GUI &quot;Griglia&quot; per progettare una griglia, con ogni pixel della griglia come una delle destinazioni di destinazione. NOTA: la griglia può essere manipolata nella GUI della visualizzazione della telecamera trascinandola con il mouse. </li><li> Nella sezione &quot;Command SequClicca su &quot;carica punti mouse&quot; o &quot;punti di griglia di carico&quot; per importare tutte le coordinate per la consegna della droga. <ol><li> Fare clic su ogni voce di coordinate per modificare il segnale specifico TTL di comando nella colonna di destra. Nella prima voce di comando, fare clic sulla cifra più a destra per spostarla da &quot;0&quot; a &quot;1&quot;, inviando un segnale TTL + 5 V. Impostare il tempo (T) alla durata del segnale TTL desiderato, in ms. </li><li> Nella seconda voce di comando, impostare tutte le cifre su &quot;0&quot; e impostare T sulla durata della lunghezza di registrazione della prova. Modifica comandi per tutte le voci di coordinate. Aggiungere le voci di comando facendo clic su &quot;+&quot; se sono necessari più segnali TTL. NOTA: I bit a 8 cifre rappresentano i canali A di porta 0-7 sul DAQ secondario (le porte 1 - 3 sono occupate dalla pompa e da due valvole), se necessario, può essere commutato. </li></ol></li><li> Creare così un protocollo di registrazione nel modulo di acquisizione datiChe l&#39;avvio di una spazzata viene attivato dal trigger di avvio esterno. Modificare il protocollo per consegnare il farmaco all&#39;ora desiderata. </li><li> Nella GUI &quot;Comando Sequenza&quot;, fai clic su &quot;Esegui&quot; a sinistra per eseguire tutte le coordinate. In alternativa, fai clic su &quot;Esegui&quot; a destra per eseguire solo la sequenza selezionata. NOTA: la pipetta si sposterà ad ogni coordinata ed esegue il segnale TTL come definito per avviare la registrazione. </li></ol></li></ol>

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Una domanda di brevetto non provvisorio &quot;SISTEMI E METODI PER L&#39;ELETTROFISIOLOGIA DI PATCH CLIP ELETROFISIOLOGICO AUTOMATICO GUIDATA IN VITRO&quot;, US N ° di serie: 15 / 353,719, è stata depositata il 16 novembre 2016, rif. N. PRF 67270-02.

Qui descriviamo un metodo per le registrazioni automatiche delle morsetti di patch guidate dall&#39;immagine in vitro . I passi chiave di questo processo sono riepilogati come segue. Innanzitutto, la visione informatica viene utilizzata per riconoscere automaticamente la punta della pipetta usando una serie di immagini acquisite tramite un microscopio. Queste informazioni vengono poi utilizzate per calcolare la funzione di trasformazione delle coordinate tra il microscopio ei sistemi di coordinate del manipolatore. La visione del computer viene utilizzata per rilevare automaticamente le celle con etichette fluorescenti e per identificare le loro coordinate. Questi passaggi sono integrati con il targeting pipetta e l&#39;algoritmo di patch automatico utilizzando il linguaggio di programmazione Python open source, PyQT e OpenCV. Rispetto ai metodi di messa a punto in vitro , questo sistema migliora notevolmente le diverse aree. Riduce l&#39;intervento umano. Questo sistema automatizza la maggior parte dei passaggi nell&#39;esperimento di clamp patch, minimizzando il reqPer l&#39;intervento umano. Alcuni dei passaggi manuali rimanenti, compresa la commutazione tra le lenti a microscopio a basso / alto ingrandimento, possono essere automatizzate usando hardware aggiuntivo motorizzato. Il metodo di patch-clamp migliora il throughput. Gli esperimenti di patch-clamp usando questo sistema hanno raggiunto livelli di successo più elevati e tempi più brevi per ogni processo, contribuendo a un significativo aumento del throughput complessivo. L&#39;algoritmo di visione del computer per la rilevazione delle celle fluorescenti e la rilevazione della punta pipetta è molto robusto e il tasso di errore è stato molto basso. L&#39;errore medio per la rilevazione della punta della pipetta era di 1,6 μm e il tasso falso positivo per la rilevazione delle cellule fluorescenti era del 4,9% ± 2,25%. È stato fatto un confronto dettagliato tra la patch manuale manuale e la patch automatica 6 . È possibile una documentazione dettagliata degli esperimenti. I registri delle patch di ciascun processo possono essere salvati e analizzati post hoc . Queste dettagliateLa documentazione non era disponibile per la patch manuale. Ciò consente l&#39;analisi sistematica degli esperimenti di patching in condizioni sperimentali uniche, tipi di cellule, specie e preparazioni di fetta. Questo metodo dimostra la compatibilità con le attrezzature standard in vitro di fissaggio patch. Il nostro sistema, come dimostrato in questo manoscritto, è stato progettato per aumentare gli impianti esistenti di morsetti di patch in vitro , dando loro la capacità di effettuare patching automatico. A differenza dell&#39;approccio a patch planare, questo sistema è adatto a laboratori che eseguono già blocchi di patch manuali per convertire le loro apparecchiature a costi minimi. Allo stesso tempo, c&#39;è ancora l&#39;opzione di patch manualmente o semi-automaticamente utilizzando lo stesso sistema. A causa dell&#39;adattabilità del sistema di cui sopra, il collegamento dell&#39;hardware e la configurazione del software è richiesto dall&#39;esperto quando il sistema viene impostato per la prima volta. Possono verificarsi problemiDa assegnazione errata delle porte e librerie di driver inadeguate per il controllo di alcuni hardware. Per la risoluzione dei problemi, fare riferimento ai passaggi 1.2 - 1.4. Rispetto all&#39;automazione parziale dei sistemi esistenti, questo sistema raggiunge il massimo livello di automazione nel connettore convenzionale in vitro di bloccaggio delle fette acute del cervello (e di altri preparati in vitro ). Questo vale per tutti i passaggi, dalla rilevazione delle celle alla calibrazione delle pipette alla patch 7 , 11 . L&#39;unico collo di bottiglia è il processo manuale di riempimento e sostituzione delle pipette patch tra i sentieri. I recenti sviluppi nel riutilizzo delle pipette patch potrebbero risolvere il problema 12 . Oltre alla qualità della preparazione delle fette, il motivo più comune per le prove non riuscite deriva da errori meccanici del manipolatore e dal movimento della fetta nella camera. Queste limitazioni sono al di là del nostro controllosistema corrente. Si stanno facendo degli sforzi per attuare il rilevamento in tempo reale e il controllo del movimento a pipetta per tenere conto di questo problema. Per lo sviluppo futuro, siamo interessati a espandere le attuali capacità di rilevamento delle celle fluorescenti a rilevare le cellule generali in ottica DIC.

La tecnica della pinzetta patch è stata sviluppata da Neher e Sakmann negli anni &#39;70 per studiare i canali ionici delle membrane eccitabili 1 . Da allora, il bloccaggio della patch è stato applicato allo studio di molti soggetti diversi a livello cellulare, sinaptico e a livello di circuito sia in vitro che in vivo, in diversi tipi di cellule, inclusi neuroni, cardiomiociti, oociti Xenopus e liposomi artificiali 2 . Questo processo prevede la corretta identificazione e il targeting di una cella di interesse, il controllo di micromanipulatore intricato per spostare la pipetta patch in prossimità della cella, l&#39;applicazione di una pressione positiva e negativa alla pipetta nel momento giusto per stabilire una patch gigasea stretta, E un break-in per stabilire una configurazione di patch di cellule intere. Il bloccaggio delle patch viene tipicamente eseguito manualmente e richiede un&#39;estesa formazione per il master. Anche per un ricercatore esperto con la patchMorsetto, il tasso di successo è relativamente basso. Più recentemente, sono stati fatti diversi tentativi per automatizzare gli esperimenti di patch-clamp. Due strategie principali si sono evolute per realizzare l&#39;automazione: aumentando le apparecchiature standard di bloccaggio delle patch per fornire il controllo automatico del processo di patching e la progettazione di nuove attrezzature e tecniche dal punto di vista fondamentale. L&#39;ex strategia è adattabile all&#39;hardware esistente e può essere utilizzata in una varietà di applicazioni di morsetti di patch, tra cui in vivo patch morsetto patch 3 , 4 , 5 in vitro di patch patch di cervelli acuti, colture organotipiche di fetta e neuroni dissocati coltivati 6 . Permette l&#39;interrogazione di circuiti locali complessi utilizzando simultaneamente più micromanipulatori 7 . Il metodo di patch pianistico è un esempio della nuova strategia di sviluppo, che può raggiungere l&#39;elevato throughput simultaneo pMorsetto di cellule in sospensione per scopi di screening dei farmaci 8 . Tuttavia, il metodo di patch planare non è applicabile a tutti i tipi di cellule, in particolare i neuroni con lunghi processi o circuiti intatti che contengono collegamenti estesi. Questo limita la sua applicazione alla mappatura dei circuiti intricati del sistema nervoso, che è un vantaggio fondamentale della tecnologia tradizionale patch clamp. Abbiamo sviluppato un sistema che automatizza il processo di morsetto di patch in vitro incrementando l&#39;hardware standard di patch clamp. Il nostro sistema, Autopatcher IG, fornisce la calibrazione automatica delle pipette, l&#39;identificazione del bersaglio a fluorescenza, il controllo automatico del movimento delle pipette, la patch automatica delle cellule intere e la registrazione dei dati. Il sistema può acquisire automaticamente più immagini di fette del cervello a diverse profondità; Analizzarli usando la visione del computer; E estrarre informazioni, incluse le coordinate delle cellule etichettate con fluorescenza. Queste informazioni possono essere alloraUtilizzati per mirare e bloccare automaticamente le celle di interesse. Il software è scritto in Python - un linguaggio di programmazione gratuito e aperto - utilizzando diverse librerie a sorgenti aperte. Ciò assicura la sua accessibilità ad altri ricercatori e migliora la riproducibilità e il rigore degli esperimenti di elettrofisiologia. Il sistema ha un design modulare, in modo tale che gli hardware aggiuntivi possano essere facilmente interfacciati con l&#39;attuale sistema dimostrato qui.

<table width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">CCD Camera</td>
			<td style="width:115px;">QImaging</td>
			<td style="width:147px;">Rolera Bolt</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="width:231px;height:101px;">Electrophysiology rig</td>
			<td style="width:115px;">Scientifica</td>
			<td style="width:147px;">SliceScope Pro 2000</td>
			<td style="width:256px;">Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is &#8220;Linlab2&#8221;.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Amplifier</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:147px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:256px;">computer-controlled microelectrode amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Digitizer</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:147px;">Axon Digidata 1550</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="width:231px;height:55px;">LED light source</td>
			<td style="width:115px;">Cool LED</td>
			<td style="width:147px;">pE-100</td>
			<td style="width:256px;">488nm wavelength</td>
		</tr>
		<tr height="98">
			<td height="98" style="width:231px;height:98px;">Data acquisition board</td>
			<td style="width:115px;">Measurement Computing</td>
			<td style="width:147px;">USB1208-FS</td>
			<td style="width:256px;">Secondary DAQ. 
			See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">Solenoid valves</td>
			<td style="width:115px;">The Lee Co.</td>
			<td style="width:147px;">LHDA0531115H</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Air pump</td>
			<td style="width:115px;">Virtual industry</td>
			<td style="width:147px;">VMP1625MX-12-90-CH</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Air pressure sensor</td>
			<td style="width:115px;">Freescale semiconductor</td>
			<td style="width:147px;">MPXV7025G</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Slice hold-down</td>
			<td style="width:115px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:147px;">64-1415 (SHD-40/2)</td>
			<td style="width:256px;">Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Python</td>
			<td style="width:115px;">Anaconda</td>
			<td style="width:147px;">version 2.7 (32-bit for windows)</td>
			<td style="width:256px;">https://www.continuum.io/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:231px;height:20px;">Screw Terminals</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:115px;height:41px;">Sparkfun</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:147px;height:41px;">PRT - 08084</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:256px;height:41px;">Screw Terminals 3.5mm Pitch (2-Pin)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">(2-Pin)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">N-Channel MOSFET 60V 30A</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM - 10213</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="75">
			<td height="75" style="width:231px;height:75px;">DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-07937</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">LED - Basic Red 5mm</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM-09590</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">LED - Basic Green 5mm</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM-09592</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="99" style="width:231px;height:99px;">DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-12748</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="99" style="width:231px;height:99px;">Wall Adapter Power Supply - 12VDC 600mA</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">TOL-09442</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="159">
			<td height="159" style="width:231px;height:159px;">Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-11367</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="75">
			<td height="75" style="width:231px;height:75px;">Locking Male x Female X Female Stopcock</td>
			<td style="width:115px;">ARK-PLAS</td>
			<td style="width:147px;">RCX10-GP0</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="width:231px;height:77px;">Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings</td>
			<td style="width:115px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:147px;">14-171-129</td>
			<td style="width:256px;">Outer Diameter: 1/8 in. 
			Inner Diameter: 1/16 in.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">BNC male to BNC male coaxial cable</td>
			<td style="width:115px;">Belkin Components</td>
			<td style="width:147px;">F3K101-06-E</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">560 Ohm Resistor (5% tolerance)</td>
			<td style="width:115px;">Radioshack</td>
			<td style="width:147px;">2711116</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">Picospritzer</td>
			<td style="width:115px;">General Valve</td>
			<td style="width:147px;">Picospritzer II</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices

Il morsetto di patch a cellule intere è il metodo standard gold per misurare le proprietà elettriche delle singole cellule. Tuttavia, il morsetto di patch in vitro rimane una tecnica impegnativa e di bassa produttività grazie alla sua complessità e all&#39;alta dipendenza dal funzionamento e dal controllo da parte degli utenti. Questo manoscritto dimostra un sistema di bloccaggio automatico delle patch per le esperienze di morsetti di patch a cellule in vitro in fette acute del cervello. Il nostro sistema implementa un algoritmo basato su visione informatica per rilevare le celle con etichette fluorescenti e per indirizzarle per la patch completamente automatica usando un micromanipulator e un controllo interno della pressione della pipetta. L&#39;intero processo è altamente automatizzato, con requisiti minimi per l&#39;intervento umano. Le informazioni sperimentali in tempo reale, tra cui la resistenza elettrica e la pressione interna della pipetta, sono documentate elettronicamente per analisi futura e per ottimizzazione a diversi tipi di cellule. Anche se il nostro sistema è descritto nel contesto di brai acutiN può essere applicato anche alla messa a punto automatizzata di patch di neuroni dissociati, culture di fetta organotipica e altri tipi di cellule non neuronali.

<html> Il nostro sistema è stato testato sulla sua capacità di patch delle cellule in fette cerebrali acute, cellule staminali pluripotenti indotte da mouse (iPSCs) differenziate in neuroni e cellule HEK 293 artificialmente esprimendo canali di interesse. La Figura 3 mostra un esperimento che usa i topi transgenici Thy1-ChR2-YFP (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) targeting neuroni piramidali strati 5 fluorescenti etichettati nella corteccia visiva. La cellula bersaglio era una delle cellule fluorescenti-positive positive verdi ( Figura 3b ). Figura 3a è l&#39;immagine Differenziale Interferenze Contrast (DIC) del neurone patchato. La configurazione delle cellule intere è stata ottenuta con il protocollo di patch automatico nei passaggi 2.5-2.6 ed è stata convalidata dai potenziali di azione indotta dall&#39;iniezione della corrente di fase ( figura 3c ) 1 &quot;&gt; Per dimostrare la funzione aggiuntiva di&quot; Command Sequence &quot;, abbiamo consegnato 500 mM di KCl per 200 ms a tre posizioni su una fetta del cervello durante la patch di una cella ( Figura 4 ): in primo luogo abbiamo selezionato 3 sedi sulla fetta del cervello: Al coordinato è stato memorizzato nella GUI &quot;Command Sequence&quot; sotto &quot;Unit1&quot;, che è stato il manipolatore che il KCl- Contenente pipetta è stata montata sopra. Abbiamo impostato i comandi nella colonna sinistra per inviare un segnale TTL a + 5 V per 500 ms, seguito da 0 V per 10 s ( Figura 4a ), dal canale A del canale 0 sulla scheda DAQ secondaria, Che è stato collegato all&#39;input di &quot;trigger start&quot; del digitalizzatore, la figura 4c mostra che la cella è stata regolarmente un neurone spingente, mentre la pipetta per l&#39;applicazione della droga (unità 1) ha attraversato le tre posizioni selezionate( Figura 4b ), e abbiamo registrato 10 s per ogni applicazione sotto tensione di bloccaggio ( Figura 4d ). Il colore delle tracce di Figura 4d corrisponde al colore del bordo in Figura 4b . Quando KCl è stato soffiato alla cella, è stata osservata una grande corrente interna che diminuiva lentamente quando KCl si diffuse. La colorazione fluorescente rossa è stata aggiunta alla soluzione KCl per indicare la distribuzione spaziale della somministrazione di farmaci e viene imaging usando DIC combinato e immagini epifluorescenti. Questo esperimento ha illustrato la facilità e la flessibilità del nostro sistema per controllare il movimento del manipolatore / microscopio e l&#39;hardware esterno attraverso i segnali TTL. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig1.jpg" /> Figura 1. Unità di controllo pressione. A: Circuito stampato (PCB) per il collegamento delle valvole, pressioneSensore e pompa dell&#39;aria. La sinistra mostra i dettagli sul PCB, posizioni di etichettatura delle uscite indicate nel protocollo. La destra mostra la connessione tra il PCB e la pompa dell&#39;aria, la porta USB e il tubo. B: Mappa del circuito per il PCB. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56010/56010fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig2.jpg" /> Figura 2. GUI Autopatcher. I pulsanti menzionati nel protocollo sono indicati in quadrati rossi e sono numerati. 1: avviare la calibrazione, 2: salvare la calibrazione, 3: calibrazione di caricamento, 4: calibrazione secondaria, 5: rilevare la cella, 6: controllo delle patch, 7: andare alla (coordinata delle celle di destinazione) e 8: patch. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56010/56010fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura</a>. <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig3.jpg" /> Figura 3. Un esempio della cellula positiva ChR2-YFP-positive. A: ingrandimento 40X sotto l&#39;ottica DIC. B: immagine di epifluorescenza della stessa cella nel pannello A (illuminazione LED a 488 nm). C: registrazioni di corrente-bloccaggio dalla cella installata durante una serie di iniezioni di corrente a passo di iperpolarizzazione e depolarizzazione. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56010/56010fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig4.jpg" /> Figura 4. Condurre un esperimento automatizzato di consegna di farmaci. A: località selezionate caricate nella GUI &quot;Command Sequence&quot;. Viene visualizzata la colonna a sinistraL&#39;elenco delle coordinate e la colonna a destra visualizza l&#39;elenco dei comandi sotto forma di segnali TTL per ciascuna posizione. B: schermate durante l&#39;esperimento di applicazione della droga corrispondente alle tre posizioni selezionate. L&#39;unità 1 era la pipetta contenente KCl e l&#39;unità 2 era la pipetta di patch. La soluzione KCl è stata mescolata con il colorante fluorescente rosso allo scopo di visualizzare. Le immagini sono state ottenute combinando DIC e fluorescenza. C: Iniezioni in corso di fase che mostrano un normale neurone spingente. D: Le tracce di tensione-clamp registrano dall&#39;applicazione locale di 500 mM KCl soluzione in tre posizioni. La traccia rossa con corrente interna è stata registrata dal processo quando l&#39;applicazione KCl era vicino alla cella. La freccia rossa indica la tempistica dell&#39;applicazione KCl. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56010/56010fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1"Fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot; per: keep-with-next.within-page = &quot;sempre&quot;&gt; <tbody><tr><td> Presa sul PCB </td><td> Nome della porta sulla scheda DAQ </td><td> Porta # sulla scheda DAQ </td><td> osservazione </td></tr><tr><td> DOUT V1 </td><td> Porta un canale 1 </td><td> 22 </td><td> Valvola di controllo 1 </td></tr><tr><td> DOUT V2 </td><td> Porta un canale 2 </td><td> 23 </td><td> Valvola di controllo 2 </td></tr><tr><td> DOUT P </td><td> Porta un canale 3 </td><td> 24 </td><td> Controllare la pompa dell&#39;aria </td></tr><tr><td> Gr </td><td> Terra </td><td> 29 </td><td> Terra </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Scheda di circuito stampato (PCB) alla configurazione del collegamento scheda di acquisizione dati secondaria (DAQ). Utilizzare questa tabella per collegare le uscite PCB (prima colonna da sinistra) alle porte della scheda DAQ (seconda colonna da sinistra). Il nome e il numero della porta sul DAQ secondario si riferiscono alla modalità singola fine. <img alt="Tavolo 2" src="/files/ftp_upload/56010/56010table2.jpg" /> Tabella 2. Collegamenti del tubo dall&#39;unità di controllo della pressione al supporto (i) della pipetta. Per ogni connessione, collegare le porte corrispondenti, evidenziate con una scatola grigia, utilizzando tubi morbidi (vedere la tabella dei materiali ).

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Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Questo protocollo descrive come effettuare esperimenti automatici con patch-cluster guidati dall&#39;immagine utilizzando un sistema recentemente sviluppato per apparecchiature elettrofisiologiche standard in vitro .

Applicazione di morsetto di patch automatico guidato per immagini per lo studio dei neuroni in fettine di cervello

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

application-automated-image-guided-patch-clamp-for-study-neurons

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K Views.  Purdue University.  Questo protocollo descrive come effettuare esperimenti automatici con patch-cluster guidati dall'immagine utilizzando un sistema recentemente sviluppato per apparecchiature elettrofisiologiche standard in vitro . 

Video: Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

Coltura ed Elettrofisiologia di Celle NRCC patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

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Neuroscienze

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-clamp Misure di capacità e Ca 2 + Imaging terminazioni nervose della retina singola in Fette

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent neuropsychiatric disorder that stems from the biophysical and cellular actions of nicotine on nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) throughout the central nervous system. Understanding the various nAChR subtypes that exist in brain areas relevant to nicotine addiction is a major priority.
Experiments that employ electrophysiology techniques such as whole-cell patch clamp or two-electrode voltage clamp recordings are useful for pharmacological characterization of nAChRs of interest. Cells expressing nAChRs, such as mammalian tissue culture cells or Xenopus laevis oocytes, are physically isolated and are therefore easily studied using the tools of modern pharmacology. Much progress has been made using these techniques, particularly when the target receptor was already known and ectopic expression was easily achieved. Often, however, it is necessary to study nAChRs in their native environment: in neurons within brain slices acutely harvested from laboratory mice or rats. For example, mice expressing "hypersensitive" nAChR subunits such as &alpha;4 L9&prime;A mice 1 and &alpha;6 L9&prime;S mice 2, allow for unambiguous identification of neurons based on their functional expression of a specific nAChR subunit. Although whole-cell patch clamp recordings from neurons in brain slices is routinely done by the skilled electrophysiologist, it is challenging to locally apply drugs such as acetylcholine or nicotine to the recorded cell within a brain slice. Dilution of drugs into the superfusate (bath application) is not rapidly reversible, and U-tube systems are not easily adapted to work with brain slices.
In this paper, we describe a method for rapidly applying nAChR-activating drugs to neurons recorded in adult mouse brain slices. Standard whole-cell recordings are made from neurons in slices, and a second micropipette filled with a drug of interest is maneuvered into position near the recorded cell. An injection of pressurized air or inert nitrogen into the drug-filled pipette causes a small amount of drug solution to be ejected from the pipette onto the recorded cell. Using this method, nAChR-mediated currents are able to be resolved with millisecond accuracy. Drug application times can easily be varied, and the drug-filled pipette can be retracted and replaced with a new pipette, allowing for concentration-response curves to be created for a single neuron. Although described in the context of nAChR neurobiology, this technique should be useful for studying many types of ligand-gated ion channels or receptors in neurons from brain slices.

In this paper, we describe a useful method to study ligand-gated ion channel function in neurons of acutely isolated brain slices. This method involves the use of a drug-filled micropipette for local application of drugs to neurons recorded using standard patch clamp techniques.

Applicazione locale di farmaci allo studio delle funzioni recettore nicotinico in fettine di cervello del mouse

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolamento dei neuroni sensoriali<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Per Bloccare Registrazioni patch di correnti glutamatergico

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

Un multi-elettrodo patch-clamp Computer System-assistita

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcellulari patch-clamp dal dominio Somatodendritic di nigral dopamina neuroni

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug application during electrophysiological recording is the puff technique, which can be used to study the effect of pharmacological reagents on neuronal activities in brain slices. The greatest advantage of puff application is that the drug concentration around the recording site increases rapidly, thus preventing desensitization of membrane receptors. Successful use of puff application involves careful attention to the following elements: the concentration of the drug, the parameters of the puff micropipette, the distance between the tip of a puff micropipette and the neuron recorded, and the duration and pressure driving the puff (pounds per square inch, psi). This article describes a step-by-step procedure for recording whole-cell currents induced by puffing gamma-aminobutyric acid (GABA) onto a neuron of a prefrontal cortical slice. Notably, the same procedure can be applied with minor modifications to other brain areas such as the hippocampus and the striatum, and to different preparations, such as cell cultures.

We describe the puff technique, by which pharmacological reagents can be administered during whole-cell patch-clamp recording, and highlight various aspects of the features that are crucial for its success.