NAPPA היא פלטפורמת microarray חלבון רב עוצמה שניתן להשתמש בהם לחקר פעילות החלבון ותפקוד באופן תפוקה גבוהה משוחדת. החלבונים המוצגים על NAPPA מיוצרים במערכת ביטוי אנושית באמצעות ריבוזום ומשגיחים שמקורם בבני אדם על מנת לשפר את הסבירות לקיפול ופעילות טבעיים. השימוש במערכי NAPPA להקרנת מעכבי קינאז מספק פלטפורמה חדשה לבדיקת תרופות חדשות ומוטציות קינאז רלוונטיות קלינית.
ניתן להשתמש במיקרו-סדרים של חלבונים הנוצרים על ידי מתודולוגיית NAPPA עבור יישומים שונים רבים, כולל גילוי סמנים ביולוגיים, אינטראקציות חלבון-חלבון, זיהוי מצעים והקרנת תרופות. בצע שלבי בקרת איכות לאורך הדרך. בדוק את איכות הכנת הדנ"א שלך, את המיקרו-ריי של הדנ"א ואת המיקרו-ריי של החלבון.
אם בכל שלב האיכות לא טובה, פשוט להתחיל מחדש. הדגימה של ההליך תהיה ליסה מילר, טכנאית במעבדה שלי. כדי להכין צמיחה חיידקית בבית תפוקה גבוהה מיני הכנה, תחילה לחסן את החיידקים בצלחת auger בפורמט 96 גם, ולתת לו לגדול במשך 16 שעות.
למחרת, למלא כל באר של צלחת באר עמוקה עם 1.5 מיליליטר של מדיום מרק נהדר, בתוספת אמפיצילין נוגדנים. הנוגדן תלוי בסמן הבחירה בפלסמיד. לאחר מכן, לעקר מכשיר 96 פינים עם 80% אתנול ולהבה.
השתמש במכשיר סטרילי 96 פינים כדי לבחור מושבות מצלחת אגר דגירה לילה להיכנס לתוך בארות של צלחת באר עמוקה כדי לחסן את התרבות. מכסים את הבלוק עם חותם חדיר לגז ודגירה על שייקר במשך 22 עד 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, ו 300 עד 800 סל"ד. לאחר מכן, תרבויות גלולה ו resuspend התרבויות על פי כתב היד.
Lyse חיידקים על ידי הוספת 200 microliters של פתרון שתיים לתוך כל באר, לאטום את הצלחת עם חותם אלומיניום, ולהפוך חמש פעמים. דגירה התאים בדיוק חמש דקות. כדי לנטרל את הפתרון, להוסיף 200 microliters של פתרון שלוש, לאטום את הצלחת עם חותם אלומיניום, ולהפוך חמש פעמים.
לאחר מכן, לסובב את הצלחת ב 3800 G, ארבע מעלות צלזיוס, במשך 30 דקות כדי לנקות את על טבעי ליסנט. כדי להכין צלחות שרף חילופי אניון, ראשית, מערבבים את תרחיף חילופי אניון, ויוצקים את תרחיף לתוך שוקת זכוכית. מחסנית צלחות מסנן על גבי צלחת באר עמוקה לפעול ככלי איסוף פסולת.
לאחר מכן, באמצעות טיפים P1000 לוח רחב, לערבב את תרחיף, ולהעביר 450 microliters של תרחיף לתוך כל באר של לוחות המסנן. צנטריפוגה ולהשליך את הזרימה דרך. עכשיו, להעביר את על טבעי ליסאט לערימה של צלחת שף וגוש עמוק היטב.
סובבו את הלוחות המוערמים במשך חמש דקות במהירות של פי 30 עם מהירות הרמפה האיטית ביותר והשליכו את הזרימה. כדי לשטוף את העמודה, להוסיף 400 microliters של פתרון N3 לשטוף מאגר לכל באר. מעבירים את צלחת שף לסעפת ואקום כדי להסיר את מאגר לשטוף.
חזור על שלב הכביסה שלוש פעמים ולאחר מכן להסיר כל חיץ מכונת כביסה שנותר עם ספין קצר חמש דקות ב 30 פעמים G.To להניף את ה-DNA, מניחים את צלחת השדר על צלחת נקייה 800 מיקרוליטר איסוף. הוסף 300 microliters של פתרון N5 לכל באר ולתת לו לשבת בטמפרטורת החדר במשך עשר דקות. לאחר מכן, לסובב את הלוחות מוערמים במשך חמש דקות ב 20 פעמים G עם מהירות רמפה איטית עד 233 פעמים G במשך דקה אחת.
יש לאחסן צלחות ב-20 מעלות צלזיוס לפני השימוש. ראשית, מניחים את השקופיות על מתלה ומטביעים את השקופיות במאגר זכוכית המכיל את פתרון הציפוי של 2%aminosilane reagent באצטון. רוק המגלשות במשך 15 דקות.
לאחר מכן, לשטוף את המגלשות אצטון ואחריו שטיפה סופית במים. לאחר מכן, לייבש את השקופיות באמצעות אוויר לחוץ. נושבת עליהם מכל הזוויות במשך כשלוש דקות עד שכל טיפות המים הוסרו.
אחסן את המגלשות המ מצופות בטמפרטורת החדר על מתלה מתכת בתוך קופסה אטומה היטב. עכשיו, להמשיך לזרז את ה-DNA כמתואר בכתב היד. לאחר מכן, תן שימוש חוזר את גלולת הדנ"א ב-20 מיקרוליטרים של מים אולטרה-חמים ותנער ב-1,000 סל"ד למשך שעתיים.
להכנת דגימת מערך, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של תערובת הדפסה טרייה המכילה את הנוגדן, ההצלבה והפוליסין לכל דגימת דנ"א. אטם צלחות עם רדיד אלומיניום לנער בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות ב 1000 סל"ד. לאחסן את הצלחות לילה בארבע מעלות צלזיוס.
ביום ההדפסה, מערבולת קצרה ולסובב את הצלחות. מעבירים 28 מיקרוליטרים של כל דגימה לצלחת של 384 בארות. מניחים את השקופיות מצופות aminosilane ואת צלחת 384 היטב, על סיפון arrayer, ולהתחיל את תוכנית ההדפסה microarray.
לאחר שההדפסה תסיים, תייג את המיקרו-ריי. ניתן לאחסן את המיקרו-ריי במשך חודשים עד לשימוש נוסף. כדי למדוד את רמות הדנ"א, מקם את השקופיות בתיבת פיפטה וחסום אותן עם 50 מיליליטר של חיץ חסימה.
הדגירה את המגלשות על שייקר נדנדה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. לאחר מכן, להשליך את הפתרון ולהוסיף 20 מיליליטר של חיץ חסימה ו 33 microliters של צבע פלורסנט DNA intercalating. דגירה במשך 15 דקות עם תסיסה.
לאחר שהדוגירה נגמרת, שטפו במהירות את המגלשות במים טהורים במיוחד ויבשים באוויר לחוץ. המיקרו-ריי מוכנים לסריקה. כדי לבטא את microarrays, לחסום את השקופיות כפי שהוצגו בעבר ולאחר מכן לשטוף אותם עם מים טהורים במיוחד, ויבש עם אוויר דחוס מסונן.
חבר אטם איטום לכל מגלשה. הוסיפו 130 מיליליטר של תמלול ותרגום במבחנה לערבב על השקופיות, בעדינות לעסות את אטמי איטום כך תמלול במבחנה תערובת תרגום מתפשט ומכסה את כל האזור של המערך ללא בועות. החל את אטמי היציאה העגולים הקטנים על שתי היציאות.
דגירה במשך 90 דקות ב 30 מעלות צלזיוס לביטוי חלבון, ואחריו 30 דקות ב 15 מעלות צלזיוס עבור קיבוע של חלבון השאילתה. לאחר מכן, להסיר את אטם, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד 15 מיליליטר TBST עם חלב, ולחסום באותו פתרון במשך שעה אחת. לגילוי החלבונים במערך, הסר את ה- TBST עם חלב, הנח את השקופיות על צלחת רשת והחל 600 מיקרוליטרים של נוגדן ראשי, עכבר נגד דגל, מדולל 1 עד 200, ו- 1x TBST בתוספת 5%חלב.
דגירה במשך שעה בטמפרטורת החדר. לשטוף את השקופיות עם 50 מיליליטר של 1x TBST ו 5% חלב על שייקר נדנדה שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד. חזור על ההליך עבור הנוגדן המשני.
לאחר הדגירה של שעה אחת נגמר, לשטוף את השקופיות עם 1x TBST על שייקר נדנדה שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד. לאחר מכן, שטפו במהירות את המגלשות במים טהורים במיוחד, והתייבשו באמצעות אוויר לחוץ. השקופיות מוכנות לסריקה.
כדי לבצע את הטיפול phosphatase ו DNase, לשטוף ולחסום את השקופיות לידי ביטוי עם TBST בתוספת 3%BSA כמתואר בכתב היד. לאחר מכן, מניחים את השקופיות על צלחת רשת ולהחיל 200 microliters של פתרון DNase פוספטאז. מניחים פתק כיסוי microarray על גבי כדי למנוע אידוי.
דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת ו 30 דקות בתנור. לאחר מכן, לשטוף שקופיות עם 1x TBST ו 0.2 כלוריד נתרן טוחן על שייקר נדנדה שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד. כדי לבצע את הטיפול התרופתי ואת תגובת קינאז, מניחים את השקופיות על צלחת הרשת ולהחיל 200 microliters של פתרון קינאז סמים.
מניחים פתק כיסוי על גבי כדי למנוע אידוי. דגירה במשך שעה אחת ב 30 מעלות צלזיוס בתנור. המפתח לשחזור נתונים הוא זמן דגירה עקבי בין שקופיות.
זה חשוב במיוחד במהלך תגובת קינאז. יש לקחת בחשבון את הזמן הדרוש לעיבוד כל שקופית. לאחר מכן, לשטוף שקופיות עם 1x TBST ו 0.2 נתרן כלורי טוחן על שייקר נדנדה שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד.
חזור על גילוי חלבון באמצעות נוגדן נוגדן ראשוני phosphotyrosine מדולל אחד עד 100 ב TBST, בתוספת אלבומין סרום 3%bovine. השתמש 1x TBST ו 3%bovine סרום אלבומין לשטיפה לאחר הדגירה עם נוגדן ראשוני, ו TBST עבור שטיפות לאחר דגירה עם נוגדנים משניים. לשטוף ולייבש כבעבר.
לרכישת תמונה, טען את המיקרו-ריי למגזין מחזיק השקופיות. טען את המגזין לסורק המיקרו-ריי. סרוק את כל המיקרו-סדרים עם ההגדרות הממוטבות וזכור לבטל את הרווח האוטומטי בעת השוואת תמונות בין ניסויים.
העבר את התמונות לתוכנה לכימות, יישר את הרשת עם הנקודות וכמת את עוצמת האות של כל תכונה במיקרו-ריי. המשך בניתוח סטטיסטי. במחקר זה, microarray הראה את רוב כתמים המכילים DNA משלים הציג בהצלחה רמות לזיהוי של חלבון.
נת"א קינאז microarrays הראה רבייה טובה בין שקופיות, עם המתאם של רמות תצוגת החלבון בין אצוות הדפסה נפרדות גבוה מ 0.88. תוצאות מייצגות של פעילות קינאז במערכי NAPPA קינאז הראו רמות גבוהות של זרחון חלבון לאחר הביטוי. ההשוואה בין מיקרו-ריי שבהם נמדדו רמות הזרחן מיד לאחר הטיפול בפוספטאז, ולאחר 60 דקות של תגובת זרחון אוטומטי, מרמזת על נוכחות של קינאזות חלבון פעילות במערך.
על מערכי NAPPA קינאז, imatinib הראה ירידה משמעותית בפעילות ABL1 ו BCR-ABL1, בעוד kinases אחרים נשארו מושפעים בעיקר. פעילות קינאז מנורמל נגד המערך dephosphorylated ומיוצג כאחוז microarray שליטה חיובית הראה עיכוב סלקטיבי של imatinib כלפי ABL1 ו BCR-ABL1. תוצאות אופייניות שהושגו עבור ההקרנה ibrutinib הראו את פעילות קינאז של קינאז ABL1 לא רלוונטי אינו מושפע.
יעד קנוני BTK, ו ERBB4 יעד חדש פוטנציאלי, הראה פעילות מופחתת בנוכחות ibrutinib. הנתונים מראים ERBB4 יכול להיות מעוכב על ידי ibrutinib באופן ספציפי מינון. ההצלחה של הקרנות microarray חלבון תלויים מאוד באיכות של microarray עצמו.
יש להשתמש במספר תכונות בקרה חיוביות ושליליות כדי לאפשר ניתוח נתונים תקין. בדיקת NAPPA kinase היא פלטפורמת סינון, וככזה, יש לאמת את הנתונים המתקבלים בבדיקות מעקב, שעשויות לכלול בדיקות מבוא קינאז, או בדיקות מבוססות תאים. מאז הפרוטוקול שלנו מתחיל עם cDNA, כל מוטציה קינאז או וריאציה ניתן לשלב בקלות microarray ונחקר בתפוקה גבוהה.
במהלך הכנת שרף חילופי אניון תרחיף וצלחות, מומלץ להשתמש במסכות כדי למנוע שאיפה אפשרית של חלקיקי שרף.
