המחברים מודים ד"ר ג'ים בורסי, אלן Levey, היחידה לנוירולוגיה של אמורי, על הערות מועילות והצעות. עבודה זו מומן בחלקו על ידי האצת שותפות רפואה המענק (U01AG046161-02), אמורי האלצהיימר של מרכז המחקר של המחלה (P50AG025688) ואת הלאומי להזדקנות הענק (R01AG053960-01) ל- N.T.S. מחקר זה גם נתמך בחלקה על ידי הגרעין Neuropathology של המענק אמורי Neuroscience NINDS הליבה מתקנים, P30NS055077.

אתיקה במשפט: לכל רקמות מוח, התקבלו האלצהיימר אמורי &#39; s מחלות מחקר במרכז (ADRC) המוח הבנק. רקמות לאחר המוות נרכשו תחת פרוטוקולים לוח סקירה מוסדיים (IRB) תקין.
 1. המגון ו Fractionation <ol><li>רקמות הבחירה הערה: קפוא רקמות לאחר המוות החזיתית מ בקרה בריאים (Ctl), באופן פתולוגי מקרים מאושרים של המודעה נבחרו מתוך אמורי ADRC המוח הבנק (n = 2). הערכה neuropathological פוסט-מורטם של הפצה פלאק עמילואיד בוצעה על פי האיחוד להקים רישום עבור אלצהיימר &#39; s המחלה למחצה כמותיים ניקוד קריטריונים 24, למרות סבך neurofibrillary פתולוגיה הוערך לפי מערכת הזמני braak. 16 <ol><li>קבל קפוא רקמת המוח לאחר המוות מ בקרה בריאים (Ctl), באופן פתולוגי לספירה מקרים מאומתים. ניצול מיכלים של קרח יבש, מלקחיים, סכין גילוח, בלו ~ 250 מ"ג חלקים של החומר האפור של כל דגימה רקמה על הפנויה tared שוקל סירות, לטפל כדי למנוע את הרקמה מפשיר. להקליט את המשקל של כל פיסת להיות הומוגני.</li>
		<li>בלו ~ 250 מ"ג של החומר האפור באמצעות מלקחיים, גילוח על-ידי בדיקה חזותית כדי לאתר את הממשק בין החומר האפור החיצוני לבין חומר לבן פנימי. להימנע חומר לבן וחשוב יותר, כל כלי דם גדולים או אזורים מדם, קרומי המוח או מאטר מעידה. לשמור את הרקמה קפוא במהלך תהליך חיתוך על ידי עובדים במהירות והצבת לעתים קרובות הסירה במשקל עם רקמת המוח לתוך מיכלים פוליסטירן עם קרח יבש</li>
		<li>רושמות את משקל מדויק של החומר האפור טוחנות מ כל חתיכה קפוא באמצעות איזון האנליטי. חישוב הנפח של מאגר מלח נמוכה (LS) (ראה טבלה 1) לצורך המגון דאונס (5 מ ל/g או 20% w/v).</li>
		<li>10 להכין מאגר מ ל LS עם 1 x מעכב פרוטאז, פוספטאז קוקטייל ולא צונן על קרח</li>
		<li>להסיר רקמות שנשקל והסירה במשקל קרח יבש והן הקוביות לחתיכות מ מ 2 x 2 בערך כמו זה מפשירה. העברת צינור מהמגן 2 מ"ל דאונס טרום מקורר על קרח</li>
		<li>הוסף 5 מ ל/g (20% w/v) מאגר מלח נמוכה כקרח (LS) עם 1 X מעכב פרוטאז, פוספטאז קוקטייל.</li>
		<li>Homogenize רקמת המוח על קרח באמצעות כ 10 קווים של סיווג גבוהות שהעקב A ו- 15 משיכות של סיווג נמוך שהעקב B.</li>
		<li>העברת homogenate כל צינור פוליפרופילן 2 mL באמצעות כוס פסטר פיפטה. תווית ברכבת התחתית עם &#8220; תאנון &#8221; (כולל Homogenate), הרקמה קייס המספר, homogenate נפח. Aliquot 0.8 מ לתוך צינור שכותרתו mL 1.5. כל homogenate עודף יכול להיות דומה aliquoted ומאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס</li>
		<li>כל 0.8 מ ל aliquot, להוסיף 100 µL כל של 5 M NaCl ו- 10% (w/v) sarkosyl ריכוזים של 0.5 M ו- 1% w/v, בהתאמה. לערבב צינורות היטב על ידי היפוך, דגירה על קרח במשך 15 דקות צינורות בתווית עם &#34; ה-S &#34; (סה כ Homogenate-Sarkosyl) כדי לציין homogenates פועלות sarkosyl-מאגר (טבלה 1).</li>
		<li>Sonicate כל שפופרת עבור s 5 3 פולסים במהירות של 30% משרעת על קרח (העוצמה המקסימלית = 40%) באמצעות בדיקה microtip.</li> <li>לקבוע ריכוז חלבון homogenates באמצעות החומצה bicinchoninic (BCA) assay 25 שיטת. 
		הערה: ריכוז חלבון הממוצע של ה-S homogenates מוכן ב 5 מ ל LS לגרם של רקמות היא 15-20 מ"ג/מ"ל. Homogenates ניתן fractionated מיד או המאוחסנים ב- 80 ° C עד השימוש.</li>
		<li>Homogenates ה-S לדלל כדי 10 מ"ג/מ"ל באמצעות מאגר סארק כקרח (טבלה 1) עם 1 x מעכבי פרוטאז, פוספטאז.</li>
		<li>להעביר 5 מ ג חלבון (0.5 מ ל) של כל אחד homogenate ה-S לתוך 500 µL פוליקרבונט ultracentrifuge צינורות, זוג-איזון עם סארק-buffer. לטעון צינורות לתוך טרום מקורר רוטור ultracentrifuge ב 180,000 x g למשך 30 דקות ב- 4 supernatants העברה sarkosyl מסיסים מעלות צלזיוס (S1) כדי 1.5 mL צינורות ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס 
		הערה: (שטיפת אופציונלי) µL להוסיף 200 סארק-המאגר כדי ultracentrifuge צינורות המכילים שברים דטרגנט-לא מסיס (P1) ועוקרות כדורי (P1) מהחלק התחתון של הצינורות ultracentrifuge באמצעות טיפ פיפטה 200 µL.</li>
		<li>בקצרה את הדופק-ספין הפוך צינורות עבור s 2-3 (&#8804; 2,500 x g) ב- microcentrifuge כדי להעביר את החבילות (P1) ואת מאגר הצינורות 1.5 mL להלן. Resuspend כדורי לא מסיסים (P1) במאגר-סרק על ידי pipetting למעלה ולמטה כדי להבטיח בגדר מופרת.</li>
		<li>זוג-איזון, צנטריפוגה ב 180,000 x g למשך 30 דקות נוספות ב-4 מעלות צלזיוס</li>
		<li>למחוק את תגובת שיקוע שטיפת אופציונלי (S2), דגירה כדורי sarkosyl-לא מסיס (P2) ב- 50-75 µL מאגר אוריאה (טבלה 1) עם 1 x תמונה (פרוטאז, פוספטאז מעכב קוקטייל) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי solubilize צניפה- 
		הערה: מאגר אוריאה חמים לטמפרטורת החדר לפני השימוש כדי למנוע מרחביות משקעים. ליישומים הרגישים דטרגנט, להשמיט זמנים תוססים מהמאגר אוריאה ולשקול שטיפה בגדר לא מסיסים (P2) במאגר מלח נמוכה לפני resuspending במאגר שתנן.</li>
		<li>להעביר את כדורי resuspended (P2) צינורות 0.5 mL ולהשתמש קצר (1 s) microtip sonication-משרעת 20% (העוצמה המקסימלית = 40%) כדי באופן מלא solubilize כדורי.</li>
		<li>לקבוע את ריכוזי חלבונים מסיסים sarkosyl (S1) ו- assay לא מסיסים שברים (P2) באמצעות BCA את השיטה. להשתמש שברים אלה באופן מיידי או לאחסן ב- 80 ° C עד שימוש.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunoblotting <ol><li>המערבי סופג הערה: סופג המערבית בוצעה על פי הנהלים שדווחה בעבר עם שינויים קלים. 5 , 10 <ol><li>40 להכין דגימות µg סה כ homogenates (ה-S), סארק מסיסים (S1), סארק-לא מסיס שברים (P2) במאגר מדגם X Laemmli מרחביות-דף 1 עם 5 מ מ TCEP pH 7. דגירה בדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דק</li>
		דוגמאות <li>טען ב- Bis-טריס precast 10-ובכן 4-12% מרחביות-דף ג'ל. Electrophorese-80 V על הסנטימטר הראשונה (10 דקות) ו 120 V עד לתום (60 דקות) או עד לצבוע מעקב מגיע לתחתית של הג'ל.</li>
		<li>להשתמש טריים גילוח וסכין ג'ל על פיצול-פתיחה בקלטת ג'ל טרומי. בעדינות לחתוך משם את קומבס ואת התחתון של הג'ל עם סכין גילוח טריים.</li>
		<li>Resuspend כדורי לא מסיסים (P1) 200 µl סארק-מאגר עם x 1 PIC על-ידי pipetting למעלה ולמטה.</li>
		<li>העברת קרום ניטרוצלולוזה 0.2 µm באמצעות שיטת העברה יבש על מכונת blotting (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>לחסום את הקרום במאגר חסימה (BB) ללא Tween 20 למשך 30 דקות, ואחריו עם BB עם 0.05% 20 Tween (BB/T) למשך 30 דקות. לאחר חסימת, לשטוף את הקרום ב- TBS/T (0.1% Tween 20) עבור 5 דקות כדי להסיר עודפי מאגר חסימה.</li>
		<li>הכן דילולים 1:1,000 של נוגדנים ראשי pT231, טאו-2 (פאן טאו), AT8 ו EEA1 ב BB/T (0.05% Tween 20).</li>
		<li>תדגור על הממברנות בפתרון נוגדן ראשוני בין לילה ב 4 ° C עם עצבנות מעגלית לשטוף את הקרום ב- TBS/T עבור 3 x 15 דק</li>
		<li>בדיקה הקרום לדילול 1:20,000 שכותרתו fluorescently ליד-IR משני הנוגדן ב- BB/T עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר בחושך בשייקר. לשטוף את הקרום 3 x 10 דקות ב- TBS/T ו- 2 x 5 min ב- TBS.</li>
		<li>לסרוק את הקרום באמצעות אינפרא מערכת-הגל המתאימים עירור (לדוגמא 700 nm (ערוץ אדום) עבור צבע אינפרא-אדום 680 עז העכבר אנטי איג (H + L) המשנית, 800 nm (ערוץ ירוק) עבור צבע אינפרא-אדום 790 החמור נגד אינץ ארנב IgG (H + L הדמיה ) משני).</li>
		<li>משתמש בתוכנת הדמיה לכמת עוצמות האות ולבצע מדידות densitometry לפי היצרן &#39; s הוראות, הבטחת אוטומטי-רקע הגדרת מוגדר ממוצע את הרקע כולו.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+Proteins+in+Neurodegenerative+Disease.">Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease.</a> Science. 296 (5575), 1991 (1991).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).</li><li>Ram&#237;rez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+exploration+of+the+influence+of+the+protein+stability+on+amyloid+fibril+formation+in+vitro.">A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).</li><li>Hamley, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyloid+Beta+Peptide:+A+Chemist's+Perspective.+Role+in+Alzheimer's+and+Fibrillization.">The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization.</a> Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).</li><li>Diner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+Properties+of+the+Small+Nuclear+Ribonucleoprotein+U1-70K+in+Alzheimer+Disease.">Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease.</a> J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).</li><li>Gozal, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+Analysis+Reveals+Novel+Components+in+the+Detergent-Insoluble+Subproteome+in+Alzheimer's+Disease.">Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease.</a> J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).</li><li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+detergent-insoluble+brain+proteome+linked+to+amyloid+and+tau+in+Alzheimer's+Disease+progression.">Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression.</a> PROTEOMICS. , (2016).</li><li>Julien, C., Bretteville, A., Planel, E., Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Amyloid Proteins: Methods and Protocols. , 473-491 (2012).</li><li>Nizhnikov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Screening+for+Amyloid+Proteins.">Proteomic Screening for Amyloid Proteins.</a> PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).</li><li>Seyfried, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+detergent-insoluble+brain+proteome+in+frontotemporal+lobar+degeneration+using+SILAC+internal+standards.">Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards.</a> J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).</li><li>Woltjer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+determination+of+widespread+detergent+insolubility,+including+A&#946;+but+not+tau,+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including A&#946; but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> FASEB J. , (2005).</li><li>Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+Characterization+of+the+Core+Structure+of+&#945;-Synuclein+Filaments.">Biochemical Characterization of the Core Structure of &#945;-Synuclein Filaments.</a> J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).</li><li>Hasegawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+&#945;-Synuclein+Is+Ubiquitinated+in+&#945;-Synucleinopathy+Lesions.">Phosphorylated &#945;-Synuclein Is Ubiquitinated in &#945;-Synucleinopathy Lesions.</a> J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitinated+TDP-43+in+Frontotemporal+Lobar+Degeneration+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130 (2006).</li><li>Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Intrinsically+Disordered+Low+Complexity+Domain+is+Required+for+U1-70K+Self-association.">An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association.</a> FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).</li><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes.">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).</li><li>Noguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Patient-derived,+Toxic,+High+Mass+Amyloid+&#946;-Protein+(A&#946;)+Assembly+from+Alzheimer+Disease+Brains.">Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid &#946;-Protein (A&#946;) Assembly from Alzheimer Disease Brains.</a> J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).</li><li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer's+disease.">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li><li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+&#946;-Amyloid+Protein+Is+Covalently+Modified+when+Dissolved+in+Formic+Acid.">Alzheimer's &#946;-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid.</a> J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).</li><li>Yang, L. -. S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+Released+from+Paired+Helical+Filaments+with+Formic+Acid+or+Guanidine+Is+Susceptible+to+Calpain-Mediated+Proteolysis.">Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis.</a> J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).</li><li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer's+disease.">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li><li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+small+nuclear+ribonucleoproteins+(snRNPs)+aggregate+in+Alzheimer's+disease+due+to+autosomal+dominant+genetic+mutations+and+trisomy+21.">U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21.</a> Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).</li><li>Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+change,+aggregation+and+fibril+formation+induced+by+detergent+treatments+of+cellular+prion+protein.">Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein.</a> J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).</li><li>Mirra, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Consortium+to+Establish+a+Registry+for+Alzheimer's+Disease+(CERAD).+Part+II.+Standardization+of+the+neuropathologic+assessment+of+Alzheimer's+disease.">The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease.</a> Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Guo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+pathological+tau+conformers+from+Alzheimer's+brains+transmit+tau+pathology+in+nontransgenic+mice.">Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice.</a> J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).</li><li>Matveev, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+subfraction+of+A&#946;+is+responsible+for+the+high-affinity+Pittsburgh+compound+B-binding+site+in+Alzheimer's+disease+brain.">A distinct subfraction of A&#946; is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain.</a> J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בזאת אנו להציג ולדון פרוטוקול דטרגנט-fractionation צעד אחר צעד מקוצר הרלוונטיים למגוון רחב של יישומים ניסיוני ועד ניתוח פרוטאומיקס מסה ספקטרומטר מבוססי חלבונים פונקציונליים misfolding מבחני אפילו השחרת המערבי. 5 , 6 , 7 , 10 מתודולוגיה זו היא אולי הכי יעיל כאשר נעשה שימוש כדי ללמוד proteinopathies ניווניות כגון אלצהיימר, ALS, מחלת הנטינגטון, פריון ומחלות של tauopathies שונים. בהשוואה לפרוטוקול fractionation רציפים חמשת השלבים המקוריים, הליך זה צעד בודד ניתן להשלים ביום אחד, ונותנת לו תוצאות דומות מאוד. 5 , 6 , 7 , 9 , 14 , 22
היבט חשוב של פרוטוקול זה הוא השימוש של sarkosyl הנוזל fractionation. לעומת אחרים חומרי ניקוי כמו טריטון X-100 או נתרן dodecyl סולפט (מרחביות) sarkosyl שנראה מתאימה לפעילות זו; לכתחילה, solubilizing הכוח, הוא מספיק חזק כדי solubilize הרוב המכריע של חלבונים מקופלים מקורי תוך שמירה על חומר ניקוי-insolubility, המבנה והתפקוד של אגרגטים חלבון מחלות רלוונטיות כי הם מטבעם רגיש מרחביות. 5 , 9 . בנוסף, בניגוד מרחביות, sarkosyl נשאר מסיס בטמפרטורות נמוכות, בתנאי מלח גבוהה.
תכונת מפתח נוספת של פרוטוקול זה הוא resuspension של sarkosyl-לא מסיס הראשון (P1) כדורי בעקבות הראשון של ultracentrifugation. שלב זה שטיפת מאפשר את כדורי הראשונית (P1) ביסודיות חילוץ, שטף של כל צלב-מזהם שיורית חלבונים מסיסים או על סכום homogenate, מנקר שבריר חלבון דטרגנט-לא מסיס טהור ומוגדר היטב. ללא השלב resuspension ושטוף צניפה אופציונלי (P1), חלבונים מסיסים שיורית עלול להיות נשא-כבר נהיה השבר דטרגנט-לא מסיס, ואולי משתנה מתערב תוצאות עוקבות וניסויים (דהיינו ניתוח immunoblotting או פרוטאומיקס).
הטבע לא מסיסים וגבוה משקל מולקולרי של חלבונים misfolded פיפטות אגרגטים (קרי טאו, פוספו-טאו, זן Aβ) נוכח אתגרים ייחודיים לכיוון שלהם בידוד וניתוח באמצעות טכניקות מסורתיות הביוכימי. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 12 , 17 , 21 , 26 בניגוד חלבונים מסיסים, לא מסיס אגרגטים כגון amyloids (Aβ) ולא hyperphosphorylated טאו neurofibrillary קשרים (NFTs) ניתן בקלות מטוהרים מרקמות לאחר המוות על ידי שיטות מסורתיות כגון immunoprecipitation או מהר חלבון כרומטוגרפיה נוזלית (FPLC). 3 , 5 , 6 , 7 , 11 , 12 , 23 , 27 . וכך, לפרוטוקול sarkosyl מקוצרת-fractionation הוא אחד של טכניקות היחיד המאפשר העשרה נתיישב ובידוד של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח לאחר המוות בתוך יחסית קצר-מסגרת זמן. 5 , 6 , 8 , 13 , 15 , 17 , 21 , 27
בזמן יכול להיות מועסק צעדים נוספים כדי לבודד מדגם טהור, הומוגני של חלבון צבור, פרוטוקול fractionation sarkosyl מאפשר העשרת נתיישב של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס עם התחייבות זמן יחסית קטנה. 5 , 6 כדי לתמוך בהשערה זו, מחקרים פרוטיאומיה מבנית של פרוטאום sarkosyl-לא מסיס מאשרים כי הרוב המכריע של חלבונים צבירת נוטה פיפטות ידוע למחיצות לתוך sarkosyl-לא מסיס בשבר בשני צעד מרובת מסורתי 6 , 11 , 21 , כמו גם הגישה שלנו הרומן fractionation צעד אחר צעד. 5 , 7 , 9 , 10

מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), נוירודגנרטיביות (ALS) ומחלות של פריון הקשורים קשר הדוק הן proteinopathies מאופיין על ידי הצטברות הדרגתית של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס במוח. עם ליווי קוגניטיבית לסרב. 1 , 2 תכונה פתולוגית משותפת זו הוא חשב לשחק תפקיד מרכזי אטיולוגיה, פתופיזיולוגיה של אלה מחלות ניווניות. 2 אגרגטים אלה בדרך כלל מורכבים של סיבי עמילואיד פולימריים, אשר מורכבים של חוזרות יחידות של חלבונים misfolded מפגין צלב β-מבנה. 1 , 2 , 3 , 4 . מבחינה ביוכימית, אגרגטים עמילואיד הם עמידים מאוד בפני דנטורציה כימי או תרמי ו- solubilization,3 אשר מציג אתגרים ייחודיים על טיהור שלהם, ניתוח וללמוד באמצעות טכניקות מסורתיות הביוכימי. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 באופן לא מפתיע, השבר לא מסיס-אבקת חלבון הייתה המוקד של מחקרים רבים לתוך הפתופיזיולוגיה של מחלות ניווניות הקשורות ההצטברות של חלבונים misfolded. 6 , 12 , 13 , 14
טכניקות fractionation הביוכימי כבר נעזרו לעיתים קרובות כדי להעשיר את השבר דטרגנט-לא מסיס מן המוח לאחר המוות homogenates. 6 , 12 , 13 , 14 באחת השיטות הנפוצות ביותר כרוך החילוץ רציפים של רקמת homogenates עם מאגרי וחומרי ניקוי של הגדלת לכתחילה, ואחריו ultracentrifugation מחיצות שברים מסיסים ובחלקם לא מסיסים. נפוץ fractionation רציפים פרוטוקול6,14 מערבת את המגון דגימות רקמה קפוא במאגר מלח נמוכה ללא דטרגנט (האם), כדורי לא מסיסים תוצאות ואז מופקים באופן רציף עם מאגרי המכילה מלח גבוהה, חומרי ניקוי ללא יונית, סוכרוז גבוהה, דטרגנטים יוניים, ולבסוף chaotropes כמו שתנן. 6 , 14 חסרון ברור מהפרוטוקולים fractionation רציפים הוא זמן ניכר ומחויבות לעבודה הדרושה כדי להשלים אותם. כולל המגון ultracentrifugation, פרוטוקול טיפוסי fractionation חמישה צעדים יכולה לקחת כמה שעות או אפילו ימים כדי להשלים. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 . בנוסף, אגרגטים חלבון פיפטות רבים נותרים מסיסים בסך הכל, אבל ה19,החריפה תנאים20 רוב השברים שנוצר הם בעלי ערך מוגבל. כך, המדרגות fractionation פחות מחמירים ניצול ריכוז המלח גבוה ודטרגנטים ללא יונית הם במידה רבה מיותר.
מחקרים קודמים הראו כי הנוזל יוניים לאוריל-N-sarcosine (sarkosyl) הוא מועמד מצוין עבור פרוטוקול fractionation דטרגנט מפושטת של צעד אחר צעד. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 כמו חומר ניקוי denaturing, sarkosyl היא מחמירה מספיק כדי solubilize הרוב המכריע של חלבונים מקופלים מקורי במוח ללא solubilizing אגרגטים חלבון misfolded המורכב בטא עמילואיד (Aβ),6,11 טאו phosphorylated (pTau),6 זפת DNA מחייב חלבון 43 (TDP-43),14 אלפא-synuclein,12,13 scrapie,23 או U1 קטן הגרעין ribonucleoproteins (U1 snRNPs) כגון U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 כמו sarkosyl הוא פחות מחמירים יותר סולפט dodecyl בכל מקום anionic נתרן דטרגנט (מרחביות), שומרת על צורות oligomeric פחות חזקים של אגרגטים חלבון misfolded שלא יכול לעמוד טיפול מרחביות. 9
בעבר, תיאר לנו פרוטוקול דטרגנט-fractionation מקוצר להשיג תוצאות להשוות מתודולוגיות fractionation רציפים יותר מפרך. 5 על-ידי השמטת את השלבים fractionation מחמירים פחות, הצלחנו לפתח פרוטוקול נתיישב fractionation צעד אחר צעד העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות. 5 פרוטוקול מפורט זה המתוארים בזאת הוא גם מתאים למגוון רחב של יישומים ניסיוני החל סופג המערבי, מבחני מבוססי ספקטרומטר מסה פרוטאומיקס חלבון פונקציונלי misfolding, צבירת זריעה. 5 , 6 , 21

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>78441</td>
			<td>protease &#38; phosphatase inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB505110</td>
			<td>microtip ultrasonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimax TLX Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361545</td>
			<td>refrigerated ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA120.1 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>362224</td>
			<td>ultracentrifuge rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ul (8x34mm) polycarbonate tubes, thickwall</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343776</td>
			<td>ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X SDS sample buffer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP solution, neutral pH</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>77720</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(TBS) blocking buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>37542</td>
			<td>blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>37543</td>
			<td>blocking buffer and antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>precast SDS-PAGE gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>B0002</td>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5777-50G</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml polypropylene Pellet Pestle</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>749521-1500</td>
			<td>homogenization tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cordless motor for Pellet Pestle</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>749540-0000</td>
			<td>homogenization tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau-2 (pan tau) antibody</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB375</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5450</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MN1020</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2900</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21058</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11374</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot2 Dry Blotting System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>IB21001</td>
			<td>Gel transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>IB23002</td>
			<td>Gel transfer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול מקוצרת fractionation צעד אחר צעד העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות. ? הנוזל יוניים לאוריל-N-sarcosine (sarkosyl) solubilizes ביעילות באופן מקורי מקופל חלבונים ברקמת המוח המאפשר את העשרת של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מתוך מגוון רחב של proteinopathies ניווניות, כגון מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון, נוירודגנרטיביות ומחלות פריון. לשליטת האדם ורקמות המוח לאחר המוות לספירה היו הומוגני, sedimented על ידי ultracentrifugation בנוכחות sarkosyl להעשיר אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס כולל פיפטות phosphorylated טאו, מרכיב מרכזי neurofibrillary קשרים לספירה. סופג המערב הפגינו המסיסות דיפרנציאלית של טאו phosphorylated צבור, החלבון דטרגנט מסיסים, מוקדם 1 אנטיגן אנדוזום (EEA1) ב AD המוח ובקרה. ניתוח פרוטיאומיה מבנית גם גילה העשרה של β-עמילואיד (Aβ), טאו, snRNP70 (U1 - 70 K), ו אפוליפופרוטאין E (ספקיות) ב sarkosyl-לא מסיס שברים של המוח לספירה בהשוואה לאלו של שליטה, בקנה אחד עם אסטרטגיות fractionation רקמות הקודם . לפיכך, פרוטוקול העשרה פשוטה זה הינו אידיאלי עבור מגוון רחב של יישומים ניסיוני החל סופג המערבי חלבון פונקציונלי צבירת שיתוף מבחני פרוטאומיקס מבוססי ספקטרומטר מסה.

פרוטוקול sarkosyl צעד אחר צעד מקוצרת-fractionation שימש להעשיר אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס של שליטה והמוח לספירה לאחר המוות (איור 1). חלבונים מן ה-S, S1, S2 ו- P2 שברים שנפתרו על ידי עמודים מרחביות, קבוע למשך 15 דקות Coomassie מאגר מקבע כחול ולאחריו מכתים עדין עם מאגר מוכתמים G-250 Coomassie כחול מבריק. הצעד resuspension הוא אופציונלי, מכיוון שהיו רמות לא לגילוי של חלבון השבר S2 (ראה 1.1.14). תספיג ניתוח (איור 2 א ו- B) מדגים בבירור כי במוח לספירה, מצרפי משקל מולקולרי גבוה פיפטות phosphorylated טאו היו sarkosyl-לא מסיס, נשאר מעט מאוד pTau שברים sarkosyl מסיסים. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 22 . לעומת זאת, הרוב המכריע של pTau במוח שליטה לחלקו ל השבר sarkosyl מסיסים. 5 , 6 , 10 , לעומת זאת, EEA1 בעיקר מחיצות לתוך השבר S1 שליטה והן המוח לספירה (איור 2C). כאן, EEA1 משמש סמן כללי חלבונים טבעית ביותר, הלא-פיפטות שאינם מסיסים מטבעו sarkosyl5. ראוי לציין, יש מעט פחות סיגנל EEA1 ב השבר מסיסים (S1) לעומת השבר ה-S, המציינת כי סביר sarkosyl-לא מסיס, עדיין מתחת לגבול של זיהוי על ידי תספיג עם נוגדנים מסוימים זה מאגר קטן של EEA1. זה באותה מידה ייתכן לירידה קלה תירלולסה תשרה לש EEA1 ב השבר מסיסים (S1) נובע מחייב שאינם ספציפיים של EEA1 הצינורות ultracentrifuge יכול גם להסביר סטייה קלה התוצאות הצפויות.
כדי benchmark את היעילות של פרוטוקול מקוצרת fractionation צעד אחר צעד (איור 3 א) כנגד המתודולוגיה fractionation רציפים צעד מרובת יותר מסורתי (איור 3B), רמות היחסי של sarkosyl-לא מסיס קודמן עמילואיד חלבון (APP), טאו (MAPT), ribonucleoprotein גרעיני קטן U1 - 70K (snRNP70) ו אפוליפופרוטאין E (ספקיות) הושוו על ידי פרוטאומיקס ספקטרומטר מסה ללא תווית (MS) מבוסס על פני במאגר שליטה (Ctl), ליקוי קוגנטיבי מתון (MCI) ו- AD במקרים קודמים מחקרים7,18 (איור 3). מדידות של דטרגנט-לא מסיס APP מייצג באופן יעיל את Aβ פפטיד, כמו כל פפטידים APP באופן מלא tryptic לכמת ממופה באזור Aβ של חלבון שאריות APP7אורך מלא 695. עם שתי השיטות, רמות sarkosyl-לא מסיס כל ארבעת החלבונים פיפטות trended כלפי מעלה במקרים MCI ו- AD ביחס פקדים, בקנה אחד עם קורלציה חזקה של ירידה קוגניטיבית, נטל פתולוגי. בסך הכל, העשרה של חלבונים אלו בחלקים דטרגנט-לא מסיס (P2) היו עקביות במידה ניכרת באמצעות צעד אחר צעד18 והן fractionation צעד מרובת פרוטוקולים7.
עם זאת, ישנם הבדלים קלים בין שני למתודולוגיות שיוכיחו יתרון או ומזיקות בהתאם טיבו המדויק ואת המטרות של ניסוי בודדות. נתונים השוואתיים פרוטיאומיה מבנית מסוכמות באיור 3 יכול לעדכן את הפרוטוקול בהתאם לפרמטרים ניסיוני ויישומים. כפי שניתן לצפות, יש פשרה כללי בין מדגם העשרה וטוהר, עם פרוטוקול fractionation מפושטת מנקר יותר מועשר דגימות עם פחות אובדן חלבון מאשר שיטת רב שלבי.
לדוגמה, שליטה שברים לא מסיסים שהוכנו באמצעות פרוטוקול מפושטת (איור 3 א) להפגין מעט גבוה יותר רמות הרקע של חלבונים מחלות רלוונטיות יותר מאלה להכין אותה באמצעות הגישה רב שלבי. לעומת זאת, הטכניקה fractionation צעד בודד יכול להיות יתרון נמוך-שפע חלבונים כמו המדגם הכולל הפסדים מופחתים משמעותית. לדוגמה, העשרת היחסי של sarkosyl-לא מסיס ספקיות במקרים MCI גבוה משמעותית בחלקים לא מסיסים שהוכנו באמצעות פרוטוקול מקוצר (איור 3א).
למרות שתי הגישות הן מספקות יותר להתבונן בכל עלייה משמעותית אגרגטים חלבון misfolded מחלות רלוונטיות או פיפטות, רבים יותר fractionation נרחב והשלבים שטיפה של הגישה צעד מרובת וייתכן שיפיק את מנקה החתימה פרוטיאומיה מבנית יותר ספציפי. עם זאת, הנתונים שלנו לוודא בשיטת צעד אחר צעד fractionation בקנה אחד עם הממצאים שפורסמו כי אגרגטים פיפטות כגון קשרים neurofibrillary טאו (NFTs), שלטי Aβ scrapie prions (PrSc) הם מסיסים ב- sarkosyl, בעוד מקביליהם מקורי מקופל להישאר מסיסים. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 11 , 23 , 26
על-ידי חישוב על הסכומים היחסיים של חלבון למחיצות לתוך שברים דטרגנט-לא מסיס של שליטה (n = 3) ו- AD (n = 3) מוח (טבלה 2), רק ~ 10% מהסל חלבון הכולל הוא sarkosyl-לא מסיס. כאשר החלבון הכולל 5 מ"ג של המוח homogenate (ה-S) הוא fractionated, 10.4% ו- 11.3% פרוטאום מחיצות לתוך השבר דטרגנט-לא מסיס הבקרה ואת המקרים לספירה, בהתאמה. הסכום הכולל של sarkosyl-לא מסיס החלבון מועשר במוח לספירה אמנם גבוה מעט יותר שליטה, אין הבדלים משמעותיים נצפו על פני שתי הקבוצות (p = 0.703). אפשרות זו מציינת כי חלבון misfolding, צבירת הוא לא נפוץ במוח לספירה, אבל די מוגבל לקבוצת משנה צר וספציפי של חלבונים כגון טאו, Aβ ו- U1 snRNPs. 7 , 21 , 22

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55835/55835fig1.jpg"> 
איור 1: ערכת fractionation Sarkosyl. המוח האנושי לאחר המוות (א) א היה הומוגני במאגר מלח נמוכה, אחרי אשר sarkosyl NaCl היו הוסיף ריכוזי הסופי של 1% w/v ו- 0.5 מ', בהתאמה ואת הדגירה למשך 15 דקות על קרח. לאחר sonication, homogenates היו fractionated על ידי ultracentrifugation ב 180,000 x g למשך 30 דקות מנקר את תגובת שיקוע sarkosyl מסיסים (S1), בגדר sarkosyl-לא מסיס (P1). בגדר P1 נשטף (אופציונלי) עם סארק-buffer, re-sedimented על ידי ultracentrifugation לממן בגדר sarkosyl-לא מסיס הסופי (P2). זה שבר P2 היה solubilized במאגר אוריאה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו 3 x 5 s sonication גשש microtip נקי. חלבונים (B) (20 µg) של ה-S, S1, S2 (10 µL) ו- P2 שברים שנפתרו על ידי עמודים מרחביות, קבוע למשך 15 דקות Coomassie מאגר מקבע כחול ולאחריו מכתים עדין עם מאגר מוכתמים G-250 Coomassie מבריק כחול בטמפרטורת החדר למשך הלילה.<a href="//ecsource.jove. href=""></a href="//ecsource.jove.>המטרה com/files/ftp_upload/55835/55835fig1large.jpg"="_ blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55835/55835fig2.jpg"> 
איור 2: העשרה של phosphorylated-טאו בשבריר לא מסיסים דטרגנט המוח AD- (A ו ב) חלבון (40 μg) של הסכום הכולל (ה-S), מסיס (S1) ושברים לא מסיסים (P2) היו מחק עם נוגדן נגד טאו phosphorylated ב תראונין 231 (pT231) או AT8 (pSer202, pThr205) כדי להדגים את העשרת של מינים פיפטות פוספו-טאו שבר לא מסיסים (P2) של המוח לספירה. במוח לספירה, משקל מולקולרי גבוה המצטברים טאו באופן בלעדי מחיצות לתוך השבר (P2) אבקת-לא מסיס. (ג) EEA1 שימש סמן חלבון מסיס ושליטה העמסה יחסית עבור סך (ה-S) ו שברים מסיסים (S1) של שליטה והמוח לספירה. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55835/55835fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55835/55835fig3.jpg"> 
איור 3: ניתוח פרוטיאומיה מבנית של חלבונים לספירה פיפטות באמצעות פרוטוקול צעד יחיד או רב שלבי fractionation. רמות היחסי של החלבונים sarkosyl-לא מסיס נציג APP (Aβ), טאו, snRNP70 (U1 - 70K), ספקיות מעבר מחלות שונות בין איחדו שליטה, MCI לספירה במקרים באמצעות צעד בודד () או sarkosyl רב שלבי (B) הגישה fractionation. עבור שני datasets, רמת חלבון הוערך על ידי פפטיד ספקטרלי התאמות (PSMs) של אלה זוהו חלבונים ולאחר מנורמל להגדיר המרבי ל- 100. PSMs מן המקרים שליטה, MCI ו- AD (n = 5 כל) שימשו את ערכת הנתונים יחיד-set. עבור הגישה רב שלבי, PSMs של שתי בריכות שכפל השליטה, MCI במקרים לספירה (n = 5 כל) נותחו. קווי שגיאה מציינים את הערכים של זאת אומרת ± S.E.M. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55835/55835fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% w/v sarkosyl פתרון: 10 גרם N-לאוריל-sarcosine נתרן מלח לכל 100 מיליליטר ddH2O (stir ב RT למשך הלילה)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מאגר מלח נמוכה (LS): 50 מ מ HEPES pH 7.0, סוכרוז 250 מ מ, EDTA 1 מ מ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מאגר Sarkosyl (סארק): האם מאגר + 1% (w/v) sarkosyl + 0.5 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מאגר אוריאה (החנות ב-20 ° C): 50 מ מ טריס-HCl pH 8.5, אוריאה 8 מ', 2% מרחביות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 X מרחביות טעינת מאגר: 200 מ"מ טריס-HCl pH 6.8, גליצרול 40%, 8% נתרן dodecyl suflate (מרחביות), 0.4% bromophenol כחול (BPB) ו- 20 מ מ TCEP pH 7.0 ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מאגר מקבע Coomassie: 40% מתנול, 10% חומצה אצטית ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מאגר מוכתמים G-250 Coomassie כחול מבריק: 25% מתנול, חומצה אצטית 5%, 0.1% coomassie כחול G-250 ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie destain מאגר: 25% מתנול, חומצה אצטית 5% ב- ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X Tris buffered תמיסת מלח (TBS): 50 מ מ טריס-HCl pH 7.45, 150 מ מ NaCl ב- ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X Tris buffered תמיסת מלח עם Tween 20 (TBS/T): 50 מ מ טריס-HCl pH 7.45, 150 מ מ NaCl, 0.1% Tween ddH בתוך 202O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X חסימת מאגר (BB): 50 מ מ טריס-HCl pH 7.45, 150 מ מ NaCl, החלבונים 1% (ראה רשימה), 750 מ"מ Methylchloroisothiazolinone ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X חסימת מאגר עם 0.05% Tween 20 (BB/T): 50 מ מ טריס-HCl pH 7.45, 150 מ מ NaCl, החלבונים 1% (ראה רשימה), 0.05% Tween 20, 750 מ מ Methylchloroisothiazolinone ddH2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: רשימת מאגרים.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>מדגם</td>
			<td>נפח דגימה (µL)</td>
			<td>ריכוז (µg/µL)</td>
			<td>סה כ חלבון (µg)</td>
			<td>חלבון הכולל ממוצע (µg) ו- S.E.M.</td>
			<td>% ה-S (5 מ ג)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 רשימת אישורים אמינים</td>
			<td>70</td>
			<td>9.89</td>
			<td>692.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 רשימת אישורים אמינים</td>
			<td>70</td>
			<td>7.38</td>
			<td>516.6</td>
			<td>518.7 (±99.63)</td>
			<td>10.4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 רשימת אישורים אמינים</td>
			<td>70</td>
			<td>4.96</td>
			<td>347.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 לספירה</td>
			<td>70</td>
			<td>9.77</td>
			<td>683.9</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 לספירה</td>
			<td>70</td>
			<td>6.67</td>
			<td>466.9</td>
			<td>567.0 (±63.20)</td>
			<td>11.3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 לספירה</td>
			<td>70</td>
			<td>7.86</td>
			<td>550.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 2: כמות חלבון בחלקים sarkosyl-לא מסיס (P2). בממוצע, האחוז של חלבון זה מחיצות לתוך השבר sarkosyl-לא מסיס השליטה (n= 3) ו- AD (n= 3) המוח היה 10.4% ו- 11.3%, בהתאמה. היה הבדל משמעותי סטטיסטית של כמות חלבונים sarkosyl-לא מסיס של שליטה והמוח לספירה, כפי שמעידים על ידי הסטודנט t-מבחן (p = 0.703), שגיאת תקן של הערכים אומר (S.E.M.).

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain at JoVE.com

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

פרוטוקול fractionation מקוצר העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות מתואר.

העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

enrichment-detergent-insoluble-protein-aggregates-from-human

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.0K Views.  Emory School of Medicine. פרוטוקול fractionation מקוצר העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות מתואר.

Video: Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and RNAs, are unique to the cells from which they are derived and can be used as indicators of disease. Several common enrichment protocols, including ultracentrifugation, yield exosomes laden with soluble protein contaminants. Specifically, we have found that the most abundant proteins within blood often co-purify with exosomes and can confound downstream proteomic studies, thwarting the identification of low abundance biomarker candidates. Of additional concern is irreproducibility of exosome protein quantification due to inconsistent representation of non-exosomal protein levels. The protocol detailed here was developed to remove non-exosomal proteins that co-purify along with exosomes, adding rigor to the exosome purification process. Five methods were compared using paired blood plasma and serum from five donors. Analysis using nanoparticle tracking analysis and micro bicinchoninic acid protein assay revealed that a combined protocol utilizing ultrafiltration and size exclusion chromatography yielded the optimal vesicle enrichment and soluble protein removal. Western blotting was used to verify that the expected abundant blood proteins, including albumin and apolipoproteins, were depleted.

Here, we present a protocol to purify exosomes from both plasma and serum with reduced co-purification of non-exosomal blood proteins. The optimized protocol includes ultrafiltration, protease treatment, and size exclusion chromatography. Enhanced purification of exosomes benefits downstream analyses, including more accurate quantification of vesicles and proteomic characterization.

עיכול חלבון אולטראפילטרציה, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה כדי למטב את ניתוקה של Exosomes פלזמה דם אנושי, סרום

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be employed using a conventional confocal microscope equipped with digital detectors. A protocol for the use of the technique in vitro is shown by means of a use case where number and brightness can be seen to accurately quantify the oligomeric state of mVenus-labelled FKBP12F36V before and after the addition of the dimerizing drug AP20187. The importance of using the correct microscope acquisition parameters and the correct data preprocessing and analysis methods are discussed. In particular, the importance of the choice of photobleaching correction is stressed. This inexpensive method can be employed to study protein-protein interactions in many biological contexts.

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

This protocol describes a calibration-free approach for quantifying protein homo-oligomerization in vitro based on fluorescence fluctuation spectroscopy using commercial light scanning microscopy. The correct acquisition settings and analysis methods are shown.

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing approaches suffer from significant limitations, we have developed a new method for determining TF-DNA binding affinities with high sensitivity on a large scale. The assay relies on the established fluorescence anisotropy (FA) principle but introduces important technical improvements. First, we measure a full FA competitive titration curve in a single well by incorporating TF and a fluorescently labeled reference DNA in a porous agarose gel matrix. Unlabeled DNA oligomer is loaded on the top as a competitor and, through diffusion, forms a spatio-temporal gradient. The resulting FA gradient is then read out using a customized epifluorescence microscope setup. This improved setup greatly increases the sensitivity of FA signal detection, allowing both weak and strong binding to be reliably quantified, even for molecules of similar molecular weights. In this fashion, we can measure one titration curve per well of a multi-well plate, and through a fitting procedure, we can extract both the absolute dissociation constant (KD) and active protein concentration. By testing all single-point mutation variants of a given consensus binding sequence, we can survey the entire binding specificity landscape of a TF, typically on a single plate. The resulting position weight matrices (PWMs) outperform those derived from other methods in predicting in vivo TF occupancy. Here, we present a detailed guide for implementing HiP-FA on a conventional automated fluorescent microscope and the data analysis pipeline.

Here we present a novel method for determining binding affinities at equilibrium and in solution with high sensitivity on a large scale. This improves the quantitative analysis of transcription factor-DNA binding. The method is based on automated fluorescence anisotropy measurements in a controlled delivery system.

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances in both basic and clinical research. However, as with many similar experimental techniques, the outcome of Western blot analyses is easily influenced by choices made in the design and execution of the experiment. Specific housekeeping proteins have traditionally been used to normalize protein levels for quantification, however, these have a number of limitations and have therefore been increasingly criticized over the past few years. Here, we describe a detailed protocol that we have developed to allow us to undertake complex comparisons of protein expression variation across different tissues, mouse models (including disease models), and developmental timepoints. By using a fluorescent total protein stain and introducing the use of an internal loading standard, it is possible to overcome existing limitations in the number of samples that can be compared within experiments and systematically compare protein levels across a range of experimental conditions. This approach expands the use of traditional western blot techniques, thereby allowing researchers to better explore protein expression across different tissues and samples.

This method describes a robust and reproducible approach for the comparison of protein levels in different tissues and at different developmental timepoints using a standardized quantitative western blotting approach.

השוואה חזקים של רמות החלבון על פני רקמות וברחבי פיתוח באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי סופג

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of fungal secondary metabolites. Inhibitor screening, however, requires purified enzyme activities. Since class 1 deacetylases exert their function as multiprotein complexes, they are usually not active when expressed as single polypeptides in bacteria. Therefore, endogenous complexes need to be isolated, which, when conventional techniques like ion exchange and size exclusion chromatography are applied, is laborious and time consuming. Tandem affinity purification has been developed as a tool to enrich multiprotein complexes from cells and thus turned out to be ideal for the isolation of endogenous enzymes. Here we provide a detailed protocol for the single-step enrichment of active RpdA complexes via the first purification step of C-terminally TAP-tagged RpdA from Aspergillus nidulans. The purified complexes may then be used for the subsequent inhibitor screening applying a deacetylase assay. The protein enrichment together with the enzymatic activity assay can be completed within two days.

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets to treat fungal infections. Here we present a protocol for the specific enrichment of TAP-tagged RpdA combined with an HDAC activity assay that allows in vitro efficacy testing of histone deacetylase inhibitors.

צעד אחד העשרת הברז-Tagged הידסטון Deאצטקלז של פטריה Filamentous מנידוס מינידוס לפעילות אנזימטית

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

הקרנת מעכבי קינאז במיקרוערכים של חלבון אנושי מורכב בעצמו

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...