Wir sind dankbar für die finanzielle Unterstützung der Whitehall Foundation. Wir danken Samuel T. Kissinger für die wertvollen Kommentare.

<ol>
	<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+liposome+preparation+for+imaging+and+patch-clamp+electrophysiology.">Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo.">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).</li><li>Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MATLAB-based+automated+patch-clamp+system+for+awake+behaving+mice.">MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice.</a> J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+operation+of+the+autopatcher+for+automated+intracellular+neural+recording+in+vivo.">Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo.</a> Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+autopatching+with+automated+pipette+and+cell+detection+in+vitro.">Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro.</a> J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).</li><li>Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computer-assisted+multi-electrode+patch-clamp+system.">A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system.</a> J Vis Exp. (80), e50630 (2013).</li><li>Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+cell+patch+clamp+recording+performed+on+a+planar+glass+chip.">Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip.</a> Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. (20), (2008).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACQ4:+an+open-source+software+platform+for+data+acquisition+and+analysis+in+neurophysiology+research.">ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research.</a> Front Neuroinform. 8 (3), (2014).</li><li>Kolb, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning+patch-clamp+pipettes+for+immediate+reuse.">Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li></ol>

Eine nicht vorläufige Patentanmeldung &quot;SYSTEME UND METHODEN FÜR AUTOMATISIERTE BILDGEFÜHRTE PATCH-CLAMP-ELEKTROPHYSIOLOGIE IN VITRO&quot; US Serial Nr .: 15 / 353,719, wurde am 16. November 2016 eingereicht, Ref. Nr .: PRF 67270-02.

Hier beschreiben wir eine Methode für automatische bildgeführte Patch-Clamp-Aufnahmen in vitro . Die wichtigsten Schritte in diesem Prozess sind wie folgt zusammengefasst. Zuerst wird Computer Vision verwendet, um die Pipettenspitze automatisch mit einer Reihe von Bildern zu erkennen, die über ein Mikroskop aufgenommen wurden. Diese Information wird dann verwendet, um die Koordinatentransformationsfunktion zwischen dem Mikroskop und den Manipulator-Koordinatensystemen zu berechnen. Computer Vision wird verwendet, um automatisch fluoreszenzmarkierte Zellen zu erkennen und ihre Koordinaten zu identifizieren. Diese Schritte sind mit Pipetten-Targeting und dem automatischen Patching-Algorithmus unter Verwendung der Open-Source-Python-Programmiersprache, PyQT und OpenCV-Bibliotheken integriert. Im Vergleich zu bestehenden In-vitro- Patch-Clamp-Methoden macht dieses System in den verschiedenen Bereichen deutliche Verbesserungen. Es minimiert menschliches Eingreifen. Dieses System automatisiert die meisten Schritte im Patch-Clamp-Experiment, minimiert die AnforderungFür menschliches Eingreifen. Einige der verbleibenden manuellen Schritte, einschließlich der Umschaltung zwischen den Low- / High-Magnification-Mikroskop-Objektiven, können mit zusätzlichen motorisierten Hardware automatisiert werden. Die Patch-Clamp-Methode verbessert den Durchsatz. Patch-Clamp-Experimente mit diesem System erzielten höhere Erfolgsraten und kürzere Zeiten für jede Studie, was zu einer deutlichen Steigerung des Gesamtdurchsatzes beiträgt. Der Computer-Vision-Algorithmus für die Fluoreszenzzellenerfassung und die Pipettenspitzenerkennung ist sehr robust und die Fehlerrate war sehr gering. Der durchschnittliche Fehler für die Pipettenspitzenerfassung betrug 1,6 μm, und die falsch-positive Rate für die Fluoreszenzzelldetektion betrug 4,9% ± 2,25%. Ein detaillierter Vergleich zwischen traditionellen manuellen Patching und automatischen Patching wurde gemacht 6 . Detaillierte Dokumentation von Experimenten ist möglich. Patch-Protokolle jeder Studie können gespeichert und analysiert werden post-hoc . So ausführlichDie Dokumentation war bisher nicht für das manuelle Patching verfügbar. Dies ermöglicht die systematische Analyse von Patching-Experimenten in einzigartigen experimentellen Bedingungen, Zelltypen, Spezies und Slice-Präparaten. Diese Methode zeigt die Kompatibilität mit Standard- In-vitro- Patch-Clamp-Ausrüstung. Unser System, wie in diesem Manuskript gezeigt, wurde entwickelt, um bestehende in vitro Patch-Clamp-Rigs zu erweitern, so dass sie die Fähigkeit, automatische Patching zu führen. Im Gegensatz zum Planar-Patch-Ansatz eignet sich dieses System auch für Laboratorien, die bereits eine manuelle Patch-Clamping durchführen, um ihre Geräte zu minimalen Kosten umzuwandeln. Gleichzeitig gibt es noch die Möglichkeit, manuell oder halbautomatisch mit demselben System zu patch. Wegen der Anpassungsfähigkeit des oben erwähnten Systems ist die Verbindung der Hardware und die Konfiguration der Software vom Experimentator erforderlich, wenn das System zum ersten Mal eingerichtet wird. Probleme können auftretenVon falscher Portzuweisung und unzureichenden Treiberbibliotheken für die Steuerung bestimmter Hardware. Bitte beachten Sie die Schritte 1.2 - 1.4 bei der Fehlersuche. Im Vergleich zur Teilautomatisierung bestehender Anlagen erreicht dieses System bei der konventionellen In-vitro- Patch-Clamping von akuten Hirnschnitten (und anderen in vitro- Präparaten) den maximalen Automatisierungsgrad. Dies gilt für alle Schritte, von der Zellenerkennung bis zur Pipettenkalibrierung bis zum Patching 7 , 11 . Der einzige Engpass ist der manuelle Prozess des Füllens und Änderns der Patchpipetten zwischen den Trails. Die jüngsten Entwicklungen bei der Wiederverwendung von Patchpipetten können dieses Problem potenziell lösen 12 . Neben der Qualität der Scheibenvorbereitung entsteht der häufigste Grund für erfolglose Versuche von manipulatorischen mechanischen Fehlern und der Bewegung der Scheibe in der Kammer. Diese Einschränkungen sind außerhalb unserer Kontrolleaktuelles System. Es werden Anstrengungen unternommen, um eine enge, Echtzeit-Erkennung und Steuerung der Pipettenbewegung zu implementieren, um dieses Problem zu berücksichtigen. Für die zukünftige Entwicklung sind wir daran interessiert, die derzeitigen Fluoreszenzzellen-Erkennungsfunktionen auf die allgemeine Zelldetektion unter DIC-Optik zu erweitern.

Die Patch - Clamp - Technik wurde zuerst von Neher und Sakmann in den 1970er Jahren entwickelt , um die Ionenkanäle von erregbaren Membranen 1 zu studieren. Seitdem wurde die Patch-Clamping auf die Untersuchung vieler verschiedener Subjekte auf zellulärer, synaptischer und Circuit-Ebene angewendet - sowohl in vitro als auch in vivo - in vielen verschiedenen Zelltypen, einschließlich Neuronen, Kardiomyozyten, Xenopus-Oozyten und künstlichen Liposomen 2 . Dieser Prozess beinhaltet die korrekte Identifizierung und Ausrichtung einer Zelle von Interesse, komplizierte Mikromanipulator-Steuerung, um die Patch-Pipette in der Nähe der Zelle zu bewegen, die Anwendung von positiven und negativen Druck auf die Pipette zur richtigen Zeit, um eine enge Gigaseal Patch, Und ein Einbruch, um eine Ganzzell-Patch-Konfiguration zu etablieren. Patch-Clamping wird in der Regel manuell durchgeführt und erfordert umfangreiche Schulungen zu meistern. Auch für einen Forscher, der mit dem Patch erlebt wurdeKlemme, die Erfolgsquote ist relativ gering. In jüngster Zeit wurden mehrere Versuche unternommen, Patch-Clamp-Experimente zu automatisieren. Zwei Hauptstrategien haben sich entwickelt, um die Automatisierung zu erreichen: die Erweiterung der Standard-Patch-Clamp-Ausrüstung, um die automatische Steuerung des Patching-Prozesses und die Gestaltung neuer Geräte und Techniken von Grund auf zu ermöglichen. Die frühere Strategie ist an vorhandene Hardware anpassbar und kann in einer Vielzahl von Patch-Clamp-Anwendungen verwendet werden, einschließlich in vivo Blind Patch Clamp 3 , 4 , 5 , in vitro Patch Clamp von akuten Hirnschnitten, organotypischen Slice Kulturen und kultivierten dissoziierten Neuronen 6 . Es ermöglicht die Abfrage von komplexen lokalen Schaltungen durch die Verwendung mehrerer Mikromanipulatoren gleichzeitig 7 . Die Planar-Patch-Methode ist ein Beispiel für die neue Entwicklungsstrategie, die gleichzeitig den Hochdurchsatz erreichen kannAtch Klemme von Zellen in Suspension für Drogen-Screening-Zwecke 8 . Allerdings ist das Planar-Patch-Verfahren nicht für alle Zelltypen, insbesondere für Neuronen mit langen Prozessen oder intakten Schaltungen, die umfangreiche Verbindungen enthalten, anwendbar. Dies beschränkt seine Anwendung auf die Abbildung der komplizierten Schaltungen des Nervensystems, was ein wichtiger Vorteil der traditionellen Patch-Clamp-Technologie ist. Wir haben ein System entwickelt, das den manuellen Patch-Clamp-Prozess in vitro automatisiert, indem er Standard-Patch-Clamp-Hardware erweitert. Unser System, Autopatcher IG, bietet automatische Pipettenkalibrierung, Fluoreszenzzelle Zielidentifikation, automatische Steuerung der Pipettenbewegung, automatisches Ganzzellpatching und Datenlogging. Das System kann automatisch mehrere Bilder von Gehirnscheiben in verschiedenen Tiefen erwerben; Analysiere sie mit Computer Vision; Und extrahieren Informationen, einschließlich der Koordinaten von fluoreszenzmarkierten Zellen. Diese Information kann dann seinVerwendet, um zu zielen und automatisch patch Zellen von Interesse. Die Software ist in Python geschrieben - eine freie, Open-Source-Programmiersprache - mit mehreren Open-Source-Bibliotheken. Dies sorgt für die Zugänglichkeit für andere Forscher und verbessert die Reproduzierbarkeit und Strenge der elektrophysiologischen Experimente. Das System ist modular aufgebaut, so dass zusätzliche Hardware problemlos mit dem hier dargestellten System verbunden werden kann.

<table width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">CCD Camera</td>
			<td style="width:115px;">QImaging</td>
			<td style="width:147px;">Rolera Bolt</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="width:231px;height:101px;">Electrophysiology rig</td>
			<td style="width:115px;">Scientifica</td>
			<td style="width:147px;">SliceScope Pro 2000</td>
			<td style="width:256px;">Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is &#8220;Linlab2&#8221;.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Amplifier</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:147px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:256px;">computer-controlled microelectrode amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Digitizer</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:147px;">Axon Digidata 1550</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="width:231px;height:55px;">LED light source</td>
			<td style="width:115px;">Cool LED</td>
			<td style="width:147px;">pE-100</td>
			<td style="width:256px;">488nm wavelength</td>
		</tr>
		<tr height="98">
			<td height="98" style="width:231px;height:98px;">Data acquisition board</td>
			<td style="width:115px;">Measurement Computing</td>
			<td style="width:147px;">USB1208-FS</td>
			<td style="width:256px;">Secondary DAQ. 
			See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">Solenoid valves</td>
			<td style="width:115px;">The Lee Co.</td>
			<td style="width:147px;">LHDA0531115H</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Air pump</td>
			<td style="width:115px;">Virtual industry</td>
			<td style="width:147px;">VMP1625MX-12-90-CH</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Air pressure sensor</td>
			<td style="width:115px;">Freescale semiconductor</td>
			<td style="width:147px;">MPXV7025G</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Slice hold-down</td>
			<td style="width:115px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:147px;">64-1415 (SHD-40/2)</td>
			<td style="width:256px;">Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Python</td>
			<td style="width:115px;">Anaconda</td>
			<td style="width:147px;">version 2.7 (32-bit for windows)</td>
			<td style="width:256px;">https://www.continuum.io/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:231px;height:20px;">Screw Terminals</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:115px;height:41px;">Sparkfun</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:147px;height:41px;">PRT - 08084</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:256px;height:41px;">Screw Terminals 3.5mm Pitch (2-Pin)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">(2-Pin)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">N-Channel MOSFET 60V 30A</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM - 10213</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="75">
			<td height="75" style="width:231px;height:75px;">DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-07937</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">LED - Basic Red 5mm</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM-09590</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">LED - Basic Green 5mm</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM-09592</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="99" style="width:231px;height:99px;">DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-12748</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="99" style="width:231px;height:99px;">Wall Adapter Power Supply - 12VDC 600mA</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">TOL-09442</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="159">
			<td height="159" style="width:231px;height:159px;">Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-11367</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="75">
			<td height="75" style="width:231px;height:75px;">Locking Male x Female X Female Stopcock</td>
			<td style="width:115px;">ARK-PLAS</td>
			<td style="width:147px;">RCX10-GP0</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="width:231px;height:77px;">Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings</td>
			<td style="width:115px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:147px;">14-171-129</td>
			<td style="width:256px;">Outer Diameter: 1/8 in. 
			Inner Diameter: 1/16 in.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">BNC male to BNC male coaxial cable</td>
			<td style="width:115px;">Belkin Components</td>
			<td style="width:147px;">F3K101-06-E</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">560 Ohm Resistor (5% tolerance)</td>
			<td style="width:115px;">Radioshack</td>
			<td style="width:147px;">2711116</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">Picospritzer</td>
			<td style="width:115px;">General Valve</td>
			<td style="width:147px;">Picospritzer II</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices

Voll-Zell-Patch-Clamp ist die Gold-Standard-Methode, um die elektrischen Eigenschaften von einzelnen Zellen zu messen. Allerdings bleibt die In-vitro- Patch-Clamp aufgrund ihrer Komplexität und ihrer hohen Abhängigkeit von Benutzerbetrieb und -steuerung eine anspruchsvolle und leistungsstarke Technik. Dieses Manuskript zeigt ein bildgeführtes automatisches Patch-Clamp-System für in-vitro- Ganzzell-Patch-Clamp-Experimente in akuten Hirnschnitten. Unser System implementiert einen computervisionsbasierten Algorithmus, um fluoreszenzmarkierte Zellen zu detektieren und sie zum vollautomatischen Patching mit einem Mikromanipulator und einer internen Pipettendruckkontrolle zu zielen. Der gesamte Prozess ist hoch automatisiert, mit minimalen Anforderungen für menschliches Eingreifen. Echtzeit-experimentelle Informationen, einschließlich elektrischer Widerstand und interner Pipettendruck, werden elektronisch für die zukünftige Analyse und für die Optimierung auf verschiedene Zelltypen dokumentiert. Obwohl unser System im Kontext der akuten brai beschrieben wirdN Slice-Aufnahmen kann es auch auf die automatisierte bildgeführte Patch-Clamp von dissoziierten Neuronen, organotypischen Slice-Kulturen und anderen nicht-neuronalen Zelltypen angewendet werden.

<html> Unser System wurde auf seine Fähigkeit getestet, Zellen in akuten Hirnschnitten, Maus induzierten Pluripotenten Stammzellen (iPSCs) differenziert in Neuronen, und HEK 293 Zellen künstlich ausdrücken Kanäle von Interesse. Abbildung 3 zeigt ein Experiment mit Thy1-ChR2-YFP-transgenen Mäusen (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J), die auf fluoreszenzmarkierte Schicht-5-Pyramiden-Neuronen im visuellen Kortex zielen. Die Zielzelle war eine der automatisch identifizierten grün fluoreszenz-positiven Zellen ( Abbildung 3b ). Fig. 3a ist das Differential Interference Contrast (DIC) -Bild des gepatchten Neurons. Die Ganzzellkonfiguration wurde durch das automatische Patching-Protokoll in den Schritten 2.5 - 2.6 erreicht und wurde durch stufenstrominduzierungsinduzierte Aktionspotentiale validiert ( Abbildung 3c ) 1 &quot;&gt; Um die zusätzliche&quot; Command Sequence &quot;-Funktion zu demonstrieren, haben wir 500 mM KCl für 200 ms an drei Stellen auf einer Hirnscheibe geliefert, während wir eine Zelle patchten ( Abbildung 4 ). Zuerst haben wir 3 Standorte auf der Gehirnscheibe ausgewählt: eine enge Die Koordinaten wurden in die &quot;Command Sequence&quot; GUI unter &quot;Unit1&quot; geladen, was der Manipulator war, dass die KCl- Es wurden die Befehle in die linke Spalte gesetzt, um ein + 5-V-TTL-Signal für 500 ms zu senden, gefolgt von 0 V für 10 s ( Abbildung 4a ) von Port A-Kanal 0 auf der sekundären DAQ-Platine, Die mit dem Digitizer &quot;start trigger&quot; -Eingang verbunden war, Abbildung 4c zeigt, dass die gepatchte Zelle ein regelmäßiges Spiking-Neuron war. Die Drogenanwendungspipette (Einheit 1) durchquerte die drei ausgewählten Orte aUtomatisch ( Abbildung 4b ), und wir haben 10 s für jede Anwendung unter Spannungsklemme aufgezeichnet ( Abbildung 4d ). Die Farbe der Spuren in Fig. 4d entspricht der Randfarbe in Fig. 4b . Als KCl an der Zelle paffte, wurde ein großer nach innen gerichteter Strom beobachtet, der langsam abnahm, als KCl diffundierte. Roter Fluoreszenzfarbstoff wurde der KCl-Lösung zugesetzt, um die räumliche Verteilung der Arzneimittelabgabe anzuzeigen, und wurde unter Verwendung von kombinierter DIC und epifluoreszierender Bildgebung abgebildet. Dieses Experiment verdeutlichte die Leichtigkeit und Flexibilität unseres Systems, um Manipulator / Mikroskop-Bewegung und externe Hardware durch TTL-Signale zu steuern. <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig1.jpg" /> Abbildung 1. Druckregelgerät. A: Leiterplatte (Leiterplatte) zum Anschluss der Ventile, DruckSensor und Luftpumpe. Die linke zeigt Details auf der Leiterplatte, Etikettierung von Ausgängen, die im Protokoll erwähnt werden. Das Recht zeigt die Verbindung zwischen der Platine und der Luftpumpe, dem USB-Port und dem Schlauch. B: Schaltplan für die Leiterplatte. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56010/56010fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig2.jpg" /> Abbildung 2. Autopatcher-GUI. Die im Protokoll erwähnten Tasten sind in roten Quadraten dargestellt und nummeriert. 1: Kalibrierung starten, 2: Kalibrierung speichern, 3: Kalibrierung laden, 4: Sekundäre Kalibrierung, 5: Erkennung der Zelle, 6: Patch-Steuerung, 7: Gehen Sie zu (Zielzellenkoordinate) und 8: Patch. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56010/56010fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen</a>. <img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ein Beispiel für die gepatchte ChR2-YFP-positive Zelle. A: 40fache Vergrößerung unter DIC-Optik. B: Epifluoreszenzbild der gleichen Zelle im Panel A (LED-Beleuchtung bei 488 nm). C: Strom-Clamp-Aufnahmen aus der gepatchten Zelle während einer Reihe von hyperpolarisierenden und depolarisierenden Stufenstrom-Injektionen. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56010/56010fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig4.jpg" /> Abbildung 4. Durchführung eines automatisierten Drug Delivery Experiments. A: Ausgewählte Orte, die in die GUI &quot;Command Sequence&quot; geladen wurden. Die linke Spalte zeigtDie Liste der Koordinaten und die rechte Spalte zeigt die Liste der Befehle in Form von TTL-Signalen für jeden Standort an. B: Screenshots während des Medikamentenanwendungsexperiments entsprechend den drei ausgewählten Orten. Einheit 1 war die KCl-haltige Pipette und Einheit 2 war die Patchpipette. KCl-Lösung wurde zum Zwecke der Visualisierung mit rotem Fluoreszenzfarbstoff gemischt. Bilder wurden durch Kombination von DIC und Fluoreszenzbildgebung erhalten. C: Schrittstrom-Injektionen, die ein regelmäßiges Spiking-Neuron zeigen. D: Spannungsklemmenaufzeichnungsspuren aus der lokalen Applikation von 500 mM KCl-Lösung an drei Standorten. Die rote Spur mit nach innen gerichtetem Strom wurde aus dem Versuch aufgezeichnet, als die KCl-Anwendung nahe der gepatchten Zelle war. Der rote Pfeil zeigt den Zeitpunkt der KCl-Anwendung an. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56010/56010fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1"Fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot; fo: keep-with-next.within-page = &quot;immer&quot;&gt; <tbody><tr><td> Steckdose auf der Leiterplatte </td><td> Portname auf dem DAQ-Board </td><td> Port # auf DAQ-Board </td><td> Anmerkung </td></tr><tr><td> DOUT V1 </td><td> Port A Kanal 1 </td><td> 22 </td><td> Steuerventil 1 </td></tr><tr><td> DOUT V2 </td><td> Port A Kanal 2 </td><td> 23 </td><td> Steuerventil 2 </td></tr><tr><td> DOUT P </td><td> Port A Kanal 3 </td><td> 24 </td><td> Luftpumpe einstellen </td></tr><tr><td> GR </td><td> Boden </td><td> 29 </td><td> Boden </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Leiterplatte (Leiterplatte) zur sekundären Datenerfassung (DAQ) -Konfiguration. Verwenden Sie diese Tabelle, um PCB-Ausgänge (erste Spalte von links) mit Ports auf der DAQ-Platine zu verbinden (zweite Spalte von links). Der Portname und die Nummer des sekundären DAQ beziehen sich auf den Single-Ended-Modus. <img alt="Tabelle 2" src="/files/ftp_upload/56010/56010table2.jpg" /> Tabelle 2. Schlauchverbindungen vom Druckregelgerät zum Pipettenhalter (n). Für jede Verbindung verbinden Sie die entsprechenden Ports, die mit einem grauen Kasten markiert sind, mit weichen Schläuchen (siehe Tabelle der Materialien ).

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Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Dieses Protokoll beschreibt die Durchführung von automatischen bildgeführten Patch-Clamp-Experimenten mit einem System, das kürzlich für Standard- In-vitro- Elektrophysiologie-Geräte entwickelt wurde.

Anwendung von automatisierten Bild-geführten Patch-Clamp für die Studie von Neuronen in Gehirn-Scheiben

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

application-automated-image-guided-patch-clamp-for-study-neurons

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K Aufrufe.  Purdue University.  Dieses Protokoll beschreibt die Durchführung von automatischen bildgeführten Patch-Clamp-Experimenten mit einem System, das kürzlich für Standard- In-vitro- Elektrophysiologie-Geräte entwickelt wurde. 

Serie: Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

Die Züchtung und Elektrophysiologie von Zellen auf NRCC Patch-Clamp-Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Forschung

Neurowissenschaften

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-Clamp Kapazitätsmessungen und Ca 2 + Imaging bei Single Nervenendigungen in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent neuropsychiatric disorder that stems from the biophysical and cellular actions of nicotine on nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) throughout the central nervous system. Understanding the various nAChR subtypes that exist in brain areas relevant to nicotine addiction is a major priority.
Experiments that employ electrophysiology techniques such as whole-cell patch clamp or two-electrode voltage clamp recordings are useful for pharmacological characterization of nAChRs of interest. Cells expressing nAChRs, such as mammalian tissue culture cells or Xenopus laevis oocytes, are physically isolated and are therefore easily studied using the tools of modern pharmacology. Much progress has been made using these techniques, particularly when the target receptor was already known and ectopic expression was easily achieved. Often, however, it is necessary to study nAChRs in their native environment: in neurons within brain slices acutely harvested from laboratory mice or rats. For example, mice expressing "hypersensitive" nAChR subunits such as &alpha;4 L9&prime;A mice 1 and &alpha;6 L9&prime;S mice 2, allow for unambiguous identification of neurons based on their functional expression of a specific nAChR subunit. Although whole-cell patch clamp recordings from neurons in brain slices is routinely done by the skilled electrophysiologist, it is challenging to locally apply drugs such as acetylcholine or nicotine to the recorded cell within a brain slice. Dilution of drugs into the superfusate (bath application) is not rapidly reversible, and U-tube systems are not easily adapted to work with brain slices.
In this paper, we describe a method for rapidly applying nAChR-activating drugs to neurons recorded in adult mouse brain slices. Standard whole-cell recordings are made from neurons in slices, and a second micropipette filled with a drug of interest is maneuvered into position near the recorded cell. An injection of pressurized air or inert nitrogen into the drug-filled pipette causes a small amount of drug solution to be ejected from the pipette onto the recorded cell. Using this method, nAChR-mediated currents are able to be resolved with millisecond accuracy. Drug application times can easily be varied, and the drug-filled pipette can be retracted and replaced with a new pipette, allowing for concentration-response curves to be created for a single neuron. Although described in the context of nAChR neurobiology, this technique should be useful for studying many types of ligand-gated ion channels or receptors in neurons from brain slices.

In this paper, we describe a useful method to study ligand-gated ion channel function in neurons of acutely isolated brain slices. This method involves the use of a drug-filled micropipette for local application of drugs to neurons recorded using standard patch clamp techniques.

Lokale Anwendung von Medikamenten zur nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor-Funktion in Maus Hirnschnitten Studie

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolation von sensorischen Neuronen von<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Für Patch-Clamp-Recordings von Glutamaterge Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

Eine EDV-gestützte Multi-Elektroden-Patch-Clamp-System

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subzellulärer Patch-Clamp-Aufnahmen aus der somatodendritische Domain nigraler Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug application during electrophysiological recording is the puff technique, which can be used to study the effect of pharmacological reagents on neuronal activities in brain slices. The greatest advantage of puff application is that the drug concentration around the recording site increases rapidly, thus preventing desensitization of membrane receptors. Successful use of puff application involves careful attention to the following elements: the concentration of the drug, the parameters of the puff micropipette, the distance between the tip of a puff micropipette and the neuron recorded, and the duration and pressure driving the puff (pounds per square inch, psi). This article describes a step-by-step procedure for recording whole-cell currents induced by puffing gamma-aminobutyric acid (GABA) onto a neuron of a prefrontal cortical slice. Notably, the same procedure can be applied with minor modifications to other brain areas such as the hippocampus and the striatum, and to different preparations, such as cell cultures.

We describe the puff technique, by which pharmacological reagents can be administered during whole-cell patch-clamp recording, and highlight various aspects of the features that are crucial for its success.