This research was supported by grant from INSERM, University of Lille 1, University of Lille 2, Regional Hospital Center of Lille (CHR de Lille). MCCH acknowledges supports from the Fondation de France and wishes to thank IRCL, Pr. Sonenberg for the gift of the V5-plasmids, Dr. Dissous (Pasteur Institute, Lille) for the gift of anti-GFP antibodies, UMS 3387 (University of Rennes) where Xenopus oocytes are purchased and Dr Taymans (JPArc, Lille) for critical reading of the manuscript text.

<ol>
	<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation.">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).</li><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Lopez-Lastra, M., Rivas, A., Barria, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+in+eukaryotes:+the+growing+biological+relevance+of+cap-independent+translation+initiation.">Protein synthesis in eukaryotes: the growing biological relevance of cap-independent translation initiation.</a> Biol Res. 38 (2-3), 121-146 (2005).</li><li>Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+that+is+neither+m7G-cap-,+nor+IRES-dependent.">A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent.</a> Nucleic Acids Res. 41 (3), 1807-1816 (2013).</li><li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+translation+initiation+in+eukaryotes:+mechanisms+and+biological+targets.">Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets.</a> Cell. 136 (4), 731-745 (2009).</li><li>Van der Knaap, M. S., Leegwater, P. A., K&#246;nst, A. A., Visser, A., Naidu, S., Oudejans, C. B., Schutgens, R. B., Pronk, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+each+of+the+five+subunits+of+translation+initiation+factor+eIF2B+can+cause+leukoencephalopathy+with+vanishing+white+matter.">Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter.</a> Ann Neurol. 51 (2), 264-270 (2002).</li><li>Sen&#233;e, V., Vattem, K. M., Del&#233;pine, M., Rainbow, L. A., Haton, C., Lecoq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolcott-Rallison+Syndrome:+clinical,+genetic,+and+functional+study+of+EIF2AK3+mutations+and+suggestion+of+genetic+heterogeneity.">Wolcott-Rallison Syndrome: clinical, genetic, and functional study of EIF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity.</a> Diabetes. 53 (7), 1876-1883 (2004).</li><li>Chartier-Harlin, M. C., Dachsel, J. C., Vilari&#241;o-G&#252;ell, C., Lincoln, S. J., Lepr&#234;tre, F., Hulihan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+initiator+EIF4G1+mutations+in+familial+Parkinson+disease.">Translation initiator EIF4G1 mutations in familial Parkinson disease.</a> Am J Hum Genet. 89 (3), 398-406 (2011).</li><li>Charlesworth, A., Cox, L. L., MacNicol, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+polyadenylation+Element+(CPE)-+and+CPE-binding+Protein+(CPEB)-independent+mechanisms+regulate+early+class+maternal+mRNA+translational+activation+in+Xenopus+oocytes.">Cytoplasmic polyadenylation Element (CPE)- and CPE-binding Protein (CPEB)-independent mechanisms regulate early class maternal mRNA translational activation in Xenopus oocytes.</a> J Biol Chem. 279 (17), 17650-17659 (2004).</li><li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis.">Oogenesis in Xenopus laevis.</a> J Morphol. 136, 153-180 (1972).</li><li>Rassa, J. C., Wilson, G. M., Brewer, G. A., Parks, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spacing+constraints+on+reinitiation+of+paramyxovirus+transcription:+the+gene+end+U+tract+acts+as+a+spacer+to+separate+gene+end+from+gene+start+sites.">Spacing constraints on reinitiation of paramyxovirus transcription: the gene end U tract acts as a spacer to separate gene end from gene start sites.</a> Virology. 274, 438-449 (2000).</li><li>Lin, W., Wadlington, N. L., Chen, L., Zhuang, X., Brorson, J. R., Kang, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+PINK1+attenuates+HIF-1&#945;+induction+by+preventing+4E-BP1-dependent+switch+in+protein+translation+under+hypoxia.">Loss of PINK1 attenuates HIF-1&#945; induction by preventing 4E-BP1-dependent switch in protein translation under hypoxia.</a> J Neurosci. 34 (8), 3079-3089 (2014).</li><li>Martin, I., Kim, J. W., Lee, B. D., Kang, H. C., Xu, J. C., Jia, H. 2., Stankowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+protein+s15+phosphorylation+mediates+LRRK2+neurodegeneration+in+Parkinson's+disease.">Ribosomal protein s15 phosphorylation mediates LRRK2 neurodegeneration in Parkinson's disease.</a> Cell. 57 (2), 472-485 (2014).</li><li>Cohen, S., Au, S., Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes.">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li><li>Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+DNA+damage+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> J Vis Exp. (69), e4449 (2012).</li><li>Keiper, B. D., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+recruitment+of+Xenopus+maternal+mRNAs+in+response+to+poly(A)+elongation+requires+initiation+factor+eIF4G-1.">Translational recruitment of Xenopus maternal mRNAs in response to poly(A) elongation requires initiation factor eIF4G-1.</a> Dev Biol. 206 (1), 1-14 (1999).</li><li>Wakiyama, M., Imataka, H., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+eIF4G+with+poly(A)-binding+protein+stimulates+translation+and+is+critical+for+Xenopus.oocyte+maturation.">Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus.oocyte maturation.</a> Curr Biol. 10 (18), 1147-1150 (2000).</li><li>Sheets, M. D., Wu, M., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyadenylation+of+c-mos+mRNA+as+a+control+point+in+Xenopus+meiotic+maturation.">Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation.</a> Nature. 374 (6522), 511-516 (1995).</li><li>Gebauer, F., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+function+of+Mos:+the+control+switch+of+vertebrate+oocyte+meiosis.">Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis.</a> Bioessays. 19 (1), 23-28 (1997).</li><li>Le Sommer, C., Lerivray, H., Lesimple, M., Hardy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+as+a+model+to+study+alternative+splicing+in+vivo.">Xenopus as a model to study alternative splicing in vivo.</a> Biol Cell. 99 (1), 55-65 (2007).</li><li>Au, S., Cohen, S., Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Xenopus+laevis.oocytes+as+a+system+for+studying+nuclear+transport+of+viruses.">Microinjection of Xenopus laevis.oocytes as a system for studying nuclear transport of viruses.</a> Methods. 51 (1), 114-120 (2010).</li><li>Gotoh, T., Villa, L. M., Capelluto, D. G., Finkielstein, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+pathways+coordinating+cell+cycle+progression+in+early+Xenopus+development.">Regulatory pathways coordinating cell cycle progression in early Xenopus development.</a> Results Probl Cell Differ. 53, 171-199 (2011).</li><li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUnSET,+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis.">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nat Methods. 6 (4), 275-277 (2009).</li><li>Moreno, J. A., Halliday, M., Molloy, C., Radford, H., Verity, N., Axten, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+treatment+targeting+the+unfolded+protein+response+prevents+neurodegeneration+and+clinical+disease+in+prion-infected+mice.">Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice.</a> Sci Transl Med. 5 (206), 206ra138 (2013).</li><li>Doyle, K. M., Kennedy, D., Gorman, A. M., Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unfolded+proteins+and+endoplasmic+reticulum+stress+in+neurodegenerative+disorders.">Unfolded proteins and endoplasmic reticulum stress in neurodegenerative disorders.</a> J Cell Mol Med. 15 (10), 2025-2039 (2011).</li><li>Gandin, V., Sikstr&#246;m, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> J Vis Exp. (87), e51455 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

תרגום הוא מנגנון המעורב בphysiopathology של הפרעות אנושיות רבות, כולל כמה מחלות ניווניות. למשל במחלת פרקינסון כמה דיווחים הציעו ירידת הערך בתרגום הקשורים מוטציות תורשתיות 8,12,13. כמה דגמים סלולריים זמינים ללמוד תרגום. כאן, על מנת ללמוד את ההשלכות של התרגום של מוטציה בeIF4G1 שפועלת מוטציה שלילית דומיננטית כמו הפחתת האינטראקציה בין שותפי eIF4G1 וeIF4E 8, Xenopus laevis ביצית משמשת. מודל זה יש את היתרונות של פשטות שכן הוא מורכב מתא ענק אחד בלבד להקל microinjection של mRNA הסינתטי, שהוביל לכמות ניכרת של חומר לניסויים ביוכימיים והקלת תצפיות מקרוסקופית של השלבים השונים של הבשלת ביצית. תהליך זה הוא גם זמן יעיל בהשוואה לתאים יציביםדור קו. יתר על כן, כמה פרוטוקולים של microinjections הכנת הביצית ו- RNA כבר תוארו בפרט ללימוד מחזור תא או תחבורת nucleocytoplasmic 14,15. לגבי גבולות פרוטוקולים כגון ללמוד תרגום, יש לקחת תשומת לב מיוחדת בנוגע לריכוז של mRNA. ריכוז זה לא צריך להיות ל( גבוה מ -30 ננוגרם לא ב -120 מרבי NL) גבוהים כדי שלא להרוות את תהליך התרגום. אם ניקח בחשבון את האלמנט הזה, ביצית Xenopus היא מודל אטרקטיבי ללמוד תרגום חלבון כפי שמעיד הנתונים המוצגים באיור 2 עם טופס מוטציה של תמליל EIF4G1. ואכן, בנוכחות eIF4G1 המוטציה, ירידת ערך בתרגום חלבון mos של נצפתה ומתואם עם ירידה של 90% מGVBD לעומת WT ולשלוט תנאים. לעומת זאת, ביטוי יתר של eIF4G1-WT לא לגרום לשינוי ברמת oתרגום Mos F בהסכם עם 16,17 נתונים ספרות. כמה שינויים ביולוגיים עשויים להסביר את התוצאות הללו. בידיעה שMOS mRNA הוא ממוצא אימהי וכבר עיבד לפני הפעלת מיוזה ידי PG, המנגנונים מוטרדים צריכים להתרחש בין צעדי השעתוק ותרגום. תרגום ראוי לציון, Mos הוא התוצאה של שרשרת אירועים מולקולריים שמתחילים מmRNA סמוי ללא פולי זנב () לתוספת של הזנב לאחר גירוי PG לתרגומה 18,19. לפיכך, מספר תרחישים אפשריים כולל: מומים בייזום תרגום עשויים להיות חשודים כגורם לכישלון הזה, או פגמים של זירחון של הגורם המוביל לMOS polyadenylation mRNA, או ברירת מחדל של polyadenylation mRNA של תמלילי mos על ידי עצמו יכול להוביל ל ירידת translational. כדי להעריך 2 מנגנונים אלה האחרונים, הביטוי של גורמים אלה על ידי WB נבחן. הגעהרמות היון של אורורה פוספורילציה / Eg2, אחראים לזירחון CPEB לא הראו הפרעה בנוכחות eIF4G1 המוטציה. באותה הרוח, Mos polyadenylation mRNA או polyadenylation mRNA האחר הוא ציין בנוכחות eIF4G1 המוטציה לאחר גירוי PG (איור 2F). כדי לאשר נוסף פרופיל polyadenylation ניסויי כתם צפון יהיו מומלצים, כמו גם ביצוע בידוד שיפוע סוכרוז של polysomes כדי לקבוע אם הגיוס של mRNA להריבוזום יכול להתרחש 16. אז, על ידי לימוד היסודות הראשונים והאחרונים של המפל, השלב מוטרד נחשד להיות במורד הזרם של המופע של polyadenylation. כמו כן, חשוב לבדוק אם פגם ביטוי Mos נתן את ההשפעה הצפויה על זירחון של ERK2. בנוכחות של המוטציה, ירידה בשיעור של ביטוי Mos הביא לירידה של רמת ERK2 פוספורילציה וכתוצאה מכך לפגם בהתקדמות GVBD (איור 1 ו2E). לפיכך, המוטציה eIF4G1 קשורה לירידה צפויה של תרגום Mos. המחיקה של תחום מחייב eIF4E ברצף eIF4G1 בeiF4G1-DN היא כנראה אחראית לירידה באינטראקציות eIF4G1 / eIF4E כפי שהוצע בעבר על ידי מחקר שיתוף immunoprecipitation 8 שעלולים להפריע להיווצרות המורכבת eIF4F. יש פרוטוקול זה כמה יישומים מעניינים בביולוגיה תאית. הגדרה זו היא אידיאלית כחקירות ראשוניות למספר שאלות בסיסיות בביולוגיה תאית כגון: כדי להבין טוב יותר את התפקיד של תחומים ספציפיים של גורמי ייזום ולהגדיר אותם כי הם חיוניים לתרגום in vivo או ביצית הבשלה. בהקשר זה, Wakiyama et al. (2000) הראה את החשיבות בהבשלת ביצית באזור אמינו מסוף של eIF4G1 מכיל תחומים מחייבים לeIF4E וPABP 17; ללמוד splicING חניכה גורמי 20; לפענח את המנגנונים המשמשים על ידי וירוסי חטיפת מכונות תרגום מארח למטרותיהם באמצעות מחשוף eIF4G1 למשל עם עיכוב של מבני כובע תלוי תרגום וIRES של mRNA שלהם, המתורגם באופן כובע-עצמאי 21; כדי ללמוד את התפקיד של מוטציה בגורמי תרגום על מחזור תא מאז ביציות הן מודלים של בחירה למחקר כזה 22; כדי לחקור את המנגנונים העיקריים המסדירים ייזום כלומר תרגום, כובע תלוי וכובע-עצמאי להגדיר אם מערכות אחד או כמה הם מעורבים בהפרעת סינתזת חלבון. כמה וריאציות של הפרוטוקול הנוכחי בקלות יכולות להיות מיושמות להגיע מטרות אלה, ובכלל זה קביעת יעילות התרגום על ידי microinjection mRNA method23 או כתב השקיעה. לדוגמא, השימוש בmRNA כתב bicistronic מכיל cistron ראשון שבי Renilla לוציפראז יהיה מתורגם כובע תלויבעוד cistron השני מכיל לוציפראז גחלילית יתורגם באמצעות IRES מבנים צריכים לאפשר להגדיר את המצב של חניכה לשים קדימה פגמים ו / או פיצויים בסדר לשמור על הומאוסטזיס תרגום. בנוסף, ניסויי RNA הכתב בלוציפראז כגון מציעים את היתרון שלא להסתמך על מנגנוני התפתחות מקצועיים משיבוש פוטנציאלי בשל מנגנוני שימור שלמים עם אדם. במקביל לשאלות יסוד אלה, פרוטוקול כזה יכול להיות מיושם כצעד ראשון לטיפול בתנאים מזיקים שיכול לתרום להפרעות נוירולוגיות. בתנאים פיסיולוגיים, צעדי חניכת תרגום הם המטרות המועדפת של תקנות בתנאים הדגישו כגון חמצון, היפוקסיה, שינוי טמפרטורה, קרינה וקיפוח תזונתי. בתנאים כאלה, תרגום סלקטיבית של תמלילי קידוד חלבונים שחיוניים נגד לחצים והישרדות תא מתרחשת.כאשר תהליך זה הוא המום, הלחצים הפכו פתולוגיים ולהשתתף באופן פעיל בפיתוח של כמה חיבת נוירולוגיות. גורמי לחץ סלולריים מעורבים במחלות ניווניות רבות כגון אלצהיימר ופרקינסון, מחלת ניוון או מחלה הפריון (קרויצפלד-יעקב) 24 ולחצים אלה גורמים להפעלה של תגובת מצב פרישת חלבון (UPR). אחד ממנגנוני UPR אלה מוביל לתרגום ירד באמצעות הפעלת &quot;הערכה&quot; וזירחון של מקטע eIF2α עם ההשלכות של עצירת תרגום על ידי מניעה מחייבת בין eIF4F ו43s קומפלקסי 25. בביציות Xenopus, התוספת של סוכני חמצוני ו / או גנים שעברו מוטציה ידועה כקשורה לפתולוגיות כזה לחקות הלחצים הללו ולקבוע אם גנים שעברו מוטציה יכולים להשפיע על תהליכי התרגום. במחלת פרקינסון למשל, את ההקדמה של p.R1205H eIF4G1 בXenopשלנו ביצית קשורה או לא לחמצוני לחץ או ניתוח הגנום של פרופילי polysomal mRNA יכול להתייחס לשאלת מעורבות התרגום בphysiopathology 26. כל יישומים אלה פנו לביצית וכך מייצגים שדה גדול של אפשרויות ללמוד הפרעות תרגום שכעת ידועים כקשורות לכמה חיבה כוללים הפרעות ניווניות.

חלבונים הם מרכיבים חיוניים של חיים סלולריים ובכך בקנה מידה גדולה יותר של האורגניזם. הם להבטיח רוב הפונקציות סלולריות כוללים מבנה, תחבורה, קטליזה תגובה, רגולציה, ביטוי גנים וכו &#39;הביטוי שלהם הוא התוצאה של מנגנון מורכב של תרגום המאפשר המרה של mRNA לחלבון. התרגום הוא נתון לבקרה שונות להסתגל ולהסדיר ביטוי גנים על פי צרכי התא, במהלך התפתחות והתמיינות, הזדקנות, לחצים פיסיולוגיים או פתולוגי גילויים. תרגום מחולק ל 3 שלבים (ייזום, התארכות וסיום) ומתנות 3 מערכות תרגום ייזום כדי לענות על צרכי אלה: כובע תלוי, כובע-עצמאי באמצעות מגזר הפנימי הריבוזום כניסה (IRES) מבנים וכובע-עצמאי משפרי תרגום ( CITE). רוב mRNA אוקריוטים מתורגמים בכובע-depeאופן ndent באמצעות כובע 5&#39;-טריפוספט 7-methylguanosine המשמש כתכונת זיהוי במהלך סינתזת חלבון. כובע זה נקשר לeIF4E, רכיב של מורכב eIF4F עם eIF4G1 וeIF4A. קשור עם שותפים אחרים כמו פולי () חלבון מחייב (PABP), eIF2-GTP-Met-tRNA Met, גורמי חניכת תרגום אלה מאפשרים לcircularize mRNA ולשפר את הנגישות שלה לצורות מורכבות 43s עד ייזום אוגוסט קודון הכרת 1. אירוע זה מתאים לסוף כלומר ייזום תרגום, הצעד הראשון של תרגום. תרגום Cap-עצמאי משמש קידוד mRNA לחלבונים חיוניים בתנאים הדגישו כי לגרום להתפשטות תאים למשל ואפופטוזיס. מנגנון זה כולל מבנים משניים בmRNA 5&#39;- אזור מתורגם (UTR) נקרא IRES, סוף carboxy מסוף של eIF4G1 הקשורים eIF4A והמורכב 43s. כריכה של זה 43s מראש הייזום גomplex לIRES יוזם את התרגום העצמאי הכובע ללא הצורך בגורם eIF4E 2,3. לבסוף, מנגנון תרגום אחר עדיין לא הבין היטב תומך בפעילות תרגום כובע-העצמאי הזה, לפי תנאים הדגישו באמצעות CITE מבנים הנמצאים בתוך ה- mRNA 4 UTR. דרך אלה מצבים השונים של התרגום השונה על ידי צעדי החניכה שלהם, תרגום משחק תפקיד קריטי בהומאוסטזיס סלולארי וכל שינוי באחד מהתהליכים אלה ובכך ישפיעו האורגניזם עם קטן לתופעות בקנה מידה גדולות. ואכן, החניכה היא צעד שיעור הגבלת שלטון תהליכי התרגום הנכון של mRNA לחלבונים ולכן היעד של מספר רב של בקרות ונקודות תקנה 5. בין אם מדובר באפשרות השנייה או לרכיבים של תהליכים אלה, אם אחד הופך להיות פגומים, זה יהיה לטרוד את האיזון שנקבע בתא ובכך עלול להוביל לקונדי פתולוגייםמשא. בהקשר זה, מוטציות בגורמי תרגום היו מעורבות במספר הפרעות, כולל הפרעות ניווניות כגון `leukoencephalopathy עם ההיעלמות לבנה matter&#39; (מקטע eIF2B1-5) 6, בתסמונת וולקוט-Rallison (קידוד EIF2AK3 גן ל&quot;הערכה&quot;) 7, שעלול להיות ב המחלה (p.R1205H eIF4G1) פרקינסון 8. לכן חשוב לבצע מחקרים תאיים ומולקולריים של חלבוני מוטציה אלה כדי להגדיל את הידע שלנו על התפתחות מחלה ועל התהליך הכללי של חניכת תרגום. כדי לבצע את המחקרים הללו, זה חיוני כדי לבחור את הדגמים המתאימים ביותר לקיים את ההשלכות של מוטציות אלה Xenopus laevis ביציות מותאמות במיוחד גם בשל המאפיינים הפיסיולוגיים וביוכימיים שלהם:. סינכרוניות הפיזיולוגית (חסום בG2 שלב של מחזור התא) , קיבולת גבוהה של סינתזת חלבון (200-400 ng / יום / ביצית), מספר גבוה של OOC חולץytes מאותה חיה (800-1,000 ביציות / נקבה) וגודל תא (1.2-1.4 מ&quot;מ קוטר) המאפשר המניפולציה שלהם. Microinjection של ביציות Xenopus עם mRNA מסונתז בקלות ניתן לבצע כדי לנתח את הפעולות תרגום. בתצוגה זו מציג יתרונות אחרים. בהתחשב במהירות של התקדמות מיוזה ותרגום לאחר microinjection mRNA (~ שעה 24), ביצית Xenopus מייצגת מערכת מהירה בהשוואה למערכות מחדש סלולריות (שחולצו מE.coli, חיידקי חיטה או reticulocyte ארנב ...) שבו mRNA הוא מתורגם עם שיעור מופחת ותרגום במהירות נמוכה יותר. אז, את ההשפעות של מוטציה הציגה בmRNA תהיה במהירות לצפייה ולמד בקלות בכמה ביציות. יתרון נוסף של ביציות Xenopus הוא שmRNAs האימהי הוא סמוי ותרגום חלבון חסום לפני גירוי פרוגסטרון. תוספת של פרוגסטרון היא אפוא אמצעי טוב של השליטה האינדוקציה התרגום. p cytoplasmicolyadenylation אינו מתרחש במהלך oogenesis. זה מתחיל בהבשלת ביצית בביציות מגורה פרוגסטרון בצו זמני וממשיך לאורך התפתחות מוקדמת ויכול לשמש כדי לחקור את השלבים השונים של תרגום. Polyadenylation של Mos mRNA הוא בין הראשונים שמתרחשים והוא שייך עם אורורה / Eg2, היסטון-כמו B4 mRNA לכיתה של גנים &quot;התבגרות המוקדמת&quot; כהגדרתו בCharlesworth et al. (2004) 9. האינדוקציה translational של mRNA &quot;מאוחר&quot; כגון Cyclin A1 וCyclin B1 מתרחשת בערך בזמן של התמוטטות נבטי שלפוחית ​​(GVBD). Mos mRNA מקודד קינאז סרין / תראונין חלבון. התרגום שלה הוא קריטי שכן הוא גורם למפל קינאז מפה שבעקיפין מפעיל את הבשלת הביצית. ואכן, בתגובה לפרוגסטרון, polyadenylation של Mos mRNA מוגבר באמצעות תהליך הכרוך אורורה / Eg2 חלבונים רגולטוריים וחלבוני RNA מחייב אחרים עם ההדואר 3&#39;UTR של Mos mRNA. polyadenylation המוגבר של Mos mRNA מוביל לעלייה של רמת חלבון mos, אשר בתורו מפעילה MEK1. תהליך זה מתווך את ההפעלה של קינאז מוסדר האיתות תאי 2 (ERK2) (איור 1). מפל איתות זה יכול לגרום לאז M-שלב התבגרות קידום גורמים, מורכב נוצר על ידי קינאז Cyclin B וCdc2, וסופו של דבר גורם לחידוש meiotic. לכן בXenopus laevis ביציות, יכול לשמש בקלות המחקר של mRNA האימהי כגון Mos לבדוק translatability עם כמה נקודות קצה מpolyadenylation היעילה שלהם לתרגום של כמה Mos איתות רכיבים, הכולל גם את קביעת שיעור GVBD. מערכת זו היא מעניינת ולכן כדי להעריך את ההשלכות הראשונות של מוטציות בגורמי חניכת תרגום ללא התערבות של mRNA עיבד חדש או של יעילות transfection, בעיות לעתים קרובות מתרחשות עם eukaryמחקרי תא otic. כאן, פרוטוקול הוקם בי mRNAs eIF4G1 מוטצית microinjected בXenopus laevis ביציות ובתרגום של mRNA האימהי נבדק. בנוכחות של פגם בהתקדמות GVBD, Mos polyadenylation mRNA שהוא חיוני להתקדמות דרך מחזור תא ביצית meiotic ולתרגום הבא של mRNAs כיתה המוקדם והמאוחר הוא הוברר. זירחון אורורה / Eg2 וERK הוא גם למד כדי לאשר את התוצאה של deregulation.Thus mos, ביציות Xenopus מייצגות דרך פשוטה כדי לנתח את הפעולות שונות של תרגום mRNA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tricaine methane sulphonate</td>
			<td>Sandoz</td>
			<td>MS-222</td>
			<td rowspan="8">oocytes handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Moria</td>
			<td>Dumont MC40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin/penicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>781</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9128</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracyclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7660</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veterinarian absorbable Vicryl thread</td>
			<td>Johnson&#38;Johson Intl</td>
			<td>JV1205</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche diagnostics</td>
			<td>10103586001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PmeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0560S</td>
			<td rowspan="14">Preparation of synthetic mRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse/RNAse free H2O</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10977</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6268</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>02854</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano Drop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE 10X</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0032006.507</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide 10 mg/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15585-011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE&#174; Kit</td>
			<td>Ambion by Life Technologies</td>
			<td>AM1344</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>03609</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16500-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04003.1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>47671</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc Imager</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte Pipet with 100 8&#34; Glass Capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-510-X</td>
			<td rowspan="4">microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Glass 8&#34;</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-210-G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,45 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHA025NB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td rowspan="32">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3294</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4612</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8511</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1153</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6506</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium vanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli buffer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0737</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0323BOX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>456-1036 and -1096</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horizontal semi-dry blotting system</td>
			<td>W.E.P. Compagny</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0718</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0719</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond ECL Membrane</td>
			<td>Amersham Life Science</td>
			<td>10401180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20846-292</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau Red (0,5%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3504</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-V5</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-58052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Eg2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-27884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Eg2-P</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>C39D8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ERK2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-1647</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ERK2-P (Tyr204)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7976</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rsk</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-231</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mos</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-86</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2812</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2378</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced ECL Detection System</td>
			<td>Amershan Life Science</td>
			<td>RPN2135</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417</td>
			<td rowspan="11">polyadenylation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31998-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>278475-1L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTL buffer&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free DNAse set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 1&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0204S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High capacity c-DNA Reverse Transcription kit</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4368813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymerase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10342020</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

xenopus laevis as a model to identify translation impairment

סינתזת חלבון היא תהליך בסיסי לביטוי גנים המשפיעים על תהליכים ביולוגיים מגוונים בעיקר הסתגלות לתנאי סביבה. צעד הייזום, הכולל הרכבה של תת-יחידות ריבוזומלי בmRNA קודון החניכה, הגורם מעורב ייזום כולל eIF4G1. פגמים בשלב זה שיעור הגבלה של תרגום צמודים להפרעות שונות. כדי לחקור את ההשלכות הפוטנציאליות של deregulations כזה, Xenopus laevis ביציות מהוות מודל אטרקטיבי עם מעלות גבוהות של שימור של מנגנונים תאיים ומולקולריים חיוניים עם אדם. בנוסף, במהלך התבגרות meiotic, ביציות תעתיק מודחקות וכל החלבונים הדרושים מתורגמים מקיימים מראש mRNAs, נגזר אימהי. מודל זה מאפשר זול mRNA אקסוגניים להשתלב בצורה מושלמת עם תרגום יעיל. כאן מתואר פרוטוקול להערכת תרגום עם גורם עניין (כאן eIF4G1) באמצעות storאד mRNA האימהי שהם ראשון להיות polyadenylated ותורגם במהלך הבשלת ביצית כקריאת נתונים פיזיולוגית. בתחילה, ה- mRNA synthetized ידי שעתוק במבחנה של פלסמידים של עניין (כאן eIF4G1) מוזרקים בביציות וקינטיקה של הבשלת ביצית על ידי זיהוי התפלגות רמינל שלפוחיות נקבע. יעד mRNA האימהי למד הוא סרין / Mos תראונין חלבון-קינאז. polyadenylation והתרגום הבא שלה נחקרים יחד עם הביטוי וזירחון של חלבונים של Mos מפל איתות מעורב בהבשלת ביצית. וריאציות של הפרוטוקול הנוכחי לשים קדימה פגמי translational גם הציעו להדגיש תחולתה הכללית. לאור ראיות שמתעוררות סינתזת חלבון חריגה עשויה להיות מעורבת בפתוגנזה של הפרעות נוירולוגיות, מודל כזה מספק את ההזדמנות כדי להעריך בקלות ירידת ערך זו ולזהות מטרות חדשות.

התבגרות הקינטית של ביציות Xenopus ונחישות של GVBD ביצית אחוז לאחר 24 שעות של גירוי PG (2B דמויות, 2C): על מנת ללמוד את ההשלכות של התרגום של המוטציה eIF4G1-DN, התגובה לPG ב Xenopus laevis ביציות microinjected עם קרנה eIF4G1-DN הוא בהשוואה לeIF4G1-WT ולתנאי שליטה אחרים (H 2 O, GFP). הפקדים לאפשר להעריך את השכיחות של microinjection ביצית ללא קשר לאופי של קרנה הזריקו או של ביטוי יתר eIF4G1. Maturations הקינטית של 10 ביציות מאופיינות בתנאי בקרת microinjected (H 2 O וGFP) דומה לWT ומספר עובר GVBD קרוב מאוד זה לזה בגיל 12 ו -24 שעות לאחר גירוי PG (איור 2). לאחר 24 שעות, הבשלה של ביציות מגיעה 95.7% לWT, 97.1% לH 2 O ו97.5% לGFP (אלחוטית<html> איור 2 ג). לפיכך, יש לי microinjections עם H 2 O או שליטת cRNAs או cRNAs eIF4G1 השפעה מועטת על שחרור מיוזה הביצית. לעומת 8 שעות לאחר גירוי PG, מספר ביציות microinjected עם cRNAs eIF4G1-DN עובר GVBD מתעכב לעומת eIF4G1-WT cRNAs (איור 2) שחרור .the מיוזה של eIF4G1-DN לעומת ביציות eIF4G1-WT מקטין באופן משמעותי על ידי 85.8% ו 77.4% בשעה 12 ו -24 שעות לאחר גירוי PG בהתאמה (איור 2 ג). זה גם ראוי לציין כי 13 שעות לאחר גירוי PG, מספר הביציות בשלות מגיעים לכל היותר לכל התנאים למעט eIF4G1-DN שמרבי מושגת רק 20 שעות לאחר גירוי PG. לכן, הנוכחות של המוטציה eIF4G1-DN מובילה לשחרור מיוזה עני ביצית לעומת eIF4G1-WT. שיקום של הבשלת ביצית בנוכחות הודות eIF4G1-DN לeIF4G1-WT (איור 2 ד): _content &quot;&gt; כדי לקבוע אם פוגע eIF4G1-DN קרנה microinjection או חוסם את הבשלת הביצית, יחסים שונים של eIF4G1-WT וeIF4G1-DN cRNAs הם microinjected השותף. בתנאים אלה, גידול של ביצית הבשלה הוא ציין כרמות של eIF4G1-WT קרנה לגייס ואלה של התבגרות eIF4G1-DN קרנה decrease.While הוא ציין ב17.5% מביציות עם מנה אחת של cRNAs eIF4G1-DN, אחוז זה מגיע 76.7% עם שיתוף microinjection של 3 מנות של eIF4G1-WT cRNAs ו הנוכחות של מנה אחת של eIF4G1-WT cRNAs מובילה 95% של הבשלת ביצית. ניסוי זה מראה כי פגם ההבשלה של ביציות Xenopus microinjected עם eIF4G1-DN הוא לא בלתי הפיך וניתן לשחזר באופן חלקי. mos ביטוי חלבוני איתות נצפו על WB כמדד ליכולת תרגום לפני ואחרי גירוי PG (איור 2E): רמת החלבון של V5-תג בביציות להביע eIF4G1-WT וeIF4G1-DN דומה המשקף את יעילות microinjection דומה. רמת חלבון RSK משמש כשליטה טעינת חלבון היא גם דומה בכל התנאים לפני ואחרי גירוי PG. הביטוי של חלבון ה- GFP נוכח גם בביציות microinjected עם GFP קרנה מגורה או לא עם PG. נתונים אלה מצביעים על כך שmicroinjection וביטוי היתר של eF4G1 לא להפריע התרגום של ה- GFP. עם זאת, אין ביטוי חלבון ה- GFP הוא זיהוי לפני ואחרי גירוי PG בביציות המבטאות את eIF4G1-DN. כצפוי, הביטוי לא Mos אנדוגני הוא להבחין בהיעדר גירוי PG. בנוסף, Mos ביטוי הוא ציין בeIF4G1-WT ו -2 O תנאי שליטה לאחר גירוי PG בהסכם עם תוצאות קודמות שהראו ביטוי יתר של eIF4G1-WT יש H השלכות קצת על Mos אנדוגני 16. לעומת זאת, ירידה ניכרת של ביטוי Mos בולטת לאחר גירוי PG. המקצועןביטוי החלבון של חלק מרכיבים של Mos מפל איתות גם נבדק. לדוגמא, אורורה / חלבון Eg2 פועל במעלה הזרם לMOS אינדוקציה ולא זיהוי של הסרת הפיקוח החלבון שלה או של צורת phosphorylated המושרית לאחר גירוי PG הוא ציין. לעומת זאת, דה-רגולציה של זירחון ERK2 הנגרם על ידי mos הוא ציין בנוכחות eIF4G1-DN. תוצאות אלו הציעו שהביטוי אנדוגני של RNA mos לחלבון וMos הפעלת ERK2 תלויה מושפע מהביטוי של eIF4G1-DN. mRNA polyadenylation (איור 2F): Polyadenylation של כמה mRNAs (mos, Cyclin A1, B1 ו- B4 Cyclin כמו היסטון-) ההכרחי לXenopus ביציות התאוששות מיוזה נבדקה. Assay מבוצע מאפשר להגדיר אם עלייה בגודל amplimer המקביל לאורכו של זנב פולי () של mRNA קיימת לאחר גירוי PG. ואכן, עם Pגירוי G התוספת של פולי זנב () הוא ציין בכל התנאים, כולל המוטציה eIF4G1-DN. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52724/52724fig1.jpg" /> איור 1. סקירה סכמטי של הפעלת מפל MAPK. על הגירוי הורמונלי על ידי שינויים מהירים PG בפעילות של כמה אנזימים להתרחש כוללים אלה של אורורה / Eg2 ומסלול CPEB. Hyperphosphorylation של אורורה / Eg2 מוביל לCPEB זרחון (cytoplasmic polyadenylation אלמנט כריכת חלבון). CPEB phosphorylated מכיר CPE (polyadenylation cytoplasmic אלמנט) ב3&#39;UTR של Mos mRNA, מגייס CPSF (מחשוף וpolyadenylation ספציפי פקטור) ומפעיל polyadenylation mRNA על ידי PAP (פולי () פולימראז). גירוי PG גם מקדם ברציפות זירחון Maskin באמצעות שתי הפעולה של PKA וcdk1, Maskin / ניתוק eIF4E ועמותת eIF4E / eIF4G1. eIF4G1 מגייס טראנסשותפי ייזום ויסות כולל PABP שאינטראקציה עם eIF4G1 ומזהה את פולי זנב (). ברגע שמסונתז, Mos מפעיל MEK / MAPKK ידי זרחון, אשר בתורו, מפעיל ERK2 / MAPK ידי זרחון. מפל MAPK מה שנקרא זה מעורב בתהליכי meiotic ידי שליטה קינטית M-שלב כניסה, המורפוגנזה ציר ועיכוב של סינתזת DNA. המפל מוטבע בהיזון חוזרת לולאה חיובית שמקיימת סינתזת חלבון. אחת יש לציין כי MOS הוא לא רק החלבון ביקש להיות מסונתזים להפעלת GVBD; כלומר, Cyclin B נדרש להיות מתורגם להישג התבגרות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52724/52724fig2.jpg" /> 2. מוטציה eIF4G1-DN איור משפיעה הבשלת ביצית ותרגום בlaevis Xenopus. RNA נגזר מפלסמידים קידוד חלבוני eIF4G1 מתויג V5 (WT וDN) הםmicroinjected בXenopus laevis ביציות. לאחר 15 שעות, הבשלה של ביציות היא מגורה על ידי פרוגסטרון (PG) (ניסויים בוצעו לפחות 3 פעמים ותוצאות נציג מוצגות). () Schematicoverview של פרוטוקול ניסוי. הזריקות של eIF4G1 ו / או cRNAs GFP מיוצגות על ידי חץ-ראשים לפני גירוי PG. דוגמאות לניתוחי RNA וחלבונים התקבלו ב -2 נקודות זמן (גירוי PG ובסוף הקינטית GVBD). התבגרות קינטי (B) של 10 ביציות מאופיינות GVBD נבדקה במהלך 24 שעות לאחר גירוי PG. עיכוב בהבשלת ביצית הוא ציין בביציות microinjected עם eIF4G1-DN cRNAs בהשוואה לאלו עם microinjected eIF4G1-WT cRNAs אחוז (C) של ביציות בשלות 24 שעות לאחר גירוי PG (n = 4; * p &lt;0.05).. ירידה בהבשלת ביצית הוא ציין באלו microinjected עם eIF4G1-DN cRNAs לעומת eIF4G1-WT cRNAs. (ד) Reversioהערכת פנוטיפ n של ביציות microinjected עם cRNAs eIF4G1-DN המוטציה וcRNAs eIF4G1-WT מראה כי מכונות התרגום עדיין פונקציונליות כאשר eIF4G1-WT מתווסף למוטציה. חלבונים (E) מופקים מביציות ורמותיהם נקבעו על ידי immunoblotting ניתוח . הפרעות של זירחון ERK2, mos וביטוי של GFP בתנאי eIF4G1-DN הם נצפו. (F) polyadenylation של mos, Cyclin A1, B1 mRNAs B4 וכמו היסטון-Cyclin מביציות מגורה או לא עם PG נצפתה לאחר ההגברה PCR והגירה ב 3% agarose ג&#39;ל. לאחר גירוי PG, עלייה בגודל&gt; 100 polyadenylation מזוהה לכל התנאים. הנתיב הראשון תואם את הסולם.

Watch this Scientific Journal Video about Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment at JoVE.com

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis כמודל לזיהוי תרגום ירידת ערך

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

xenopus-laevis-as-a-model-to-identify-translation-impairment

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

10.7K Views.  INSERM UMR-S1172, CHRU Lille, University of Lille 1 and Lille 2. Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Video: Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

פלסטיק הטבעת ואת חתך של עוברים Xenopus laevis

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

קבלת ביצים Xenopus laevis נקבות

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

הכנה ההיפוך חלוקה של Xenopus laevis ביצה תמציות

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

רקמות קביעת שווי שימוש בבעלי חיים להשתלות (ACT) Assay ב Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

הפקה של טראנסגנטי Xenopus laevis על ידי שילוב אנזימים מתווכת הגבלת והשתלות גרעיני

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

ייצור של<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; ביצה מחלץ לזהות RNAs microtubule הקשורים

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

השתלת פנים ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברים

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

באמצעות plusTipTracker תוכנה כדי למדוד microtubule Dynamics ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; קונוסים צמיחה

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...