אנו מודים לחברי המעבדות של איבנוב ואנדרסון על הדיונים המועילים והמשוב על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות [GM111700 ו- CA168872 ל- PA, NS094918 ל- PI], המרכז הלאומי למדע בפולין [הענקת UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 ל- WS]. WS גם מכיר במשרד המדע והחינוך הגבוה בפולין (Mobility Plus Program) וועדת פולברייט הפולנית-אמריקנית על תמיכתם הכספית במחקר בארצות הברית.

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Yamasaki, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+mRNA+translation+during+stress.">Reprogramming mRNA translation during stress.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).</li><li>Buchan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNP+granules:+Assembly,+function,+and+connections+with+disease.">mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease.</a> RNA Biol. 11 (8), (2014).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+ternary+complex+(eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules.">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li><li>Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+and+cell+signaling:+more+than+just+a+passing+phase?.">Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase?.</a> Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+shuttling+of+TIA-1+accompanies+the+recruitment+of+mRNA+to+mammalian+stress+granules.">Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 151 (6), 1257-1268 (2000).</li><li>Bley, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+are+dispensable+for+mRNA+stabilization+during+cellular+stress.">Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 43 (4), e26 (2015).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G3BP-Caprin1-USP10+complexes+mediate+stress+granule+condensation+and+associate+with+40S+subunits.">G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits.</a> J Cell Biol. 212 (7), 845-860 (2016).</li><li>Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+mammalian+stress+granule+dynamics.">Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics.</a> J Cell Biol. 215 (3), 313-323 (2016).</li><li>Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules,+P-bodies+and+cancer.">Stress granules, P-bodies and cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1849 (7), 861-870 (2015).</li><li>Aulas, A., Van de Velde, ., C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+stress+granule+dynamics+driven+by+TDP-43+and+FUS:+a+link+to+pathological+inclusions+in+ALS?.">Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS?.</a> Front Cell Neurosci. 9, 423 (2015).</li><li>Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulatory+networks+in+immunity.">Post-transcriptional regulatory networks in immunity.</a> Immunol Rev. 253 (1), 253-272 (2013).</li><li>Wolozin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+protein+aggregation+run+amuck:+stress+granules+and+the+genesis+of+neurodegenerative+disease.">Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease.</a> Discov Med. 17 (91), 47-52 (2014).</li><li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+stress+granules+and+P-bodies+during+RNA+virus+infection.">Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (3), 317-331 (2013).</li><li>Somasekharan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YB-1+regulates+stress+granule+formation+and+tumor+progression+by+translationally+activating+G3BP1.">YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1.</a> J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).</li><li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib,+a+multikinase+inhibitor,+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells.">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. , (2015).</li><li>Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules.">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell Int. 10, 12 (2010).</li><li>Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+ubiquitin-proteasome+system+induces+stress+granule+formation.">Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation.</a> Mol Biol Cell. 18 (7), 2603-2618 (2007).</li><li>Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+activates+HIF-1+to+regulate+vascular+radiosensitivity+in+tumors:+role+of+reoxygenation,+free+radicals,+and+stress+granules.">Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules.</a> Cancer Cell. 5 (5), 429-441 (2004).</li><li>Szaflarski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vinca+alkaloid+drugs+promote+stress-induced+translational+repression+and+stress+granule+formation.">Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation.</a> Oncotarget. 7 (21), 30307-30322 (2016).</li><li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1.">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li><li>Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+TIA-1+and+TIAR+link+the+phosphorylation+of+eIF-2+alpha+to+the+assembly+of+mammalian+stress+granules.">RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).</li><li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li><li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).</li><li>Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+method+for+mapping+genes+on+Drosophila+polytene+chromosomes.">Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+characterization+of+stress+granules+in+virus+infected+cells.">Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells.</a> Methods. 90, 57-64 (2015).</li><li>David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emetine+optimally+facilitates+nascent+chain+puromycylation+and+potentiates+the+ribopuromycylation+method+(RPM)+applied+to+inert+cells.">Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells.</a> Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).</li><li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+visualization+and+dynamics+of+newly+synthesized+proteins+in+rat+hippocampal+neurons.">In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons.</a> Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).</li><li>Ruggieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+oscillation+of+translation+and+stress+granule+formation+mark+the+cellular+response+to+virus+infection.">Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).</li><li>Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+contribute+to+alpha-globin+homeostasis+in+differentiating+erythroid+cells.">Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).</li><li>Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+RNAi+screen+links+O-GlcNAc+modification+of+ribosomal+proteins+to+stress+granule+and+processing+body+assembly.">A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly.</a> Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).</li><li>Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+pathways+regulated+by+arsenate+and+arsenite.">Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite.</a> Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).</li><li>Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic+binding+to+proteins.">Arsenic binding to proteins.</a> Chem Rev. 113 (10), 7769-7792 (2013).</li><li>McDonald, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+(TDP-43)+regulates+stress+granule+dynamics+via+differential+regulation+of+G3BP+and+TIA-1.">TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1.</a> Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).</li><li>Aulas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G3BP1+promotes+stress-induced+RNA+granule+interactions+to+preserve+polyadenylated+mRNA.">G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA.</a> J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).</li><li>Martin, S., Tazi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+G3BP+stress+granules+dynamics+in+live+primary+cells.">Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li><li>Wippich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+specificity+kinase+DYRK3+couples+stress+granule+condensation/dissolution+to+mTORC1+signaling.">Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling.</a> Cell. 152 (4), 791-805 (2013).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כפי שמעידים מחקרים immunohistological במחלות רבות, מתח כרוני מוביל להיווצרות של מוקדים תאיים שונים. לדוגמה, רוב מחלות נוירודגנרטיבית מאופיינים אגרגטים תאיים של חלבונים מסיסים. נוכחותם של חלבונים הקשורים ל- SG באגרגטים כאלה היא לעתים קרובות הבסיס למסקנה כי מוקדים כאלה הם SGs. מסקנה דומה מצוירת גם כאשר foci חיובי cytoplasmic סמן סמן נצפים בתאים מטופלים עם גירויים מתח חדש. פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה פשוטה לזהות SGs בתום לב . מספר קריטריונים חייבים להיות נפגשו עבור SGs putative להיות מאושר ככזה, כולל אפיון של הרכב והן הדינמיקה. ראשית, SGs הם foci cytoplasmic המכילים mRNPs נתקע translationally. לפיכך, הגישה הראשונה היא לאפיין את ההרכב שלהם באמצעות שתי טכניקות מבוססות מיקרוסקופ, כלומר polyA-Fish ו IF. דגים היא שיטה אמינה חזותיתIze mRNAs כי colocalize עם SGS. בדיקה אוליגו (dT) 40 משמש לזיהוי mRNAs polyadenylated כי לארוז לתוך SGs תחת תנאי מתח. מאחר שאוליגו (dT) לא יזהה את ה- mRNAs המתוקן, שהם מרכיבי הליבה של גופי עיבוד (PB), נוכחות של אות אוליגו (dT) חזק בפוקסי ציטופלסמה היא אינדיקציה ראשונה (אם כי לא מספיק להגדרה) SGS. המבחן השני הוא להדגים את colocalization של פולי (A) האות עם סמנים אחרים SG ( למשל, G3BP1) ( איור 2 א ). זה נעשה על ידי ביצוע IF נגד חלבונים סמן SG. סמנים SG eIF3b, eIF4G, ו G3BP1 משמשים באופן שגרתי כי eIF3b ו eIF4G הם גורמים ייזום התרגום ידוע להיות רכיבים של 48S * קומפלקסים ו G3BP1 נדרש להיווצרות SG ( איור 2 ב ). חשוב להדגיש כי יותר מ סמן SG אחד נדרש, כמו מדגיש שונים לגייס גורמים שונים הקשורים SG ל SGs, וכמה מדגיש יכול cAuse חלבון צבירה כי יכול להיות מוטעה עבור היווצרות SG. שנית, SGs נוצרים בגלל עיכוב תרגום. בעוד העיכוב של התרגום יכול להיות מזוהה על ידי גישות שונות ( למשל, על ידי המסורתי [ 35 S] Mete תיוג מרדף), ribopuromycylation הוא העדיף, כפי שהוא מזהה תרגום חלבונים מתמשכים בתאי שטופלו. טכניקה זו תואמת גם immunofluorescence תקן נגד סמנים SG, ובכך מאפשר ניטור בו זמנית של SGs ואת מידת עיכוב התרגום בתאים בודדים. כפי שניתן לראות בתרשים 3 , SA ו VRB שניהם לקדם SG היווצרות מעלות שונות. בעוד SA גורם SGs כמעט 100% של תאים, VRB מקדם SG הקמת כ 75% של תאים. היכולת לקדם SGs מתואמת עם מידת עיכוב התרגום: בעוד תאים מטופלים יש רמה בסיסית גבוהה של התרגום, SA מעכב תרגום לחלוטין, אבל VRB רק הרשותמעכב באופן rtially תרגום ( איור 3 ). שלישית, SGs הם דינמיים והם שיווי משקל עם תרגום polysomes. טיפול בתאים עם cycloheximide לפני מתח או בעת ובעונה אחת עם הלחץ מונע פירוק polysome ויצירת SG. שיווי משקל SG-polysome הוא דו כיווני, כמו תאים הדגיש המציג SGs ניתן לטפל עם cycloheximide לאכוף פירוק SG על ידי השמנה mRNAs ב polysomes או מונוזומים בכל פעם שהם יזמו באופן פרודוקטיבי. שליטה חשובה היא להשתמש puromycin, אשר מעכבת התארכות על ידי קידום סיום מוקדמת, ובכך להגדיל את כמות שאינם mysNs polysomal זמין עבור הקמת SG. שינויים דרמטיים ב SGs הם נצפו כאשר SA או טיפול VRB הוא מצמידים עם CHX או טיפול פורו ( איור 4 ). לפיכך, להעריך אם SGs putative הם מומס על טיפול cycloheximide אבל הם augmented או לא מושפעים על ידי puromycin הוא פרמטר ניסיוני מפתח להשתמש ב- SG מזהים<html> קטיון. ההרכבה של ה- SG34 + של ה- emetine- נאכף בתאי עצם קטנים מאוד, לא דבקים, בתאי CD34 + הודגמה בהצלחה על-ידי טיפול בתאים בהשעיה לפני טיפול ב- cytospinning 32 . נתרן ארסניט הוא בשימוש נרחב להפעלת SGS על ידי גרימת eIF2-α phosphorylation 33 , אבל זה צריך להיות טיטרציה בזהירות , שכן מטרות חלבונים רבים ומפעיל מספר מסלולים איתות 34 , 35 . שורות תאים שונים התערוכה דרגות שונות של רגישות נתרן ארסניט. U2OS רגישים יחסית (100 מיקרומטר), בעוד COS7, MEFs, ו הלה דורשים 200 מיקרומטר. DU-145 6 , המוח העיקרי נורמלי מח עצם CD34 + תאים 32 , lymphoblasts האדם 36 , נוירונים קליפת המוח 37 , ו תאים Huh7 31 דורשים 500-1000 מיקרומטר. Ass = &quot;jove_content&quot;&gt; כמו סיווג של SGs הוא בעיקר מתודולוגיה מבוססת מיקרוסקופ, חשוב לרכוש תמונות באיכות משוחדת. חשוב לקחת את התמונות באופן לא משוחק, כמו בחירת אזורים בעלי מספר גבוה או נמוך של SGs יכול להטות את הממצאים. שיקולים אחרים כוללים צילום תמונות בכל ערוץ באמצעות אותה חשיפה; זה יבטיח כי כל השינויים בעוצמת פני coverslips מעידים על שינויים בסמן זה. בנוסף, לקחת את כל התמונות על רמות לא רווי של אינטנסיביות כך בעוצמה ניתן להעריך על פני הניסוי כולו. לרכוש את כל התמונות באותו יום באמצעות מיקרוסקופ זהה / מצלמה, כמו שינויים עוצמת הנורה יכול להשתנות מיום ליום בין מיקרוסקופים. לבסוף, חשוב לבדוק את המסננים וההגדרות של המיקרוסקופ שישמש התמונה שקופיות. פרוטוקול זה מוגדר עבור מיקרוסקופ עם קבוצות סינון המאפשר הדמיה של UV, ירוק, אדום, וערוצים אדום רחוק. התאמות עשויות להיותהכרחי עבור מיקרוסקופים שונים. זרימת עבודה ניסיונית המתואר כאן מאפשר זיהוי של SGs בתאים שונים תחת מדגיש שונים. היתרון העיקרי של זרימת עבודה זו הוא שזה פשוט ומאפשר זיהוי חד משמעי של SGs בתום לב , כמו גם עבור בדיקה סימולטנית של התרגום הסלולר בתאי מטופלים בלחץ. פרוטוקול זה משתמש בתאי U2OS, אבל זה יכול להיות מתוקן עבור שורות תאים שונים או אפילו עבור תאים ראשוניים. רשימה עדכנית ומקיפה של תאים המשמשים ללימודי גרגרי מתח היא סקירה 11 . מספר התאים צריך להיות מותאם כדי להגיע confluency 80% ביום של טיפול בסמים. ריכוז ומשך הטיפול התרופתי צריך להיות מותאם גם כן, כמו תאים להגיב אחרת. בנוסף, בעוד פרוטוקול זה מוגדר עבור בפורמט 24-היטב, זה יכול להיות מותאם לכל צלחת גודל או צלחת שבה coverslips (בכל גודל) יכול להניח שטוח במהלך ציפוי ציפוי סמיםNt. שורות תאים Stable הבעת סמנים / PB סמנים שימשו תפוקה גבוהה, siRNA מבוססי מסכים 33 ו-תא הדמיה חיה 38 . תמונה מבוסס הקרנה הועסק באמצעות תאים HeLa מוכתם עבור אנדוגני SG סמן PABP לזהות תרכובות כימיות חסימת SG הרכבה 39 . זה צפוי כי זרימת עבודה זו תהיה שימושית מחקרים ויישומים עתידיים.

תאים מפעילים מנגנונים רבים כדי להגיב ללחץ. כמה תגובות להתרחש ברמה שלאחר תמלול כרוך הרגולציה mRNA תרגום ו / או יציבות 1 , 2 . מתח מאופנן mRNA translational מעצר והשפלה קשורות עם היווצרות של ספציפי foci הסלולר הלא ממברנות, המאופיינים היטב להיות גרגרי מתח (SGs) 3 . SGS הם foci cytoplasmic כי ריכוז mRNPs nonnransls בתאי transransly- נעצר להגיב ללחץ ( למשל, חמצון, הלם חום, רעב מזין, זיהום ויראלי) 4 . בנוסף mRNAs nontranslating, SGS מכילים גורמים חניכה התרגום, RNA מחייב חלבונים, וחלבונים איתות שונים 5 . SGS הם ביומרקרים של חלבון inhibited תרגום ושינו את חילוף החומרים RNA ו נקשרו הישרדות התא אפופטוזיס, איתות המסלולותהליכים גרעיניים 5 . SGS הם ישויות דינמיות, והיווצרותם קשורה קשר הדוק למעמד התרגום הסלולר 6 . למרות המראה המוצק לכאורה שלהם, רוב רכיבי החלב SG במהירות מעבורת פנימה והחוצה, עם זמן מגורים של שניות. בעוד SGs להתמיד במשך דקות עד שעות, רוב הרכיבים שלהם הם שטף מהיר. עיכוב התחלת התרגום והפירוק הנוסף של תרגום פוליסומות מקדמים את היווצרותם של SGS; לפיכך, SGs נמצאים שיווי משקל עם תרגום polysomes. זה שיווי משקל polysome / SG הוא המפתח להבדיל SGs בתום לב מ מתח אחר המושרה מוקדים 6 , 7 . עיכוב התחלת התרגום כרוך בהמרה של מתחמי טרום-חניכה מוכשרים לתרגום, המכילים mRNA, גורמי ייזום התרגום (eIF) ומקטעי 40S ריבוזומליים (s)<html> O-48S מתחמי 48) לתוך מתחמי stallened translationally (שנקרא 48S * קומפלקסים) שיכולים להתמזג לתוך SGs 4 , 6 . SGS מקודמים על ידי מעצר translational בשני שלבים שונים במעלה של 48S היווצרות מורכבת: הפרעה עם פונקציות של כובע מחייב eIF4F מורכבים ( למשל, מיקוד eF4A שלה יחידת משנה) או זרחון של יחידת משנה α של גורם ייזום התרגום eIF2, בתיווך אחד או יותר של ארבעת eIF2 קינאזות. נוכחותם של מתחמי 48S נתקע ( כלומר 40S יחידות משנה ribosomal ו נבחר גורמים התחלת התרגום) הוא סימן ההיכר של SGS 8 , 9 . SGS נקשרו למצבים פתולוגיים שונים, כגון זיהומים ויראליים, ניוון מוחי, אוטואימוניות וסרטן 3 , 10 , 11 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 . צורות מוטציה של כמה מרכיבי SG קשורים למחלות נוירודגנרטיביות ( למשל, טרשת לרוחב אמיוטרופית), שבה נוירונים מציגים תכלילים פתולוגיים תאיים העשויים לשחק תפקידים פעילים במוות העצבית 13 . וירוסים מסוימים לחטוף רכיבי SG לעכב היווצרות SG כדי לשפר את שכפול ויראלי 14 . מחקרים שנעשו לאחרונה מקשרים בין SGS לבין סרטן 15 לבין הישרדות תאי סרטן תחת טיפולי כימותרפיה ורדיותרפיה 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . בעוד ממצאים אלה עוררו עניין רב בביולוגיה של SG, רבים מהדו&quot;חות שפורסמו חסרים בקרות חשובות על מנת להבחין בין היווצרותם של SGS בתום לב לבין מוקדי מתח נוספים. SGs תוארו בתחילה כמו foci cytoplasmic לא ממורכבים המורכבים mRNA מחייב חלבונים מחייב (RBPs), כולל T- תא תאיים אנטיגן 1 (TIA-1) ו Poly-A מחייב חלבון (PABP); גורמי ייזום התרגום; MRNA polyadenylated; ו קטן ribosomal יחידות 4 , 6 , 21 , 22 . באופן מסורתי, הרכב שלהם נקבע על ידי טכניקות כגון immunostaining ואת הביטוי ectopic של חלבונים מתויגים fluorescently 23 , 24 . בשל אופי דינמי מאוד שלהם, immunolocalization של חלבונים SG ו / או mRNAs נשאר המתודולוגיה הגדרת לאיתור SGs 23 , 24 . עד כה, RBPs רבים חלבונים אחרים (מעל 120 חלבונים שונים) מתוארים רכיבי SG 11 . כמו רבים Sחלבונים מבוססי G משנים את הלוקליזציה שלהם בתלות בלחץ ובצורה עצמאית ויכולים לצבור בתאים תאיים ופוצ&#39;י אחרים, חשוב לבחור סמני SG מתאימים ולהשתמש בקריטריונים פונקציונליים כדי להבדיל בין SGS לבין סוגים אחרים של מתח המושרה מוקדים. SGS בתום לב מכילים mRNA, גורמים ייזום התרגום, ו קטן יחידות משנה ribosomal והם שיווי משקל דינמי עם תרגום. תהליך עבודה פשוט זה נועד לקבוע אם פוקוס המושרה מתח הוא SGS בתום לב . זרימת עבודה זו כוללת כמה גישות ניסיוניות באמצעות תאים U2OS, תאים נפוץ ללמוד SGS. תאים אלה הם אידיאליים, שכן יש להם ציטופלסמה גדולה, שטוחים יחסית, וצרף חזק coverslips זכוכית. סוגי תאים אחרים יכולים לשמש ללימוד SGS, אך חשוב להיות מודעים לכך שההבדלים בעיתוי, ריכוז התרופה, ושפע של חלבונים מסוג SG-nucleating יכולים לשנות את הקינטיקה והקומפו. בנוסף, תאים מסוימים מגיבים קיבוע paraformaldehyde על ידי יצירת משטח blebs תא, נותן לאחר מכן הופעה פרועה שגורמת לוקליזציה לנקב של כמה סמנים SG; ללא ניתוח זהיר, אלה יכולים להיות מסווגים כמו SGs. זה מדגיש את הצורך להעריך את כל הקריטריונים הנדרשים כדי לזהות מתח מובנה foci כמו SGs בתום לב . Vinorelbine (VRB), טיפול סרטני המקדם SGs 20 , כמו גם סודיום ארסניט (SA), חזק ומובחן SG inducer, משמשים מדגיש את הניסויים בפרוטוקול זה. SGs קנוניקל להכיל מספר סמנים SG (הן חלבונים mRNAs) כי colocalize ב מוקדים cytoplasmic. פרוטוקול זה משתמש הן immunofluorescence ו פלואורסצנציה באתרו באתרו (דגים) כדי לזהות את לוקליזציה של סמנים חלבון ו mRNA polyadenylated 22 , בהתאמה. בקצרה, immunofluorescence עקיף משתמש נוגדנים ( i.ה. נוגדנים ראשוניים) ספציפיים עבור חלבון נתון כדי לזהות אותו בתוך התא. לאחר מכן, נוגדנים משניים (בדרך כלל מינים ספציפיים) המצורפת fluorochromes לזהות את הנוגדן העיקרי לחשוף את הלוקליזציה היעד חלבון. מיקרוסקופ פלואורסצנטי משמש כדי לזהות את האות המקומי בתוך התא. שימוש נוגדנים המיוצרים במינים שונים וגילוי אותם עם נוגדנים משני צבע שונה מאפשר זיהוי של colocalization של נוגדנים מרובים, המציין כי מטרות החלבון שלהם נמצאים באותו מיקום 23 . חשוב לבחור סמנים אשר אומתו כדי colocalize ב SGs בתום לב . FISH משתמש בדיקה שכותרתו כי בסיס זוגות לרנ&quot;א מסוים או רצף DNA 25 . כדי לזהות mRNA, פרוטוקול זה משתמש oligo biotinylated (dT) 40 בדיקה כי הכלאה (או זוגות זוג) לזנב polyA של mRNA ( כלומר polyA FISH). בדיקה biotinylated מזוהה אז באמצעות streptavidin מצומדות fluorescently, כמו streptavidin יש זיקה גבוהה לביוטין. כאשר מעריכים SGS, חשוב כמה דגים polyA עם immunofluorescence גילוי סמן SG, כמו בתום לב SGS, שני האותות צריך colocalize. באמצעות פרוטוקול זה, colocalization מוערך במספר דרכים. ב רב ערוצי ( כלומר RGB: אדום, ירוק וכחול) התמונה, colocalization ישנה את הצבע של האות חופפים ( למשל colocalized אדום וירוק מופיעים צהוב) 23 . בנוסף, colocalization הוא לכמת בצורה גרפית באמצעות ניתוח סריקה קו, שבו את העוצמה של כל צבע נמדדת על פני שורה 8 , 20 . פרוטוקול זה מתאר שני שורת סריקה הליכי ניתוח באמצעות ImageJ 26 . הליך אחד הוא ידני ועובר את כל התהליך, whiהשני משתמש מאקרו, או תוכנית פשוטה אשר ממכן את השלבים הידניים. חשוב לעבור את התוכנית ידנית כדי להבין את הליך מאקרו. SGS בתאים שבהם התרגום מודחק; לכן, תאים עם SGs צריך להציג ירידה ברמות של התרגום העולמי לעומת תאים מטופלים. ניסויי, ribopuromycylation משמש. Puromycin ו emetine מתווספים לתאים למשך זמן קצר לפני קיבעון, המאפשר puromycin לשלב לתוך פוליפפטידים להרכיב באופן פעיל, גרימת סיום 27 , 28 . טיפול באמטין נדרש כדי למנוע את התחלת הטיפול מחדש. Puromycin אז ניתן לזהות באמצעות נוגדן אנטי puroycin, נותן תמונה של תרגום פעיל. שיטה זו משמשת משום שהיא מהירה, אינה דורשת מראש רעב עם מדיום חסר חומצת אמינו מסוימת (פוטנציאלית ו prressing התאים), ומגלה אתלוקליזציה תת - תאית של תרגום חלבונים. שיטות אחרות, בעיקר באמצעות אנלוגים חומצה אמינו שונה, כגון methionine אנלוגי L-azidohomoalaine (AHA), יחד עם &quot;לחץ על זה&quot; כימיה 30 , שימשו כדי להראות כי תאים המכילים SGs התערוכה תרגום הרבה יותר נמוך מאשר תאים סמוכים 31 . עם זאת, טכניקה זו דורשת רעב מתיוני ואחריו דופק תיוג של 15-30 דקות. הרעב של מתיונין מהווה לחץ נוסף, בעוד שזמן התיוג הארוך ( כלומר 15-30 דק &#39;) גורם למדידה של התרגום המצטבר ולא לתרגום מתמשך וגם מאפשר לחלבונים המסונתזים החדשים לעבור מאתר הסינתזה שלהם ליעד הסופי שלהם בתוך תָא. לעומת זאת, ribopuromycylation הוא הרבה יותר מהר והוא תואם לכל מדיום, כגון המדיום חופשי גלוקוז המשמש לייצור SGs דרך רעב גלוקוז. קנוניקל SGs הם שיווי משקל דינמיעם תרגום פעיל polysomes. ניתן להעריך זאת באופן ניסיוני על ידי טיפול בדגימות עם תרופות המייצבות או מערערות את הפוליזומים, ובכך מפזזות את האיזון בין SGs לבין פוליסומות 23 . Cycloheximide (או emetine, אשר מתנהג באופן דומה) חוסם התארכות על ידי ריבוזומים &quot;מקפיא&quot; על mRNA, ובכך להקטין את הבריכה של mRNPs הלא polysomal זמין מסוגל להקים SGs. ניסוי זה יכול לשמש בשתי דרכים: על ידי הוספת cycloheximide (או emetine) לפני מתח כדי למנוע היווצרות SG או על ידי הוספת cycloheximide (או emetine) לאחר SGs יצרו, גם מבלי להסיר את הדגיש סוכן, גרימת SG dis disembly, כמו תקוע מתחמי preinitiation הם הודה אט אט לתוך החלק polysome. לעומת זאת, puromycin גורם לסיום מוקדם ומקדם פירוק polysome, להגדיל את הבריכה של mRNAs ייזום מסוגל להרכיב SGS. באופן ניסיוני, טיפול puromycin מגדיל את מספר ה- SG או מוריד את הטרשולד שבו הם נוצרים בתגובה ללחץ מדורג או מינון סמים. כאשר בוחנים את ההשפעה של puromycin, חשוב להשתמש ברמה תת-מקסימלית של התרופה המעניינת, מכיוון שפרומיצין צפוי להגדיל את השפעת התרופה ולהגדיל את אחוז התאים המציגים SGS - זה לא יכול להתרחש אם התרופה / מתח גורם SGs ב 100% של התאים בתחילה. זה מנוגד לטיפול cycloheximide, אשר מפרק SGs ועובד הכי טוב כאשר ~ 95% מהתאים בתחילה להציג SGS כך הירידה הגדולה ביותר ניתן לצפות ו לכמת במדויק. פרוטוקול זה מספק מסגרת ללמוד SGs בתאי יונקים. השיטות כוללות: (1) מכתים immunofluorescent וניתוח ImageJ כדי להעריך את colocalization קלאסי SG- הקשורים סמנים eIF4G, eIF3b, ואת ראס GTPase- הפעלת חלבון מחייב חלבון 1 (G3BP1) ב SGs משוערת; (2) אוליגו (dT) פלואורסצנציה בהכלאה באתרו (polyA FISH) כדי לזהות polyrenylated mRNA; (3) cycloheximide ו puromycin טיפול כדי לקבוע אם הלחץ- Induced foci הם שיווי משקל דינמי עם polysomes; ו (4) ribopuromycylation להעריך את המצב translational של תאים המכילים SG SG. ביחד, מבחני אלה יכולים לקבוע אם foci מתח המושרה יכול להיות מסווגת כמו SGs בתום לב .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174;HTB-96&#8482;</td>
			<td>- commonly written as &#34;U2OS&#34; 
			- culture at 37 &#176;C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>- abbreviated DMEM 
			- contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red 
			- supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin 
			- prewarm prior drug(s) dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td>- abbreviated FBS 
			- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline streptomycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ml</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tissues</td>
			<td>KIMTECH SCIENCE</td>
			<td>34120</td>
			<td>- commonly called &#34;kimwipes&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td>- autoclaved before used 
			- keep sterile in the tissue culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium (meta)arsenite &#8805;90%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7400-100G</td>
			<td>- commonly called sodium arsenite and abbreviated SA 
			- dissolution in water at 1 M concentration, then dilute to 100 &#181;M as a working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>TSZ CHEM</td>
			<td>RS055</td>
			<td>- abbreviated VRB 
			- dissolve in water to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9620</td>
			<td>- used to assess translation level (ribopuromycylation) 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emetine dihydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2375</td>
			<td>- used in combination with puro to assess general translation level 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4859</td>
			<td>- abbreviated CHX 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Lonza / VWR</td>
			<td>95042-486</td>
			<td>- abbreviated PBS 
			- wash buffer for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>- make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved 
			- aliquots can be stored at - 20 &#176;C for several months 
			- hazardous, use ventilation 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS</td>
			<td>BDH / VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td>- pre-chilled to -20&#176;C before use 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td>- abbreviated NHS 
			- dilute to 5% in PBS 
			- add sodium azide for storage at 4&#176;C 
			- blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC</td>
			<td>Decon Labs / VWR</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>- dilute to 70% with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-81940</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- use at 1/100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti eIF4G antibody (H-300)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-11373</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti eIF3&#951; (N-20) antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-16377</td>
			<td>- eIF3&#951; is also known as eIF3b 
			- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti puromycin 12D10 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE343</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-225-150</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/2500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td>- incubate with secondary antibodies 
			-stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light 
			- Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>016-160-084</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions, then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-(dT)40x probe biotinilated</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>/</td>
			<td>- reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20&#176;C 
			- dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use 
			- custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridation box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>- make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom 
			- prewarm the box prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x SSC buffer</td>
			<td>Thermo fisher Ambion</td>
			<td>AM9763</td>
			<td>- dilute to 2X SSC using RNase Free water (DEPC treated) 
			- store at room temperature 
			- wash buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfectHybPlus Hybridization Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7033-50ml</td>
			<td>- block and probe incubation buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide mounting media</td>
			<td>home made</td>
			<td>/</td>
			<td>- mix 5 g of &#8220;cold-soluble&#8221; poly(vinyl alcohol) in 20 ml of PBS 
			- mix by sonication, followed by stirring overnight at RT 
			- Add 5 ml of glycerol and 0.2 ml of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT 
			- centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet 
			- aliquot viscous liquid, long-term storage at -20&#176;C, 1 week at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>- usually referred as &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-8136-250G</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100ML</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td>- preservative agent for blocking solution and vinol 
			- make a 20 % dilution in water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules

תאים לעתים קרובות לערער על ידי שינויים סביבתיים פתאומיים. גרגרי מתח (SGS), קומפלקסים ריבנוקלאופרוטין cytoplasmic כי הטופס בתאים חשופים לתנאי מתח, מעורבים בהיבטים שונים של חילוף החומרים התא הישרדות. SGS לווסת מסלולים איתות הסלולר, שלאחר תעתיק ביטוי גנים, ותגובות תגובה. היווצרות של גרגרים אלה המכילים mRNA מחובר ישירות לתרגום הסלולר. הרכבה SG מופעלת על ידי ייזום התרגום inhibited, ו- SS dis disembly הוא מקודם על ידי הפעלת התרגום או על ידי התארכות התרגום מעכב. מערכת יחסים זו מודגשת עוד יותר על ידי הרכב SG. Core רכיבי SG הם נעצר תרגום מראש מתחמי ייזום, mRNA, ובחירה RNA מחייב חלבונים (RBPs). מטרת הרכבה SG היא לשמר את האנרגיה הסלולרית על ידי השמירה translationally mNANA הרדוקציה translationally, המאפשר לתרגום משופר של חלבונים מגיב ללחץ. בנוסףעל מרכיבי הליבה, כגון מתחמי preinitiation תרגום נתקע, SGS מכילים שפע של חלבונים אחרים ומולקולות איתות. פגמים במבנה SG עלולים לפגוע בהסתגלות תאית ללחץ ולכן יכולים לקדם מוות של תאים. SGs ו דומה RNA המכילים גרגרי היו מקושרים למספר מחלות אנושיות, כולל הפרעות ניווניות וסרטן, מה שמוביל את העניין האחרון סיווג והגדרת תת סוג RNA גרגר. פרוטוקול זה מתאר מבחני לאפיין לכמת SGS יונקים.

מתח- Induced foci לא בהכרח SGs. SGs מסווגים foci cytoplasmic המכילים mRNAs, גורמים ייזום התרגום, ו- RNA מחייב חלבונים נמצאים שיווי משקל עם תרגום פעיל. פרוטוקול לעיל ניתן להשתמש כתבנית כדי לאפיין אם הלחץ נתון גורם SGS בתום לב . SGs colocalize עם סמנים ידועים אחרים SG, כולל שני חלבונים ו mRNA. SA ו VRB לגרום foci cytoplasmic המכילים G3BP1, eIF4G, ו eIF3b ( איור 2 א ). Colocalization של סמנים אלה הוא אישר באמצעות ניתוח סריקה קו ותמונות ערוץ יחיד עם הגדלה מוגברת ( איור 2 א ). בנוסף, אלה מוקדים מכילים מרנה, כפי שצוין על ידי polyA דגים, ואת oligo (dT) האות colocalizes עם האות G3BP1 immunofluorescence ( איור 2 ב ). זה קריטי כדי להראות כי polyA-Fishאות חפיפה עם סמן SG ידוע, כמו מתח יכול לקדם סוגים שונים של מוקדים. SGs להתרחש במצב מעוכב translationally. שניהם VRB ו SA לקדם מצב מודחק translationally, כפי שהוערך ניסוי עם ribopuromycylation ( איור 3 ). SGs בתום לב הם שיווי משקל דינמי עם תרגום פעיל polysomes. SA- ו- VRB-Induced SGs הם מומסים עם CHX, אשר מלכודות polysomes על mRNAs, ובכך לעצור פירוק polysome ומניעת SGS ( איור 4 א, 4B ). לעומת זאת, יותר SA ו VRB SGs הם המושרה לאחר טיפול עם puro, כמו puro מקדמת פירוק polysome, ובכך לטובת היווצרות SG ( איור 4 א, 4C ). לסיכום, כמו עם SA- שליטה חיובית, VRB גורם SGS בתום לב כי: (1) colocalize עם סמנים ידועים SG, (2) כוללים גם חלבון ו mRNA ( Figu<html> Re 2), (3) נמצאים בתאים שבהם התרגום מודחק ( איור 3 ), ו (4) הם שיווי משקל דינמי עם תרגום פעיל ( איור 4A-4C ). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55656/55656fig1.jpg" /> איור 1: דיאגרמות הניסוי. ( א ) תאים זרע על coverslips בעבר להציב בצלחת 24 גם, כפי שצוין. התייחסו שורות A ו- B במשך 60 דקות עם SA או VRB באמצעות ריכוז μM כפי שצוין. לאחר 60 דקות, מוסיפים CHX (ריכוז סופי: 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​עבור עמודה 2) או puro (20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​puromycin עבור טור 4) בינוני המכיל סמים. המשך הדגירה במשך 30 דקות נוספות לפני קיבוע מכתים. ( ב ) תרשים של coverslip, המציין את השדות שיש הדמיה לספור. קוברסליפ מחולק לחמישה אזורים שווים בערך; תמונה אחת נלקחת בכל אזור.&quot;Http://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55656/55656fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55656/55656fig2.jpg" /> איור 2: SA ו VRB לעורר מוקדים Cytoplasmic המכילים סמנים SG anPoly (א) mRNA. ( A ) תאים U2OS immunostained עבור G3BP1 (ירוק), eIF3b (אדום), ו eIF4G (כחול). תאים טופלו עם 100 מיקרומטר SA או 150 מיקרומטר VRB במשך 60 דקות או לא טופלו (שליטה). אזורי זום מוגדלים (2X) ומוצגים כערוצים נפרדים בשחור ולבן (להלן). הגרף מציין את ניתוח קו הסריקה של אזור (קו לבן) גרגר ומראה את מידת החפיפה או colocalization. סרגל סולם מייצג 10 מיקרומטר. ( B ) PolyA-Fish יחד עם immunostaining מזהה polyA mRNA עם בדיקה oligo (dT) 40 (אדום), G3BP1 (ירוק) מזוהה באמצעות אנטי Gנוגדן 3BP, ו- DNA גרעיני מזוהה באמצעות צבע Hoechst (כחול). אזורי זום (2X), תמונות ערוץ יחיד, וניתוח קו סריקה להראות colocalization. סולם בר = 10 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55656/55656fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55656/55656fig3.jpg" /> איור 3: SA ו- VRB טיפול סיבה דיכוי. את immunofluorescence של תאים U2OS הדופק שכותרתו עם puromycin במשך 5 דקות לאחר הטיפולים שצוינו. Puromycin (ירוק), eIF3b (אדום), ו- DNA גרעינית מוכתם Hoechst (כחול). התאים טופלו 100 מיקרומטר SA או 150 מיקרומטר VRB במשך 60 דקות או לא טופלו (שליטה). סולם בר = 10 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55656/55656fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לראות גדול יותר</a>יון של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55656/55656fig4.jpg" /> איור 4: SA ו VRB לחדור Foci Cytoplasmic כי הם שיווי משקל דינמי עם Polysomes. ( א ) תוכנית כללית המתאר את polysome / SG היחסים. ( BC ) תאים U2OS מוכתם עבור G3BP1 (ירוק), eIF3b (אדום), ו- DNA גרעיני באמצעות Hoechst (כחול). תאים טופלו עם 100 מיקרומטר SA או 150 מיקרומטר VRB במשך 60 דקות או שלא טופלו (שליטה) לפני תוספת של ( B ) CHX (cycloheximide, 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל), ( ג ) puro (Puromycin, 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ), או לא תוסף עבור 30 דקות נוספות של הדגירה. המספרים תואמים את אחוז התאים עם SGS בניסוי נציג. סולם בר = 25 מיקרומטר, ב (BC). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55656/55656fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר</a>גרסה של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules at JoVE.com

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

גרגרי מתח (SGs) הם מבנים cytoplasmic לא ממברנות אשר יוצרים בתאים חשופים למגוון של לחצים. SGS מכילים mRNAs, RNA מחייב חלבונים, יחידות קטנות ריבוזומליות, גורמים הקשורים לתרגום, וחלבונים שונים איתות איתות. פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה המשתמשת במספר גישות ניסיוניות כדי לזהות, לאפיין, לכמת SGs בתום לב .

שיטות לסיווג מוקדים Cytoplasmic כמו גרגרי מתח יונקים

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

methods-to-classify-cytoplasmic-foci-as-mammalian-stress-granules

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K Views.  Brigham and Women's Hospital.  גרגרי מתח (SGs) הם מבנים cytoplasmic לא ממברנות אשר יוצרים בתאים חשופים למגוון של לחצים. SGS מכילים mRNAs, RNA מחייב חלבונים, יחידות קטנות ריבוזומליות, גורמים הקשורים לתרגום, וחלבונים שונים איתות איתות. פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה המשתמשת במספר גישות נ?...

Video: Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing ו Subculturing בתאי יונקים

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

הפעלה של אפופטוזיס על ידי Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום ג</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

ויזואליזציה של מתח G3BP גרגרי Dynamics בראשי תאים בשידור חי

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

גירוי של cytoplasmic מסלולי חישה DNA<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis כמודל לזיהוי תרגום ירידת ערך

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

שביט Assay כאמצעי עקיף של מתח מערכתי חמצוני

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...