Bu el yazması üzerine faydalı tartışmalar ve geribildirimler için Ivanov ve Anderson laboratuvarlarının üyelerine teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklendi [WP için GM111700 ve CA168872, PI için NS094918], Polonya Ulusal Bilim Merkezi [WS&#39;ye hibe UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054]. WS ayrıca, Polonya&#39;daki Bilim ve Yüksek Öğrenim Bakanlığı (Mobility Plus Programı) ve Lehçe-Amerikalı Fulbright Komisyonu&#39;nu ABD&#39;deki araştırmasına maddi destek verdiği için onayladı.

1. Hücre Hazırlama <ol><li> Şekil 1A&#39;da belirtildiği gibi otoklavlanmış lamelleri, 24 delikli bir plakanın 12 kuyucuğuna ekleyin; Bu, her lamelleri almak için bir vakuma tutturulmuş steril bir Pasteur pipeti kullanılarak yapılabilir. Lamerlerin kuyuya düşmesine izin vermek için emmeyi serbest bırakmak için nazikçe kuyunun kenarındaki lamelleri hafifçe vurun. </li><li> Plaka 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) osteosarkom hücreleri, 500 ul&#39;lik bir orta hacimde oyuk başına. Hücrelerin eşit olarak dağıldığından emin olmak için plakayı yana çevirin ve yukarı ve aşağı doğru birkaç kez hareket ettirin. </li><li> Lamelleri kuyunun en alt kısmında ve lamel altında kabarcıklar olmadığından emin olmak için nazikçe lamelleri aşağı doğru temiz bir P1000 ucu ile bastırın. </li></ol> 2. Stresli Hücreler <ol><li> Ertesi gün, hücrelerin lamellerin her tarafında eşit olarak dağılmış ve eşit şekilde birleştiğinden emin olmak için plakayı görsel olarak kontrol edin;Erkekler sonuçların tekrarlanabilirliğini olumsuz yönde etkileyebilir. Ters çevrilmiş doku kültürü mikroskopu üzerinde 10X&#39;lik bir hedef kullanın. </li><li> Ortamı 37 ° C&#39;ye ısıtın. Sırasıyla soğuk şok veya ısı şokuya neden olduğundan, hücrelere soğuk veya sıcak ortam uygulamanızdan kaçının. </li><li> İlacı önceden ısıtılmış ortamda seyreltin. Her bir farklı ilaç konsantrasyonu için, 500 uL ortam içeren 2 göz hazırlayın. Pipetleme yaparken kaybedilmesine izin vermek için ek 500 mcL hazırlayın. Alkol 4 tüp, her biri 1.5 mL içerir. <ol><li> Sodyum arsenit için: 500 uL içeren her oyuğa, 1.5 mcL 100 mM sodyum arsenit (nihai konsantrasyon: 100 uM) ekleyin veya 100 mM sodyum arsenit (son konsantrasyon: 50 uM) 0.75 μL ekleyin. </li><li> Vinorelbin için: 500 uL içeren her oyuğa 22.5 μL 10 mM vinorelbin (nihai konsantrasyon: 150 uM) ekleyin veya 18.75 μL 10 mM vinorelbin (nihai konsantrasyon: 100 uM) ekleyin. NOT: Sodyum arsenit<html> Iyi karakterize edilmiş ve sıkça kullanılan bir stres granül uyarıcısıdır ve bu nedenle klasik olarak pozitif bir kontrol olarak kullanılır. </li></ol></li><li> Ortamları B1 - 4 ve C1 - 4 kuyularından çıkarın ve atın. İlaçları medyaya ekleyin ve 60 dakika bekleyin (Şekil 1A). <ol><li> Kuyu B1 ve B2&#39;ye 100 uM sodyum arsenit ile 500 uL orta madde ekleyin. B3 ve B4 kuyularına 50 uM sodyum arsenit ile 500 uL orta madde ekleyin. </li><li> Kuyu C1 ve C2&#39;ye 150 uM vinorelbinli 500 uL orta madde ekleyin. Kuyu C3 ve C4&#39;e 125 uM vinorelbinli 500 uL orta madde ekleyin. </li></ol></li><li> Fiksasyondan 30 dakika önce kolon 2&#39;deki oyukları 5 μL sikloheksimid (1 mg / mL stok) ve kolon 4&#39;deki oyukları 2 uL puromisin (1.25 mg / mL stok) ile muamele edin. 37 ° C inkübatörde plakayı yerleştirmeden önce karıştırmak için plakayı hafifçe sallayın. </li></ol> 3. Hücre fiksasyonu ve immünofloresans Nt &quot;&gt; NOT: Deneyden önce metanolün -20 ° C&#39;ye soğutulduğundan emin olun Fosfatla tamponlanmış Tuzlu Su (PBS),% 5 Normal At Serumu (NHS) ve% 4 paraformaldehid (PFA ) PBS içinde. <ol><li> Ortamı atın ve lamelleri içeren kuyuları PBS ile yıkayın. Kullanılan ilaçlara bağlı olarak, ilaç içeren medyayı uygun bir şekilde atmak önemli olabilir; Belirli talimatlar için yerel çevre güvenlik ofisine başvurun. Etkin bir şekilde yıkamak için, sıkıştırılmış bir şişeyi PBS ile doldurun, sıkı bir akış olmadan nazik bir akış sağlamak için ucu kesin ve orijinal PBS&#39;yi aspire ettikten sonra her kuyuya PBS eklemek için kullanın. </li><li> Nazik ajitasyon altında oda sıcaklığında 15 dakika boyunca ~ 250 mcL% 4 PFA kullanarak hücreleri düzeltin. PFA ile lamelin üstünü tamamen örtün; 250 μL yeterli olmalı, ancak değilse daha fazla ekleyin. Bazı hücreler (veya hücrelerin stres tedavileri) bağlanmayı değiştirebileceğinden daima lamellerin üzerine doğrudan pipet koymaktan kaçının.Pipetleme gücü hücreleri uzaklaştırır. </li><li> PFA&#39;yı çıkarın ve doğru şekilde atın. Paraformaldehidi uygun bir şekilde nasıl atacağınız hakkında ayrıntılı bilgi için yerel çevre güvenlik ofisine başvurun. </li><li> ~ 250 μL metanol (-20 ° C) ekleyin ve nazik sallanan ortamda oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin; Bu her ikisi hücreleri permeabilize eder ve düzleştirir. </li><li> Metanolü çıkarıp atın ve 4 ° C&#39;de oda sıcaklığında 1 saat boyunca ~ 250 uL% 5 NHS uygulayarak hücreleri bloke edin. Metanolün uygun şekilde atılmasına ilişkin ayrıntılar için yerel çevre güvenlik ofisine başvurun. </li><li> Birincil antikorlar için, antikorları% 5 NHS&#39;de seyreltin. NOT: Gözlemlenen granüllerin iyi SG&#39;ler olup olmadığını teyit etmek için çoklu SG işaretlerinin kullanımı anahtardır. Kullanılabilecek SG işaretlerinin sayısı, mikroskopta bulunan filtrelere bağlıdır. Standart yeşil, kırmızı ve uzak kırmızı filtre setleri mevcutsa, 1/250 seyreltme ile G3BP1, eIF4G ve eIF3b&#39;yi kullanın. <ol><lI&gt; Bu deney için (250 ul&#39;lik lamelleri, her biri toplam: 3 mL,% 5 NHS), aşağıdakilerden her birinden 12 μL ekleyin: anti-G3BP1, anti-eIF3b ve anti-eIF4G. Birincil antikorları, 4 ° C&#39;de oda sıcaklığında veya O / N&#39;de en az 1 saat nazik ajitasyonla kuluçkalayın. </li></ol></li><li> Kuyucukları PBS ile 3 kez yıkayın ve her yıkamayı 5 dakika inkübe edin. </li><li> İkincil antikorlar için, tüm ikincil antikorları (1/250 seyreltme) ve Hoechst boyasını (1/1000 seyreltme)% 5 NHS&#39;de seyreltin. <ol><li> Bu deney için, her birinden 250 μL&#39;de lamelleri toplamı: 3 mL% 5 NHS), aşağıdakilerden her birinden 12 uL ekleyin: Cy2-Fare, Cy3-Tavşan ve Cy5-Keçi (her biri bir 1/250 seyreltme ) Ilave edin ve 3 μL Hoechst boyayı ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca lamelleri ikincil antikorlarla inkübe edin. Bu ve takip eden adımlar sırasında plakayı bir kutu ile örterek veya doku kültürü çanağının üstüne folyo koyarak örnekleri ışığa karşı koruyun. </li></ol></li><li> Biz yıkaHer biri 5 dakika PBS ile üç kez. </li><li> Etiket cam slaytlar üzerine montaj orta kullanarak lamelleri monte edin. Montaj ortamını, 37 ° C&#39;lik bir ısı bloğunda 10 dakika boyunca ısıtın; Bu viskozite azalır ve pipetlenmeyi kolaylaştırır. Kesilmiş bir P200 ucu ile, cam slayt üzerine lamel başına ortalama 25 μL pipetleme; 4-8 lamelleri, mikroskop aşamasının buna izin verdiklerini varsayarak bir cam slaydına sığabilir. İnce forseps kullanarak, lamelini kuyudan slayda aktarın, hücrenin yüzeyi ayağın altına yerleştirdiğinizden emin olun. Temiz bir P200 ucu kullanarak, lamel aşağı doğru bastırın. </li><li> Tüm lamelleri monte edildikten sonra, laboratuar dokusunu slayt üzerine sıkıca basarak aşırı montaj ortamını temizlemek için katlanan laboratuar dokularını kullanın. Fazla montaj ortamını boşaltmak için H 2 O içeren bir sıkıştırma şişesi kullanın ve sonra suyun alınması için katlanmış laboratuvar dokusu ile lekelenmeyi tekrarlayın. </li></ol> 4. Fluorescence In Situ &lt;/ Em&gt; Hibridizasyon (FISH) <ol><li> Bir kılavuz olarak 1 ve 2.1-4 adımlarını kullanarak hücreleri plaklayın ve tedavi edin; Aşağıdaki deneyde sadece 3 lamel batması gerektiği için, hücreleri 1 sütununa yerleştirmeniz yeterlidir. </li><li> Tüm tamponların hazırlandığından emin olun ( yani PBS içinde% 4 PFA, suda% 70 etanol, 2X Tuzlu Sodyum Sitrat (SSC) ve% 5 NHS), metanol -20 ° C&#39;ye soğutulur ve bu da Hibridizasyon fırını uygun sıcaklığa kadar ısıtılır. </li><li> Hücreleri yıkamak ve düzeltmek için 3.1-3.3 adımlarını uygulayın. </li><li> 10 dakika boyunca -20 ° C metanol ekleyerek hücreleri geçirir hale getirin. </li><li> Metanolü çıkarın ve lamelleri% 70 etanol içinde inkübe edin. Plakayı gece boyunca 4 ° C&#39;ye yerleştirin. Buharlaşmayı önlemek için parafilm kullanarak tabakayı mühürleyin. </li><li> Ertesi gün, etanolü çıkarın ve 500 μL 2x SSC ilave ederek hücreleri yeniden su haline getirin. Lamelleri, oda sıcaklığında nazik ajitasyonla 5 dakika inkübe edin. </li><li> 2x SSC&#39;yi çıkarın ve 500&#39;ü ekleyinΜL 2X SSC. Nazik ajitasyonda 5 dakika inkübe edin. </li><li> Hibridizasyon fırınının altına parafilm bir parça koyun. Her lamel için parafilm üzerine hibridizasyon tamponu pipet 25 mcL. (Bu noktada, lamelleri hücre tarafında olan) 24 yuvalı lamel kaldırın ve hibridleştirme tampon üzerinde lamel hücre tarafı aşağı yerleştirin. Bunu 42 ° C&#39;de veya isteğe bağlı olarak 65 ° C&#39;de 15 dakika boyunca yapın. NOT: Bu adımı 65 ° C&#39;de tamamlamak hücresel RNA&#39;ları denatürecektir; PolyA proteinlerle etkileşimler tarafından maskelenirse, bu sinyali artırabilir. </li><li> Hibridizasyon tamponu içinde Biotin-Oligo (dT) probunu (100 ng / μL) 2 ng / ml&#39;lik bir konsantrasyona kadar seyreltin; Lamel başına 25 μL yeterlidir. </li><li> Her lamel için, parafilm üzerine Biotin-Oligo (dT) içeren hibridizasyon tamponu pipetle 25 mcL. Forseps ile lamel Pick up ve yavaşça bir laboratuar dokusu üzerine lamel kenarına dokunmak aşırı kaldırmak içinHibridizasyon tamponu. Lamelini, Biotin-Oligo (dT) ile hibridizasyon tamponuna aktarın; Hücre tarafını aşağıya tutmayı unutmayınız. </li><li> Buharlaşmayı sınırlandırmak için lamelleri bir hibridizasyon kutusuna yerleştirin. Lamelleri Biotin-Oligo (dT) ile melezleme tamponu içinde 42 ° C&#39;de 60 dakika inkübe edin. </li><li> 42 ° C&#39;ye dengelenmesine izin vermek için melezleme fırınına 2x SSC yerleştirin. </li><li> 24-yuva çanağındaki çukurlara ~ 500 uL ısıtılan 2x SSC ilave edin ve lamelleri kuyuya aktarmak için forseps kullanın. 10 dakika inkübe edin. </li><li> Yukarıdaki yıkama adımını 42 ° C&#39;de iki kez ve oda sıcaklığında iki kez tekrarlayın. </li><li> Geleneksel bir antikor yerine Biotin-Oligo (dT) saptamak için bir streptavidin florokrom kullandığınızdan emin olun, 3.5-3.10 adımlarını tamamlayın. </li></ol> 5. Translasyonel Durumu Değerlendirmek için Ribopuromycylation Testi <ol><li> Adım 1&#39;de belirtildiği gibi lamelleri Üzerinde U2OS plakaları plaka, ancak koşul başına sadece bir lamel slayt (buOlgu, 3 lamelleri: tedavi edilmedi, 100 uM sodyum arsenit ve 150 uM vinorelbin) ( Şekil 1A). </li><li> 2. adımda protokolü kullanarak, adım 2.1-2.4&#39;i tamamlayan hücreleri stres haline getirin. </li><li> Fiksasyondan 5 dakika önce, 2 μL puromycin (stok: 1.25 mg / mL, 5 μg / mL&#39;lik bir nihai puromisin konsantrasyonu elde etmek için 500 μL&#39;de 2 μL seyreltin) ve 2.9 μL emetin (stok: 20 μg / mL; 2.9 uL, zaten puromisin içeren aynı çözeltiye) 0.5 mL içeren her kuyuya ilave edildi. </li><li> Puromisin tespit etmek için bir anti-puromisin antikor (1/1000 seyreltme) kullanarak, yukarıda belirtildiği gibi 3.1-3.10 adımlarını tamamlayın. İdeal olarak, kalan kanallarda iki SG işaretçisi kullanın. </li><li> Puromisin sinyalini nicelleştirirken, tüm görüntüleri aynı pozlamayı kullanarak alın. En parlak (çekilmemiş) örneği kullanarak ve doygunluk olmadan mümkün olduğunca parlak bir görüntü alarak bu pozlamayı seçin. NOT: Anti-puromycin floresan sinyalinin yoğunluğuBir amino asit yerine puromisin olduğu için devam eden çeviri, yeni proteine ​​dahil olur ve proteinin erken terminasyonunu zorlar. </li></ol> 6. Görüntü Edinimi ve Analizi <ol><li> Stres Granüllerinin Miktar Tayini <ol><li> SG&#39;leri ölçmek için 40X&#39;lik bir objektif kullanarak örnek başına 100&#39;den fazla hücre toplamı olan 3 - 5 görüntü elde edin. Alternatif olarak, diğer hedefleri kullanarak görüntüler elde edin, ancak&gt; 100 hücre lâtivite için sayılır ve büyütme granülleri net bir şekilde görselleştirmek için yeterince büyük olduğundan emin olun. Bunu lamelini beş kabaca eşit bölgelere bölerek ve her bölgeden rastgele bir alan seçerek yapın ( Şekil 1B ); Işaretçilerin birlikte yerelleştirilmesini değerlendirmek için aynı alanın görüntüleri tüm kanalları içermelidir. </li><li> Tüm görüntüler edinildikten sonra, kanalları birleştirin. Bazı kamera yazılımı bunu otomatik olarak yapar, diğerleri manuel birleştirmeyi gerektirir; Bu ile yapılabilirImageJ tüm görüntüleri açıp ardından [Resim | Renkli | Birleştirme Kanalları]. </li><li> Hoechst&#39;i çekirdek markörü olarak kullanarak, çekirdek sayısını sayarak toplam hücre sayısını elle sayın. Hücre başına ikiden fazla SG içeren hücrelerin sayısını manuel olarak hesaplayın. NOT: Örneğin, G3BP1 (yeşil), eIF4G (kırmızı) ve Hoechst (mavi) görüntüleyen birleştirilen bir üç kanallı görüntü kullanarak mavi kanalı kullanarak çekirdeği (veya hücre sayısını) sayın. Daha sonra, SG pozitif hücreleri hücre başına iki veya daha fazla sarı odak olan hücreler olarak sayın. Granüller, G3BP1&#39;den yeşil olarak, sarı renkte görünür ve eIF4G&#39;den gelen kırmızı, eğer birlikte yerelleştirilmişse sarı görünür. </li><li> 3-5 bağımsız bölgeden gelen verileri birleştirerek SG pozitif olan hücrelerin yüzdesini belirleyin ve hesaplayın: SG pozitif / çekirdek sayısı) * 100 = SG-pozitif hücrelerin yüzdesi </li></ol></li><li> Hat Yerinde Tarama Analiziyle Kolokalizasyonu Değerlendirme - Manuel Yöntem <ol><li> AçıkImageJ. () Adresinden ücretsiz indirebilirsiniz </li><li> ROI yöneticisini açın: [Analiz et | Araçlar | ROI yöneticisi ...]. </li><li> Birleştirilmiş görüntüyü ImageJ&#39;de açın: [File | Açık]. </li><li> ImageJ araç çubuğunda bulunan çizgi aracını kullanarak, SG&#39;den önce ve sonra eklediğinizden emin olarak bir SG&#39;den geçen bir satır ekleyin. ROI yöneticisi penceresinde [Ekle] öğesini tıklatarak bu satırı ROI yöneticisine ekleyin. </li><li> Her işaretçinin granüle lokalizasyonu değerlendirmek için birleştirilmiş görüntüyü ayrı kanallara bölün. [Image | Renkli | Bölünmüş Kanal]; Bu, birleştirilen görüntüyü üç siyah-beyaz görüntü haline bölecektir. </li><li> Siyah-beyaz görüntüde satırın seçili olduğundan emin olun; Çizgi resimde göründüğü takdirde seçilir. Değilse, ROI yöneticisi penceresinde paneldeki çizgiyi tıklayın; ROI yöneticisi penceresinde çizgi mavi renkte vurgulanır ve çizgiyi siyah-beyaz görüntüde görünür hale getirecektir. Hat hala görünmüyorsa, &quot;show all&quot; seçeneğinin ch olduğundan emin olunROI yöneticisinde ecked ve ardından resimdeki satırı tıklayın. </li><li> Satırın yoğunluğunu analiz edin: [Analiz et | Arsa Profili]; Bu, hat boyunca sinyalin yoğunluğunu gösteren &quot;Plot Profile&quot; penceresini ortaya çıkaracaktır. </li><li> &quot;Plot Profile&quot; penceresinde, [Listele] &#39;ye tıklayın; bu, grafikten ham verileri içeren bir pencere açar. Bu penceredeki tüm verileri kopyalayın ve bir elektronik tablo dosyasına yapıştırın. Bunu yapmak için, penceredeki tüm verileri seçin: [Düzenle | Hepsini seç]. Tarihi kopyalayın: [Düzenle | Kopya]. Bir elektronik tablo dosyasını açın ve verileri yapıştırın: [Düzenle | Yapıştırmak]. </li><li> Her bir kanal için 6.2.6 - 6.2.8 adımlarını tamamlayın. Değerlendirilen kanalı takip ettiğinizden emin olun. </li><li> Bir elektronik tabloda, sonuçların bir çizgi grafiği oluşturun. [Control] &#39;e basarak ve her sütunun üstündeki harfi tıklatarak veri içeren sütunları seçin. Ardından, çizgi grafiğini seçin: [Insert | Çizgi grafiği]. </li><li> Bu analizi mult için tekrarlayınÇoklu bağımsız deneyler boyunca granülleri zorlayın. </li></ol></li><li> Hat Tarama Analizi ile Kolokalizasyonu Değerlendirme - ImageJ Plugin <ol><li> RGB profil aracını ImageJ web sitesinden indirin ve yükleyin (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Doğru takıldığında, kırmızı, yeşil ve mavi (RGB) çizgili simgeler araç çubuğunda görünmelidir. </li><li> ImageJ&#39;de görüntüyü ( örn. Tiff, JPG) açın: [File | Açık]. </li><li> ImageJ araç çubuğunda bulunan RGB simgesini tıklayın. </li><li> Bir SG aracılığıyla uzanan ve bitişik bölgeleri dahil etmeyi seçerek bir çizgi eklemek için tıklayın ve sürükleyin; Histogramın bir resmi bir pop-up pencerede görünür. </li><li> Verileri bir resim olarak kaydedin: [File | Farklı Kaydet | TIFF]. Alternatif olarak, verileri yukarıdaki 6.2.8 adımıyla başka bir grafik programında dışa aktarın ve grafiklerden çizin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Yamasaki, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+mRNA+translation+during+stress.">Reprogramming mRNA translation during stress.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).</li><li>Buchan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNP+granules:+Assembly,+function,+and+connections+with+disease.">mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease.</a> RNA Biol. 11 (8), (2014).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+ternary+complex+(eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules.">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li><li>Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+and+cell+signaling:+more+than+just+a+passing+phase?.">Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase?.</a> Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+shuttling+of+TIA-1+accompanies+the+recruitment+of+mRNA+to+mammalian+stress+granules.">Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 151 (6), 1257-1268 (2000).</li><li>Bley, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+are+dispensable+for+mRNA+stabilization+during+cellular+stress.">Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 43 (4), e26 (2015).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G3BP-Caprin1-USP10+complexes+mediate+stress+granule+condensation+and+associate+with+40S+subunits.">G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits.</a> J Cell Biol. 212 (7), 845-860 (2016).</li><li>Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+mammalian+stress+granule+dynamics.">Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics.</a> J Cell Biol. 215 (3), 313-323 (2016).</li><li>Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules,+P-bodies+and+cancer.">Stress granules, P-bodies and cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1849 (7), 861-870 (2015).</li><li>Aulas, A., Van de Velde, ., C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+stress+granule+dynamics+driven+by+TDP-43+and+FUS:+a+link+to+pathological+inclusions+in+ALS?.">Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS?.</a> Front Cell Neurosci. 9, 423 (2015).</li><li>Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulatory+networks+in+immunity.">Post-transcriptional regulatory networks in immunity.</a> Immunol Rev. 253 (1), 253-272 (2013).</li><li>Wolozin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+protein+aggregation+run+amuck:+stress+granules+and+the+genesis+of+neurodegenerative+disease.">Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease.</a> Discov Med. 17 (91), 47-52 (2014).</li><li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+stress+granules+and+P-bodies+during+RNA+virus+infection.">Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (3), 317-331 (2013).</li><li>Somasekharan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YB-1+regulates+stress+granule+formation+and+tumor+progression+by+translationally+activating+G3BP1.">YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1.</a> J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).</li><li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib,+a+multikinase+inhibitor,+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells.">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. , (2015).</li><li>Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules.">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell Int. 10, 12 (2010).</li><li>Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+ubiquitin-proteasome+system+induces+stress+granule+formation.">Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation.</a> Mol Biol Cell. 18 (7), 2603-2618 (2007).</li><li>Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+activates+HIF-1+to+regulate+vascular+radiosensitivity+in+tumors:+role+of+reoxygenation,+free+radicals,+and+stress+granules.">Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules.</a> Cancer Cell. 5 (5), 429-441 (2004).</li><li>Szaflarski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vinca+alkaloid+drugs+promote+stress-induced+translational+repression+and+stress+granule+formation.">Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation.</a> Oncotarget. 7 (21), 30307-30322 (2016).</li><li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1.">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li><li>Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+TIA-1+and+TIAR+link+the+phosphorylation+of+eIF-2+alpha+to+the+assembly+of+mammalian+stress+granules.">RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).</li><li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li><li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).</li><li>Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+method+for+mapping+genes+on+Drosophila+polytene+chromosomes.">Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+characterization+of+stress+granules+in+virus+infected+cells.">Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells.</a> Methods. 90, 57-64 (2015).</li><li>David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emetine+optimally+facilitates+nascent+chain+puromycylation+and+potentiates+the+ribopuromycylation+method+(RPM)+applied+to+inert+cells.">Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells.</a> Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).</li><li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+visualization+and+dynamics+of+newly+synthesized+proteins+in+rat+hippocampal+neurons.">In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons.</a> Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).</li><li>Ruggieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+oscillation+of+translation+and+stress+granule+formation+mark+the+cellular+response+to+virus+infection.">Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).</li><li>Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+contribute+to+alpha-globin+homeostasis+in+differentiating+erythroid+cells.">Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).</li><li>Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+RNAi+screen+links+O-GlcNAc+modification+of+ribosomal+proteins+to+stress+granule+and+processing+body+assembly.">A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly.</a> Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).</li><li>Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+pathways+regulated+by+arsenate+and+arsenite.">Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite.</a> Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).</li><li>Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic+binding+to+proteins.">Arsenic binding to proteins.</a> Chem Rev. 113 (10), 7769-7792 (2013).</li><li>McDonald, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+(TDP-43)+regulates+stress+granule+dynamics+via+differential+regulation+of+G3BP+and+TIA-1.">TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1.</a> Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).</li><li>Aulas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G3BP1+promotes+stress-induced+RNA+granule+interactions+to+preserve+polyadenylated+mRNA.">G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA.</a> J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).</li><li>Martin, S., Tazi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+G3BP+stress+granules+dynamics+in+live+primary+cells.">Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li><li>Wippich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+specificity+kinase+DYRK3+couples+stress+granule+condensation/dissolution+to+mTORC1+signaling.">Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling.</a> Cell. 152 (4), 791-805 (2013).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Birden fazla hastalıkta immünhistolojik çalışmalarla kanıtlandığı üzere, kronik stres, farklı hücre içi odakların oluşumuna yol açar. Örneğin, çoğu nörodejeneratif hastalıklar, çözünmeyen proteinlerin hücre içi agregaları ile karakterizedir. Bu agregalarda SG ile ilişkili proteinlerin bulunması, bu tür odakların SG&#39;ler olduğu sonucuna varmak için temel oluşturur. Yeni stres uyarıları ile tedavi edilen hücrelerde SG belirteç pozitif sitoplazmik odağı gözlendiğinde de benzer bir sonuç çıkarılmıştır. Bu protokol, iyi niyetli SG&#39;leri tanımlamak için basit bir iş akışı sağlar. Her iki kompozisyonun ve dinamizmin karakterizasyonu da dahil olmak üzere, varsayımsal SG&#39;lerin doğrulanması için çeşitli ölçütler karşılanmalıdır. Birincisi, SG&#39;ler, translasyonel olarak durmuş mRNP&#39;ler içeren sitoplazmik odaklardır. Bu nedenle ilk yaklaşım, iki mikroskopi tabanlı teknikler, yani polyA-FISH ve IF kullanarak kompozisyonlarını karakterize etmektir. Balık, görsel olarak güvenilir bir yöntemdir.SG&#39;lerle birlikte yerelleşen mRNA&#39;ları. Stres koşulları altında SG&#39;ye paketlenen poliadenile mRNA&#39;ları tespit etmek için bir oligo (dT) 40 probu kullanılır. Oligo (dT), İşleme Organlarının (PB) temel bileşenleri olan ölüldürülmüş mRNA&#39;ları tespit etmeyeceği için, sitoplazmik odaklarda kuvvetli bir oligo (dT) sinyalinin varlığı, bu odakların ilk tarifidir (tanım için yeterli olmamasına rağmen) SG. İkinci test, bir poli (A) sinyalinin diğer SG işaretleyicileriyle ( ör. G3BP1) birlikte yerelleştirilmesini göstermektir ( Şekil 2A ). Bu, SG belirteç proteinlerine karşı IF yaparak yapılır. EIF3b ve eIF4G, 48S * komplekslerinin bileşenleri olduğu bilinen translasyon başlatma faktörleridir ve SG oluşumu için G3BP1 gereklidir ( Şekil 2B ), SG markörleri eIF3b, eIF4G ve G3BP1 rutin olarak kullanılır. Farklı streslerin SG&#39;lere farklı SG ile ilişkili faktörler getirdiği için birden fazla SG işaretçisinin gerekli olduğunu vurgulamak önemlidir ve bazı stresler cSG oluşumu için yanıltabilecek bir protein toplayın. İkincisi, SG&#39;ler çeviri engellemesi nedeniyle oluşur. Translasyon inhibisyonu farklı yaklaşımlarla tespit edilebilirken ( örn., Geleneksel [ 35 S] Met kase etiketleme ile), işlenmiş hücrelerde devam eden protein translasyonunu tespit ettiği için ribopuromycylation tercih edilir. Bu teknik, SG işaretlerine karşı standart immünofloresans ile de uyumludur ve böylece SG&#39;lerin eşzamanlı olarak izlenmesine ve tek tek hücrelerdeki translasyon inhibisyon derecesine izin verir. Şekil 3&#39;te görüldüğü gibi, SA ve VRB, SG oluşumunu farklı dereceye yükseltmektedir. SA, yaklaşık% 100 hücrede SG&#39;ye neden olurken, VRB hücrelerin yaklaşık% 75&#39;inde SG oluşumunu teşvik eder. SG&#39;leri geliştirme kabiliyeti, çeviri engelleme derecesi ile korele: işlemden geçirilmemiş hücreler yüksek bir bazal çeviri seviyesine sahipken SA, çeviriyi tamamen engeller, ancak yalnızca VRB&#39;yi inhibe ederRtially translasyonu engeller ( Şekil 3 ). Üçüncüsü, SG&#39;ler dinamiktir ve polisomları tercüme etmekle dengelidirler. Stres öncesinde veya stresle eşzamanlı olarak sikloheksimid ile hücrelerin tedavisi, polisomun sökülmesini ve SG oluşumunu önler. SG&#39;ler gösteren stresli hücreler, üretken olarak başlatıldıklarında mRNA&#39;ları polisomlar ya da monosomlar halinde yakalayarak SG ayrışmasını sağlamak için sikloheksimid ile muamele edilebileceğinden, SG-polisome dengesi iki yönlüdür. Önemli bir kontrol, prematüre terminasyonu teşvik ederek uzamayı engelleyen puromisin kullanmaktır, böylece SG oluşumu için mevcut olan polisomal olmayan mRNP&#39;lerin miktarını arttırır. SA veya VRB tedavisi CHX veya puro tedavisi ile birleştirildiğinde SG&#39;lerde dramatik değişiklikler gözlenir ( Şekil 4 ). Böylece, varsayılan SG&#39;lerin sikloheksim tedavisi sonrasında çözülüp çözülmediğini değerlendirmek ancak puromisin ile güçlendirilmiş veya etkilenmemek değerlendirilmek SG tanımında kullanmak için önemli deneysel bir parametredirkatyon. Çok küçük, yapışık olmayan, birincil insan kemik iliği CD34 + hücrelerinde emetine dayalı SG ayrıştırması, sitospinleme öncesi süspansiyon hücrelerinin tedavisi ile başarılı bir şekilde gösterildi 32 . Sodyum arsenit, eIF2-α fosforilasyonu 33 indükleyerek SG&#39;leri tetiklemek için yaygın bir şekilde kullanılmaktadır, ancak bir çok proteini hedef aldığı ve 34 , 35 numaralı sinyal yollarını aktive ettiği için özenle titre edilmelidir. Farklı hücre soyları, sodyum arsenite karşı çeşitli derecelerde duyarlılık sergiler. U2OS nispeten hassastır (100 μM), COS7, MEFs ve HeLa ise 200 μM gerektirir. DU-145 6 , primer normal insan kemik iliği CD34 + hücreleri 32 , insan limfoblastları 36 , fare korteks nöronları 37 ve Huh7 hücreleri 31 , 500-1,000 μM&#39;yi gerektirir. <p clAss = &quot;jove_content&quot;&gt; SG&#39;lerin sınıflandırması ağırlıklı olarak mikroskopi tabanlı bir metodur, tarafsız ve kaliteli görüntüler elde etmek önemlidir. Yüksek veya düşük sayıda SG bulunduran bölgelerin seçilmesi bulguları çarpıtabildiğinden, tarafsız bir şekilde görüntü almak önemlidir. Diğer hususlar arasında, her bir kanaldaki görüntülerin aynı pozlamayı kullanarak çekilmesi; Bu, lamelleri arasındaki yoğunluğun herhangi bir değişikliğinin, o işaretleyicideki değişikliklerin göstergesi olmasını sağlayacaktır. Buna ek olarak, tüm görüntüleri doygun olmayan yoğunluk düzeylerinde kullanın, böylece yoğunluk tüm deney boyunca değerlendirilebilir. Ampul yoğunluğundaki değişiklikler gün içeriyken mikroskoplar arasında değişebileceğinden, aynı mikroskop / kamerayı kullanarak aynı gün tüm görüntüleri elde edin. Son olarak, slaytları görüntülemeye yarayan mikroskopun filtrelerini ve ayarlarını kontrol etmek önemlidir. Bu protokol, UV, yeşil, kırmızı ve uzak kırmızı kanalların görselleştirilmesini sağlayan filtre setleri ile bir mikroskop için ayarlanmıştır. Düzenlemeler olabilirFarklı mikroskoplar için gereklidir. Burada açıklanan deneysel iş akışı, farklı hücrelerdeki SG&#39;lerin ve farklı stres altındaki hücrelerin tespit edilmesine izin verir. Bu iş akışının en büyük avantajı, basit olması ve iyi niyetli SG&#39;lerin açıkça tespit edilmesine ve stresle muamele edilen hücrelerdeki hücresel translasyonun aynı anda problanması için olanak sağlamasıdır. Bu protokol U2OS hücrelerini kullanır, ancak farklı hücre hatları için veya birincil hücreler için bile değiştirilebilir. Stres granül çalışmaları için kullanılan yeni ve kapsamlı bir liste 11 gözden geçirin. Hücrelerin sayısı, ilaç tedavisi gününde% 80 konfluansa ulaşmak için ayarlanmalıdır. İlaç tedavisinin konsantrasyonu ve süresi, hücreler farklı tepki verdiği için de ayarlanmalıdır. Ayrıca, bu protokol 24 kuyucuklu bir format için hazırlandıysa da, lamine lamellerin (herhangi bir boyutta) kaplama ve ilaç tedavisi sırasında yatay olabileceği herhangi bir boyut plakasına veya çanağa ayarlanabilir.nt. SG / PB belirteçlerini istikrarlı bir şekilde ifade eden hücre hatları, yüksek verimli, siRNA tabanlı ekranlarda 33 ve canlı hücre görüntüleme 38&#39;te kullanılmıştır. Görüntü bazlı tarama, SG birleşimini 39 engelleyen kimyasal bileşikleri tespit etmek için endojen SG işaretleyici PABP için boyanan HeLa hücreleri kullanılarak gerçekleştirildi. Bu iş akışının gelecekteki çalışmalar ve uygulamalarda yararlı olacağı beklenmektedir.

Hücreler, strese tepki vermek için birçok mekanizma kullanmaktadır. Bazı tepkiler, transkripsiyon sonrası seviyede gerçekleşir ve mRNA translasyonunu ve / veya stabilitesini düzenleyen 1 , 2&#39;yi içerir . Stres modüle mRNA translasyonel durma ve bozulma, en sık karakterize Stress Granules (SGs) 3 , özel nonmembranöz hücresel odakların oluşumu ile ilişkilidir. SG&#39;ler, strese tepki veren translasyonel olarak tutuklanmış hücrelere ( örneğin, oksidasyon, ısı şoku, besin açlığı ve viral enfeksiyon) translasyon yapmayan mRNA&#39;ları konsantre eden sitoplazmik odaklardır 4 . Sıralanmamış mRNA&#39;lara ek olarak, SG&#39;ler translasyon başlatma faktörleri, RNA-bağlayıcı proteinler ve çeşitli sinyal proteinleri içerir 5 . SG&#39;ler, inhibe edilmiş protein translasyonu ve değiştirilmiş RNA metabolizmasının biyolojik belirteçleridir ve hücre sağkalımı ve apoptoz, sinyal yolağı ile ilişkilendirilmiştirS ve nükleer süreçler 5 . SG&#39;ler dinamik varlıklardır ve oluşumu hücresel çeviri durumu ile sıkı sıkıya bağlıdır 6 . Görünüşte sağlam görünmelerine rağmen, çoğu SG proteini bileşeni saniyede bir kalış süresi ile hızlı bir şekilde içeri ve dışarı götürülür. SG&#39;ler dakikalar ila saatler sürmesine rağmen, bileşenlerinin çoğu hızlı akış halindedir. Çeviri başlangıcının engellenmesi ve bunun sonucunda translasyon polisomlarının çözülmesi SG&#39;lerin oluşumunu teşvik eder; Dolayısıyla, SG&#39;ler polisomları tercüme etmekle dengelidir. Bu polisome / SG dengesi, iyi niyetli SG&#39;leri diğer stres kaynaklı odaklardan ayıran anahtartır 6 , 7 . Çevirinin başlatılmasının durdurulması, mRNA, çeviri başlatma faktörleri (eIF) ve 40S ribozomal altbirimleri (ler) i içeren, çeviri-yetkili ön başlatma komplekslerinin dönüşümünü gerektirir<html> O-ismi 48S kompleksleri), SG&#39;ler 4 , 6&#39;ya kaynaşabilen translasyonel olarak durmuş komplekslere (48S * kompleksleri) dönüştürür. SG&#39;ler, 48S kompleks oluşumunun akış aşağısındaki iki farklı adımda translasyonel durma ile desteklenir: kapak bağlayıcı eIF4F kompleksinin işlevleriyle ( örneğin eIF4A altbirimini hedef alan) müdahale veya translasyon başlatma faktörü eIF2&#39;nin α altbiriminin fosforilasyonu, bunların biri tarafından aracılık edilir Veya dört eIF2 kinazın daha fazlasını içerir. Stabil 48S komplekslerinin ( yani, 40S ribozomal altbirimler ve seçilen translasyon başlatma faktörleri) varlığı SG 8 , 9&#39;un bir işaretidir. SG&#39;ler viral enfeksiyonlar, nörodejenerasyon, otoimmünite ve kanser gibi çeşitli patolojik durumlarla bağlantılı olmuştur 3 , 10 , 11 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 . Birkaç SG bileşeninin mutasyona uğramış formları , nöronların nöronal ölümde etkin rol oynayabilen hücre içi patolojik kapanımları sergilediği nörodejeneratif hastalıklarla ( örn. Amiyotropik lateral skleroz) ilişkilidir 13 . Bazı virüsler, SG oluşumunu engellemek ve viral replikasyonu artırmak için SG bileşenlerini kaçırır 14 . Son çalışmalar aynı zamanda SG&#39;leri kansere 15 ve kanserli hücre sağkalımına kemo- ve radyoterapi tedavileri 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 bağlar. Bu bulgular SG biyolojisine büyük ilgiyi uyandırırken, yayınlanan raporların birçoğu, iyi niyetli SG&#39;lerin oluşumunu diğer stres kaynaklı odaklardan ayırmak için önemli kontrollerden yoksundur. SG&#39;ler başlangıçta, T-hücresi ntra-hücresel antijen 1 (TIA-1) ve Poli-A-bağlayıcı Protein (PABP) de dahil olmak üzere seçilen mRNA-bağlayıcı Proteinler (RBP&#39;ler) oluşan doku dışı sitoplazmik odak olarak tanımlandı; Çeviri başlatma faktörleri; Poliadenile mRNA; Ve küçük ribozomal altbirimler 4 , 6 , 21 , 22 . Geleneksel olarak, bileşimleri immün boyama ve floresan etiketli proteinlerin ektopik ekspresyonu 23 , 24 gibi tekniklerle belirlenmiştir. Son derece dinamik doğalarından dolayı, SG proteinleri ve / veya mRNA&#39;ların immüno-yerelleştirilmesi , SG&#39;leri 23 , 24 tespit etmek için tanımlayıcı metodoloji olmaya devam etmektedir. Bugüne kadar, birçok RBP ve diğer proteinler (120&#39;den fazla farklı protein) SG bileşenleri 11 olarak tanımlanmaktadır. Birçok SG lokalize proteinler, hem strese bağlı hem de bağımsız bir şekilde lokalizasyonlarını değiştirir ve diğer hücre içi bölmelerde ve odaklarda birikebilir, doğru SG belirteçlerini seçmek ve SG&#39;leri diğer stres kaynaklı streslerden ayırmak için işlevsel kriterleri kullanmak önemlidir odak. İyi niyetli SG&#39;ler mRNA, çeviri başlatma faktörleri ve küçük ribozomal altbirimleri içerir ve translasyonla dinamik denge içindedir. Bu basit iş akışı, stres kaynaklı odakların iyi niyetli SG&#39;ler olup olmadığını belirlemek için tasarlanmıştır. Bu iş akışı, SG&#39;leri incelemek için yaygın olarak kullanılan hücreler olan U2OS hücrelerini kullanan birkaç deneysel yaklaşımı içerir. Bu hücreler, büyük bir sitoplazmaya sahip oldukları için nispeten düz oldukları için idealdirler ve cam lamellerine kuvvetle bağlanırlar. SG&#39;leri incelemek için başka hücre türleri de kullanılabilir, ancak zamanlama, ilaç konsantrasyonu ve SG-çekirdeklenme proteinlerinin bolluğu arasındaki farklılıkların kinetiği ve bileşimi değiştirebileceğinin farkında olmak önemlidirsition. Ek olarak, bazı hücreler, bazı SG markerlerinin noktasal lokalizasyonuna neden olan kabarık bir görünüm veren hücre yüzeyindeki blebleri oluşturarak paraformaldehit fiksasyonuna tepki verir; Dikkatli bir analiz yapılmaksızın bunlar SG olarak yanlış sınıflandırılabilir. Bu, stres kaynaklı odakların iyi niyetli SG&#39;ler olarak tanımlanması için gerekli tüm ölçütlerin değerlendirilmesinin gerekliliğini vurgulamaktadır. SG 20&#39;yi teşvik eden bir kanser terapisi olan Vinorelbin (VRB) ve sağlam ve iyi karakterize edilmiş bir SG indüktörü olan Sodyum Arsenit (SA) bu protokoldeki deneyler için stres olarak kullanılır. Kanonik SG&#39;ler, sitoplazmik odaklarda kolokalize olan çoklu SG işaretçileri (hem proteinler hem de mRNA&#39;lar) içerir. Bu protokol sırasıyla protein markerlerinin ve poliadenile mRNA 22&#39;nin lokalizasyonunu saptamak için hem immünofloresans hem de floresan yerinde hibridizasyon (FISH) kullanır. Kısaca, dolaylı immünofloresan antikorları ( yani,e. Birincil antikorlar) belirli bir proteine ​​özeldir. Daha sonra, florokromlara bağlanan ikincil antikorlar (genellikle türe özgü) birincil antikoru tanır ve hedef protein lokalizasyonunu ortaya çıkarır. Floresan mikroskopi, hücre içindeki lokalize sinyali saptamak için kullanılır. Farklı türlerde üretilen antikorların kullanılması ve bunları farklı renkte sekonder antikorlar ile bulgulanması, çoklu antikorların kolokalizasyo- nunu saptamayı sağlar ve protein hedeflerinin aynı yerde bulunduğu- nu gösterir 23 . İyi niyetli SG&#39;lerde yerelleştirilmek üzere doğrulanmış belirteçleri seçmek önemlidir. BALIK, belirli bir RNA veya DNA sekansı 25 ile baz çiftleşen etiketli bir prob kullanır. MRNA&#39;yı tespit etmek için, bu protokol, mRNA&#39;nın poliA kuyruğuna melezleşen (veya baz çiftleri) biyotinlenmiş bir oligo (dT) 40 probu kullanır ( yani, poliA FISH). Streptavidin, biyotin için yüksek bir afiniteye sahip olduğu için, biyotinlenmiş prob, flüoresanla konjüge edilmiş streptavidin kullanılarak tespit edilir. SG&#39;leri değerlendirirken, iyi niyetli SG&#39;lerde olduğu gibi poliA FISH ile bir immünofloresansın bir SG işaretleyicisi tespit etmesi önemlidir, iki sinyal de aynı yerde bulunur. Bu protokolü kullanarak, kolokalizasyonu birden fazla yolla değerlendirilir. Çok kanallı ( yani RGB: kırmızı, yeşil ve mavi) görüntüde, kolokalizasyon, örtüşen sinyalin rengini değiştirecektir ( örn., Birleştirilmiş kırmızı ve yeşil sarı görünür) 23 . Ek olarak, kolokalizasyon, çizgi tarama analizi kullanılarak grafiksel olarak nicelenir ve burada her bir renk yoğunluğu verilen bir çizgi 8 , 20&#39;de ölçülür. Bu protokol, ImageJ 26 kullanan iki satır tarama analiz yöntemlerini tanımlamaktadır. Bir prosedür elle yapılmış ve tüm süreç boyunca devam etmektedir.Le, diğeri makroyu veya manuel adımları otomatikleştiren basit bir programı kullanır. Makro prosedürü anlamak için manuel programı incelemek önemlidir. SG&#39;ler, translasyonun bastırıldığı hücrelerde oluşur; Bu nedenle, SG&#39;li hücreler, tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla azalmış küresel translasyon seviyeleri göstermelidir. Deneysel olarak ribopuromisilasyon kullanılır. Puromisin, fiksasyondan önce kısa bir süre boyunca hücrelere eklenir ve puromisin aktif olarak şekillenen polipeptidlere dahil olur ve böylece sonlanma 27 , 28 olur . Yeniden başlatmayı önlemek için emetine uygulanması gerekir 29 . Puromisin daha sonra anti-puromisin antikoru kullanılarak tespit edilebilmekte ve aktif translasyonun anlık görüntüsü verilmektedir. Bu yöntem hızlı olduğu için, belirli bir amino asitten yoksun (ve potansiyel olarak hücreleri ön gerilimine sokan) bir besiyeri ile öncesi aç bırakmayı gerektirmeyen veProtein translasyonunun subselüler lokalizasyonu. SG&#39;leri içeren hücrelerin komşu hücrelere 31 kıyasla çok daha düşük translasyon sergilediğini göstermek için &quot;tıklama-it&quot; kimyası 30 ile birleştirilmiş metionin analog L-azidohomoalain (AHA) gibi tadil edilmiş amino asit analoglarını kullanan diğer yöntemler kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu teknik metionin açlığın- dan sonra 15-30 dakika süreyle nabız etiketlemesi gerektirir. Metilin açlığı ilave bir stres oluştururken, uzun etiketleme zamanı ( yani 15-30 dakika), devam etmekte olan tercümenin kümülatif olarak ölçülmesine ve aynı zamanda yeni sentezlenmiş proteinlerin sentez alanlarından son hedeflerine hücre. Buna karşılık, ribopuromisilasyon çok daha hızlıdır ve glikoz açlığı ile SG&#39;leri indüklemek için kullanılan glikozsuz ortam gibi herhangi bir ortamla uyumludur. Kanonik SG&#39;ler dinamik dengedeAktif olarak polisomları çevirirken. Bu deneysel olarak polisomları stabilize eden veya bozucu ilaçlarla örneklerle tedavi ederek değerlendirilebilir, böylece SG&#39;ler ile polisomlar arasındaki dengeyi de yükseltir 23 . Sikloheksimid (veya benzer şekilde davranan emetin) ribozomları mRNA üzerine &quot;dondurarak&quot; uzamayı engeller, böylece SG&#39;leri oluşturabilen mevcut polisomal olmayan mRNP&#39;lerin havuzunu düşürür. Deneysel olarak, bu iki şekilde kullanılabilir: SG oluşumunu önlemek için stres öncesi sikloheksimid (veya emetin) ekleyerek veya SG&#39;ler oluştuktan sonra sikloheksimit (veya emetin) ekleyerek, gerilme maddesini çıkarmadan, SG&#39;nin bozulmasına neden olan durmuş gibi Preinitiasyon kompleksleri yavaş yavaş polisom fraksiyonuna kabul edilir. Buna karşılık, puromisin, prematüre terminasyona neden olur ve polisome ayrışmasını teşvik eder ve SG&#39;lere montaj yapabilen başlatıcı mRNA&#39;ların havuzunu arttırır. Deneysel olarak, puromisin tedavisi, SG sayısını arttırır veya thresholü düşürürD olarak derecelendirilmiş stres veya ilaç dozajına tepki olarak form verdiklerini göstermektedir. Puromisin&#39;in etkisini değerlendirirken, puromisin&#39;in ilacın etkisini arttırması ve SG&#39;leri gösteren hücrelerin yüzdesini arttırması beklendiğinden ilâçın maksimal bir alt seviyesinin kullanılması önemlidir; ilaç görülmezse bu gerçekleşemez / Stres başlangıçta hücrelerin% 100&#39;ünde SG oluşturur. Bu, SG&#39;leri parçalara ayıran ve hücrelerin ~% 95&#39;inde başlangıçta SG&#39;leri görüntülediğinde, mümkün olan en büyük düşüşün gözlenebileceği ve doğru şekilde nicelleştirilebileceği siklooksit tedavisi ile çelişir. Bu protokol memelilerdeki SG&#39;leri incelemek için bir çerçeve sağlar. Yöntemler şunları içerir: (1) varsayılan SG&#39;lerdeki klasik SG ile ilişkili belirteçler eIF4G, eIF3b ve Ras GTPaz aktive edici protein bağlama proteini 1 (G3BP1) arasındaki kolokalizasyonu değerlendirmek için immünofloresan boyama ve ImageJ analizi; (2) oligo (dT) floresan in situ hibridizasyon (polyA FISH) poliadenile mRNA tespit etmek için; (3) stres kaynaklı odakların polisomlarla dinamik denge içerisinde olup olmadığını belirlemek için sikloheksid ve puromisin tedavisi; Ve (4) varsayılan SG&#39;leri içeren hücrelerin translasyonel durumunu değerlendirmek için ribopuromisilasyon. Birlikte, bu tahliller, stres kaynaklı odakların iyi niyetli SG&#39;ler olarak sınıflandırılabileceğini belirleyebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174;HTB-96&#8482;</td>
			<td>- commonly written as &#34;U2OS&#34; 
			- culture at 37 &#176;C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>- abbreviated DMEM 
			- contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red 
			- supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin 
			- prewarm prior drug(s) dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td>- abbreviated FBS 
			- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline streptomycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ml</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tissues</td>
			<td>KIMTECH SCIENCE</td>
			<td>34120</td>
			<td>- commonly called &#34;kimwipes&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td>- autoclaved before used 
			- keep sterile in the tissue culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium (meta)arsenite &#8805;90%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7400-100G</td>
			<td>- commonly called sodium arsenite and abbreviated SA 
			- dissolution in water at 1 M concentration, then dilute to 100 &#181;M as a working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>TSZ CHEM</td>
			<td>RS055</td>
			<td>- abbreviated VRB 
			- dissolve in water to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9620</td>
			<td>- used to assess translation level (ribopuromycylation) 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emetine dihydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2375</td>
			<td>- used in combination with puro to assess general translation level 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4859</td>
			<td>- abbreviated CHX 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Lonza / VWR</td>
			<td>95042-486</td>
			<td>- abbreviated PBS 
			- wash buffer for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>- make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved 
			- aliquots can be stored at - 20 &#176;C for several months 
			- hazardous, use ventilation 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS</td>
			<td>BDH / VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td>- pre-chilled to -20&#176;C before use 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td>- abbreviated NHS 
			- dilute to 5% in PBS 
			- add sodium azide for storage at 4&#176;C 
			- blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC</td>
			<td>Decon Labs / VWR</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>- dilute to 70% with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-81940</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- use at 1/100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti eIF4G antibody (H-300)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-11373</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti eIF3&#951; (N-20) antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-16377</td>
			<td>- eIF3&#951; is also known as eIF3b 
			- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti puromycin 12D10 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE343</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-225-150</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/2500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td>- incubate with secondary antibodies 
			-stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light 
			- Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>016-160-084</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions, then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-(dT)40x probe biotinilated</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>/</td>
			<td>- reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20&#176;C 
			- dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use 
			- custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridation box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>- make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom 
			- prewarm the box prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x SSC buffer</td>
			<td>Thermo fisher Ambion</td>
			<td>AM9763</td>
			<td>- dilute to 2X SSC using RNase Free water (DEPC treated) 
			- store at room temperature 
			- wash buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfectHybPlus Hybridization Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7033-50ml</td>
			<td>- block and probe incubation buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide mounting media</td>
			<td>home made</td>
			<td>/</td>
			<td>- mix 5 g of &#8220;cold-soluble&#8221; poly(vinyl alcohol) in 20 ml of PBS 
			- mix by sonication, followed by stirring overnight at RT 
			- Add 5 ml of glycerol and 0.2 ml of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT 
			- centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet 
			- aliquot viscous liquid, long-term storage at -20&#176;C, 1 week at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>- usually referred as &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-8136-250G</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100ML</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td>- preservative agent for blocking solution and vinol 
			- make a 20 % dilution in water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules

Hücrelere genellikle ani çevresel değişikliklerle meydan okunur. Stres koşullarına maruz kalan hücrelerde oluşan stres granülleri (SG), hücre içi metabolizma ve sağkalımın çeşitli yönleriyle ilişkilendirilir. SG&#39;ler, hücresel sinyal yollarını, transkripsiyon sonrası gen ifadesini ve stres tepki programlarını modüle eder. Bu mRNA içeren granüllerin oluşumu doğrudan hücresel translasyona bağlıdır. SG birleşimi, inhibe edilen translasyon başlatma tarafından tetiklenir ve SG ayrılması, translasyon aktivasyonu veya inhibe edilmiş translasyon uzamayla desteklenir. Bu ilişki SG kompozisyonu ile daha da vurgulanır. Çekirdek SG bileşenleri, başlatma öncesi kompleksler, mRNA ve seçilen RNA bağlayıcı Proteinler (RBP&#39;ler) durdu. SG montajının amacı, translasyonel olarak duran oda temizleme mRNA&#39;larını saptayarak hücresel enerjiyi muhafaza etmek ve strese duyarlı proteinlerin geliştirilmiş translasyonuna izin vermektir. Additi&#39;deDurgun çeviri preinitiation kompleksleri gibi temel bileşenlere, SG&#39;ler diğer proteinlerin ve sinyal moleküllerinin bolluğunu içerir. SG oluşumundaki bozukluklar hücresel stres uyarlamasını bozabilir ve böylece hücre ölümünü hızlandırabilir. SG&#39;ler ve benzeri RNA içeren granüller nörodejeneratif bozukluklar ve kanser dahil bir dizi insan hastalığına bağlıdır ve son zamanlarda RNA granül alt tiplerinin sınıflandırılmasına ve tanımlanmasına ilgi uyandırmaktadır. Bu protokol, memeli SG&#39;leri karakterize etmek ve ölçmek için yapılan tahlilleri açıklamaktadır.

Stres kaynaklı odaklanma alanları mutlaka SG değildir. SG&#39;ler, mRNA&#39;lar, translasyon başlatma faktörleri ve RNA-bağlayıcı proteinleri içeren sitoplazmik odaklar olarak sınıflandırılır ve aktif translasyon ile denge halindedir. Yukarıdaki protokol, belirli bir stresin iyi niyetli SG&#39;ler oluşturup oluşturmadığını karakterize etmek için bir kalıp olarak kullanılabilir. SG&#39;ler, hem proteinleri hem de mRNA&#39;yı içeren bilinen diğer SG işaretleyicileriyle birlikte bulunur. SA ve VRB, G3BP1, eIF4G ve eIF3b&#39;yi içeren sitoplazmik odakları indükler ( Şekil 2A ). Bu belirteçlerin kolokalizasyonu çizgi tarama analizi ve artmış büyütme ile tek kanallı görüntüler kullanılarak doğrulanır ( Şekil 2A ). Buna ek olarak, bu odaklar, polyA FISH tarafından belirtildiği gibi Mrna&#39;yı içerir ve oligo (dT) sinyali, G3BP1 immünofloresans sinyaliyle birlikte bulunur ( Şekil 2B ). PoliA-BALIK&#39;ınSinyal, bilinen bir SG işaretiyle çakışır; çünkü bir stres birden fazla odak odağını teşvik edebilir. SG&#39;ler, translasyonel olarak inhibe edilmiş bir durumda meydana gelir. Hem VRB hem de SA, deneysel olarak ribopuromycylation ile değerlendirildiği gibi translasyonel olarak bastırılmış bir durumu teşvik eder ( Şekil 3 ). İyi niyetli SG&#39;ler, aktif olarak çevrilen polisomlarla dinamik bir denge içinde. SA ve VRB kaynaklı SG&#39;ler, mRNA&#39;larda polisomlar tutan CHX ile çözülür ve böylece polisome ayrışmasını durdurur ve SG&#39;leri önler ( Şekil 4A, 4B ). Diğer yandan, puro, polisome ayrışmasını desteklediğinden, SG oluşumunu destekleyen puro ile tedaviden sonra daha fazla SA ve VRB SG&#39;leri indüklenir ( Şekil 4A, 4C ). Özetle, VRB, pozitif kontrol SA&#39;da olduğu gibi, (1) bilinen SG işaretleyicileriyle birlikte yerelleştirilir, (2) hem protein hem de mRNA&#39;yı içerir ( Figu<html> Re 2), (3), translasyonun bastırıldığı hücrelerde bulunur ( Şekil 3 ) ve (4) aktif translasyonla dinamik denge içindedir ( Şekil 4A-4C ). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55656/55656fig1.jpg" /> Şekil 1: Deneysel Diyagramlar. ( A ) Daha önce 24 delikli bir plakaya yerleştirilen lamellerin üzerine hücreleri tohumlayın, belirtildiği gibi. Belirtildiği gibi μM konsantrasyonunu kullanarak A veya B satırlarını SA veya VRB ile 60 dakika boyunca muamele edin. 60 dakika sonra, ilaç içeren ortama CHX (son konsantrasyon: kolon için 20 μg / mL) veya puro (sütun 4 için 20 μg / mL puromisin) ekleyin. Sabitleme ve boyamadan önce 30 dakika daha kuluçka işlemine devam edin. ( B ) Saymak için görüntülenecek alanları gösteren lamel şeması. Lambalı beş kabaca eşit bölgelere ayrılmıştır; Her bölge bir resim çekilir.&quot;Http://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55656/55656fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55656/55656fig2.jpg" /> Şekil 2: SA ve VRB, SG İşaretleyicilerinin AnPoly (A) mRNA&#39;sını İçeren Sitoplazmik Odakları Başlattı. ( A ) G3BP1 (yeşil), eIF3b (kırmızı) ve eIF4G (mavi) için immüno-lekelenmiş U2OS hücreleri. Hücreler 60 dakika boyunca 100 uM SA veya 150 uM VRB ile tedavi edildi veya tedavi edilmedi (kontrol). Yakınlaştırılmış bölgeler büyütülür (2X) ve siyah beyaz ayrı kanallar olarak gösterilir (aşağıda). Grafik, bir bölgenin (beyaz çizgi) granülün çizgi tarama analizini gösterir ve çakışmanın veya kolokalizasyonun kapsamını gösterir. Ölçek çubuğu 10 μm&#39;yu temsil eder. ( B ) İmmüno boyama ile birleştirilen PolyA-FISH, bir oligo (dT) 40 probu (kırmızı), G3BP1 (yeşil) ile poliA mRNA&#39;yı, anti-G3BP antikoruna dönüştürülür ve çekirdek DNA, Hoechst boyası (mavi) kullanılarak tespit edilir. Yakınlaştırılmış bölgeler (2X), tek kanallı görüntüler ve çizgi tarama analizi, kolokalizasyonu gösterir. Ölçek çubuğu = 10 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55656/55656fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/55656/55656fig3.jpg" /> Şekil 3: SA ve VRB Tedavi Nedeninin Çevirme Baskılaması. Belirtilen tedavilerin ardından 5 dakika boyunca puromisin ile nabız işaretli U2OS hücrelerinin immünofloresansı. Puromisin (yeşil), eIF3b (kırmızı) ve çekirdek DNA Hoechst (mavi) ile lekelenmiştir. Hücreler 60 dakika boyunca 100 uM SA veya 150 uM VRB ile muamele edildi veya tedavi edilmedi (kontrol). Ölçek çubuğu = 10 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55656/55656fig3large.jpg" target="_blank">Daha geniş bir versiyon görmek için lütfen tıklayınız</a>Bu şekildeki iyonu. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/55656/55656fig4.jpg" /> Şekil 4: SA ve VRB, polizomlarla dinamik denge içinde olan sitoplazmik odakları indükler. ( A ) Polisome / SG ilişkisini açıklayan genel şema. ( BC ) U2OS hücreleri, G3BP1 (yeşil), eIF3b (kırmızı) ve Hoechst (mavi) kullanılarak nükleer DNA için boyandı. Hücreler 60 dakika boyunca 100 uM SA veya 150 uM VRB ile muamele edildi veya ( B ) CHX (sikloheksim, 20 ug / mL), ( C ) puro (Puromisin, 10 ug / mL) ) Veya ilave bir 30 dakika inkübasyon için katkı maddesi içermez. Numaralar, temsili bir deneyde SG&#39;li hücrelerin yüzdesine karşılık gelir. Ölçek çubuğu = 25 μm, (BC). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55656/55656fig4large.jpg" target="_blank">Daha büyük görüntülemek için lütfen tıklayınız.</a>Bu şeklin versiyonu.

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules at JoVE.com

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Stres Granülleri (SG), çeşitli streslere maruz kalan hücrelerde oluşan doku dışı yapısal sitoplazmik yapılardır. SG&#39;ler mRNA&#39;lar, RNA-bağlayıcı proteinler, küçük ribozomal altbirimler, translasyona bağlı faktörler ve çeşitli hücre sinyal proteinlerini içerir. Bu protokol, iyi niyetli SG&#39;leri tespit etmek, karakterize etmek ve ölçmek için çeşitli deneysel yaklaşımlar kullanan bir iş akışını tanımlamaktadır.

Sitoplazmik Odakları Memeli Stres Granülleri Olarak Sınıflandırma Yöntemleri

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

methods-to-classify-cytoplasmic-foci-as-mammalian-stress-granules

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K Görüntüleme.  Brigham and Women's Hospital.  Stres Granülleri (SG), çeşitli streslere maruz kalan hücrelerde oluşan doku dışı yapısal sitoplazmik yapılardır. SG'ler mRNA'lar, RNA-bağlayıcı proteinler, küçük ribozomal altbirimler, translasyona bağlı faktörler ve çeşitli hücre sinyal proteinlerini içerir. Bu protokol, iyi niyetli SG'leri tespit etmek, karakterize etmek ve ölçmek için çeşitli deneysel yaklaşımlar kullanan bir iş akışını tanımlamaktadır. 

Video: Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Memeli Hücreleri Trypsinizing ve alt kültüre

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Biyoloji

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Doku Örnekleri γH2AX Foci kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Sitokrom Sitoplazmik Mikroenjeksiyon Apoptoz aktivasyonu C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Tek hücreli Yara Şifa sırasında Sitoplazmik Akışı görselleştirme<em&gt; Stentor coeruleus</em

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

Canlı İlköğretim Hücrelerde G3BP Stres Granül Dinamiği Görselleştirme

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

Sitoplazmik DNA Algılama Pathways uyarılması<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Yöntemler içinde Muscle hücrealtı Kompartmanları DeğerlendirecekÜSKÜP<em&gt; ° C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Ksenopus Translation Düşüklüğü Belirlemek için Bir Model Olarak laevis

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

Sistemik Oksidatif Stresin bir Dolaylı Tedbir olarak Comet Assay

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...