המחברים מכירים במימון של DFG (EXC-1003 ל- MG).

1. תרבות התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות HeLa או תאים COS ב Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) המכיל 4.5 גרם / L גלוקוז D, L-alanine-L- גלוטמין dypptide, pyruvate, 10% בסרום שור עוברית, ו 10 יחידות / מ&quot;ל ​​של פניצילין / סטרפטומיצין. תרבות נוירונים בתרבות התקשורת ללא L- גלוטמין, חומצה גלוטמית או חומצה אספרטית, בתוספת 0.5 מ&quot;מ L-alanine-L- גלוטמין dipeptide, נטול תוסף נוירונים חינם ו -10 יחידות / מ&quot;ל ​​של פניצילין / סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 40% confluency הוא הגיע, transfect תאים עם בונה של בחירה באמצעות מגיב transfection לפי הוראות היצרן. שמור תאים transfected בחממה ב 37 ° C ו 5% CO 2 עבור 15-18 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפחית את השינויים pH ו osmolarity (עקב אידוי) במהלך רכישת התמונה, למלא את תא התרבות תאים (לפני הדמיה) עד 90% עם 37 ° C מראש חימם בינוני המכיל 20 מ&quot;מ -4 (2-hydroxyethyl) -1 -Ppiperethethanesulfonic חומצה (HEPES). לאטוםהמכסה, להחיל שכבה דקה של שומן ואקום על החלק הפנימי של המכסה בעדינות לחץ על החדר התרבות המכיל את התאים transfected. </li></ol> 2. רכישת תמונה הערה: אורך filopodia משתנה מ 2-10 מיקרומטר 13 . Filopodia לגדול במהירות ממוצעת של 0.05-0.1 מיקרומטר / ים 13 , 14 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ עם מטרה 60X או 100X ולא binning פיקסל (כאן, מיקרוסקופ דיסק מסתובב confocal). השתמש בשיעורי רכישה גבוהים מ 1 הרץ (הרץ) כדי לעקוב אחר הדינמיקה filopodial. כדי למזער out-of- להתמקד חפצים, filopodia התמונה קרוב לממברנה הבסיסית ( כלומר משטח המצע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח מעקב חלקה, להתאים את זמן החשיפה של המצלמה ועוצמת לייזר כך יחס אות לרעש (SNR) גדול יותר מאשר 4. הימנע הרוויה של ערוצים בודדים ( כלומר פיקסל ערכים של255 עבור תמונות 8 סיביות ו 65,535 עבור 16 סיביות תמונות), כמו זה ימנע ניתוח התמונה הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע דימום, רק להשתמש בתגיות הקרינה תואם קווי לייזר מסננים של המיקרוסקופ (לפרטים ראה התייחסות 15 ). </li></ol> 3. עיבוד תמונה מראש הערה: השתמש בתוכנת ImageJ או בתוכנה זמינה אחרת כדי לעבד מראש תמונות 16 , 17 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המדגם נע, נכון להיסחף לרוחב באמצעות תוכנה זמינה ( למשל https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ) לפני הניתוח. לא לכלול סרטים עם סחף צירית (כלומר תנועה בכיוון z). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקע נכון ( כלומר, ערכים אפורים של אזורים מחוץ לתא), הלבנה ( כלומר הפסד מתמשך אם עוצמת הקרינה עקב פגיעה בחלבונים הקרינה) ו-שוקת דימום אפשרי ( כלומר האות משפעת אחתאו בדיקה של שני ערוצים) באמצעות תוכנה זמינה ( למשל http://imagej.net/Category:Plugins ו 16 , 17 ). הערה: עוצמות הקרינה של ערוצים בודדים אינם משתנים על ידי התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח את ניתוח התמונה הבאים, לשמור סרטים המתאימים ערוצי חלבון מסוים בקנה מידה אפור כמו &quot;.tiff&quot; בפורמט קובץ מוערמים בתיקייה עבודה. הערה: המידות ( כלומר , גודל, אורך) של ערימות חייב להיות זהה עבור כל הערוצים. </li></ol> 4. ניתוח תמונה - שלב 1: טען תמונות הערה: התוכנה המתוארת כאן נכתבה ב- Matlab (המכונה תוכנת תכנות) ותפעל רק עם תוכנית זו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד את התיקיה zip המכיל את כל הקבצים הדרושים לניתוח תמונות מהאתר הבא: https://campus.uni-muenster.de/en/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softwהם /. לפתוח ולהעתיק קבצים לתוך תיקיית העבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההתקנה, לפתוח את תוכנת התכנות ולהפעיל &#39;filopodiaAnalysisM3.fig&#39;. חלון GUI # 1 יפתח כפי שמוצג באיור 2 א . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הקבצים הנפתחים &quot;tiff&quot; המתאימים לחלבון מסוים של עניין בחלון GUI מס &#39;1 באמצעות הכפתורים &lt;1b&gt; לחלבון A, &lt;1c&gt; לחלבון B, &lt;1d&gt; לחלבון C. ראה איור 2 וטבלה 1 לפרטים. הערה: חלבון מוצג בחלון GUI # 1 משמש כערוץ הפניה לניתוח הסופי של הראיומטריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת תמונה על גבי תא של חלבונים על ידי לחיצה על &lt;1a&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &lt;a&gt; כדי להקצות את המסגרת הראשונה ואת &lt;2b&gt; למסגרת האחרונה המשמשת לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לחתוך את האזור של ריבית (ההחזר על ההשקעה) המכיל את הפילופודיום של עניין באמצעות לחצן &lt;2h&gt;, לסובב את התמונה uלחצן &#39;שירה&#39; &lt;2i&gt; או מחק אזורים לא רצויים באמצעות כלי הציור החינמי &lt;2j&gt;. הערה: כדי לייעל את ניתוח התמונה, מומלץ לבודד את ההחזר על ההשקעה ( כלומר , לחתוך, לסובב, למחוק) יחד עם השלבים מראש אחרים (חיסור רקע, תיקונים אקונומיקה, וכו &#39;) באמצעות ImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזיז את המחוון &lt;2c&gt; עבור כל מסגרת עבור בקרת איכות ולבדוק אם הפילופודיום נשאר גלוי בבירור לאורך כל הסרט. </li></ol> 5. ניתוח תמונה - שלב 2: יצירת מעקב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור &lt;3a&gt; בחלון GUI # 1 כדי לפתוח את חלון GUI # 2 (ראה איור 2 ב ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור &lt;4&gt; בחלון GUI # 2 כדי ליצור את המסכה של גוף התא על גבי (שנוצר בחלון GUI # 1 לאחר לחיצה על &lt;a&gt;&gt;). התוכנית גם יוצרת את הגבול של המסכה, שם הקמור גוף מיושם כדי לקבל את נקודות הקודקוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליCk כפתור &lt;5&gt;; יופיע סמן. השתמש הסמן כדי לבחור את הבסיס (שממנו משם המרחק של קצה פילופודיאלי נמדדת) ואחריו קצה filopodia במסגרת שבו הוא מופיע לראשונה. לשם כך, הזז את המחוון בחלון מס &#39;2). הערה: כדי למזער שגיאות בפלט הנתונים, הנח את נקודת הבסיס אנכית מתחת לעצה הגופנית לאורך הציר. מיצוב נקודת הבסיס במקומות אחרים ( כגון מעבר רוחבי) עשוי להציג הטיה כיוונית בערכי הקרינה בתוך גוף התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את אורך הסף (מעל אשר filopodia יהיה להתכופף) באמצעות &lt;6c&gt;. הערה: אורך זה מוגדר כמרחק בין נקודת הבסיס (נבחר באמצעות &lt;5&gt;) וגבול גוף התא ( כלומר האזור שממנו מתחיל הפילופודיה). המרחק נמדד בפיקסלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציין את מספר המקטעים המשמשים כדי להשוות את הצורה של filopodia בתיבה &lt;6a&gt;. הערה:המספר המרבי של מקטעים תלוי באורך המקסימלי שמגיע על ידי פילופודיום, אבל גם איך פילופודיום מתכופף. אל תבחר מספר מקטעים גדולים ממספר הפיקסלים בין הבסיס לקצה ( כלומר , אורך הסף). בחירת פלחים נוספים מאורך הסף המוגדר בשלב 5.4. ( כלומר מספר פיקסלים בין הבסיס ואת קצה) תביא overestimation של אורך של פילופודיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציין את רוחב הסריקה, הפועל כסורק אופקי למיקום הצמתים, ב &lt;6b&gt;. הערה: צמתים אלה משמשים את התוכנית כדי להתאים את הקו שהצטרף הבסיס ואת קצה עם הגוף של פילופודיום ( כלומר כדי ליצור את עמוד השדרה). כנקודת התחלה, לשים ערך בפיקסלים שווה אורך המרבי מוכפל גורם <img alt="משוואה" src="/files/ftp_upload/55653/55653eq1.jpg" /> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציין את רדיוס הסריקה (בפיקסלים) בתיבה &lt;6d&gt;. השתמש בערך שהוא כ 50% יותר מאשר obשימש בין העקירה עצה בין מסגרת. הערה: שימוש ברדיוס סריקה גדול מאוד עלול לתפוס נקודות גוף קמור לא רצויות במסגרות שבהן אין עצה פילופודיאלית אמיתית ( למשל, מחוץ לתנועת המטוס או ל- SNR נמוך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציין את זווית ההטיה בתיבה &lt;6e&gt;. הערה: סף הזווית נקבע על ידי הזווית המקסימלית של פילופודיום הוא כיפוף במהלך הניתוח כולו. הגדרת סף הזווית מסייעת התוכנה כדי למנוע מעקב של מבנים לא רצויים גדל בצד של filopodia כאשר filopodia מתכופף לעבר הגוף התא. התוכנית פועלת באופן אמין עבור filopodia עם זווית הטיה פחות מ 45 מעלות מן הציר האנכי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל במעקב, לחץ על הלחצן &#39;מעקב וניתוח&#39; בחלון GUI # 2. לחץ על התיבה &#39;היסטוריה עקבות&#39; בחלון GUI # 2 כדי לשמור את פרוטוקול המעקב כולו לעיון בעתיד. הערה: לאחר השלמת הליך המעקב, מאוחסן אורך הפילופודיום בכל מסגרתאת הסדין בשם &#39;length_vel&#39; של &#39;dynamics.xlsx&#39; עבור הפניות בעתיד. כמו כן, כל שאר פרמטרים המעקב מאוחסנים בגיליון בשם &quot;פרמטרים&quot; של &quot;dynamics.xlsx&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, אם filopodia אינו מזוהה באופן אוטומטי בכל המסגרות, בצע את השלבים הבאים כדי לתקן ידנית עבור זה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקר את המסגרת המתאימה באמצעות המחוון בחלון מס &#39;2 ובחר ידנית את קצה הפילופודיום. הערה: מסגרות, כאשר נקודות גוף קמור לא מזוהים יוצגו על ידי אזור כחול בחלון המעקב של חלון GUI # 2. זה חובה לבדוק את &quot;ההיסטוריה עקבות&quot; כפתור לפני תוכנית המעקב היה ביוזמת גישה קואורדינטות קדוטיים באותה מסגרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את נקודות ההתייחסות (בסיס ואחריו טיפ) באמצעות &lt;6f&gt; ב- GUI Window # 2. ציין את הפרמטרים האחרים כגון &#39;אורך הסריקה&#39;, &#39;מדידה מדויקת לאחר&#39; ו&#39;זווית כיפוף מרבית &#39;; עבור מסגרת כפי שמתואר צעדים 5.4-5.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הלחצן &lt;6i&gt; כדי לשמור את הפרמטרים החדשים (ספציפיים למסגרת אחת). יש לחזור על השלבים עבור כל המסגרות המצוינות על ידי האזור הכחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיום, אתחל מחדש את תהליך המעקב באמצעות &lt;7&gt;. הערה: תיקון זה יכול לשמש גם אם התוכנית פתאום עובר מ filopodial אחד למשנהו בתוך סרט. כחלופה, שקול חיתוך סרטים המכילים filopodia מרובים. </li></ol></li></ol> 6. ניתוח תמונה - שלב 3: ניתוח חלבון זמן ספטיו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ניתוח ספציו-טמפורלי, בחר את התיבה המיוצגת על ידי &lt;8b&gt; ולאחר מכן את ערוץ החלבון המעניין (&lt;8c&gt; ו / או &lt;8d&gt; ו / או &lt;8e&gt;). הערה: חובה לבחור פרוטאין לפני ניתוח רטיומטרי (&lt;9a&gt;, &lt;9b&gt; ו / או &lt;9c&gt;) מאחר וחלבון A משמש כנקודת התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &lt;8a&gt;כדי ליזום מעקב חלבון לאורך אורך filopodial באמצעות עקבות שנוצר בשלב 5.9. </li></ol> 7. ניתוח תמונה - שלב 4: יחס חלבון ניתוח מטרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את תיבת הסימון &lt;9b&gt; או &lt;9c&gt; ולחץ על הכפתור &lt;9a&gt; כדי לקבל את החלקה הרטיומטרית הזמנית-ספקטורלית. הערה: כדי למנוע מצג שווא של ריכוז חלבון יחסי, התמונה ratiometric אינו מזויפים כמו X / Y אבל כמו יומן (X / Y). לשימוש עתידי, העלילה ratiometric מיוצא קבצי &quot;. PNG&quot; ו &quot;.fig&quot; פורמט, ונתונים מגרש גולמי מאוחסן בתוך &quot;dynamics.xlsx&quot; הקובץ. </li></ol> 8. ניתוח תמונה - שלב 5: ניתוח עצה פילופודיאלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את תיבת הסימון &lt;8f&gt; וציין את אורך הטיפ ואת אורך הסף מהבסיס באמצעות &lt;8g&gt; ו- &lt;h&gt;. לחץ על הלחצן &lt;push&gt; כדי לשמור את הנתונים לקובץ &#39;dynamics.xlsx&#39;. לחץ על &lt;ניתוח חלבון אינטנסיבות&gt; כדי ליצור אתעקבות של עוצמות חלבון של קצה פילופודיאלי לשמור על ניתוח ratiometric. הערה: אורך העצה קובע את מספר הפיקסלים בקצה המשמש לניתוח. התוכנה תחזיר את הערך הממוצע בעוצמה של פיקסלים בקצה מעל כל מסגרת. אורך הסף קובע את המרחק המינימלי מהבסיס לקצה שמעליה מתחיל הפילופודיום (קצה פילופודיאלי) לגדול (וכאשר התוכנית מתחילה לעקוב אחר עוצמת העוצמה של הטיפ). אז אורך קצה צריך להיות קטן יותר מאשר אורך הסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על היחס הרצוי כדי לנתח באמצעות &lt;9d&gt; או &lt;9e&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור ההשוואה &lt;9a&gt; כדי ליצור את הנתונים ratiometric. </li></ol>

<ol>
	<li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (23), 13438-13443 (1999).</li><li>Matus, A., Brinkhaus, H., Wagner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+in+dendritic+spines:+a+form+of+regulated+plasticity+at+excitatory+synapses.">Actin dynamics in dendritic spines: a form of regulated plasticity at excitatory synapses.</a> Hippocampus. 10 (5), 555-560 (2000).</li><li>Galic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+recruitment+of+the+curvature-sensitive+protein+ArhGAP44+to+nanoscale+membrane+deformations+limits+exploratory+filopodia+initiation+in+neurons.">Dynamic recruitment of the curvature-sensitive protein ArhGAP44 to nanoscale membrane deformations limits exploratory filopodia initiation in neurons.</a> Elife. 3, e03116 (2014).</li><li>Hotulainen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+mechanisms+of+actin+polymerization+and+depolymerization+during+dendritic+spine+morphogenesis.">Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis.</a> J Cell Biol. 185 (2), 323-339 (2009).</li><li>Leijnse, N., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+buckling+of+actin+inside+filopodia+generates+traction.">Helical buckling of actin inside filopodia generates traction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 136-141 (2015).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+a+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+characterization+of+cell+shape+changes+during+amoeboid+motility+by+skeletonization.">Automated characterization of cell shape changes during amoeboid motility by skeletonization.</a> BMC Syst Biol. 4, 33 (2010).</li><li>Styner, M., Gerig, G., Lieberman, J., Jones, D., Weinberger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+shape+analysis+of+neuroanatomical+structures+based+on+medial+models.">Statistical shape analysis of neuroanatomical structures based on medial models.</a> Med Image Anal. 7 (3), 207-220 (2003).</li><li>Blum, H., Wathen-Dunn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transformation+for+extracting+new+descriptors+of+shape.">A transformation for extracting new descriptors of shape.</a> Models for the Perception of Speech and Visual Form: Proceedings of a Symposium. , 362-380 (1967).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration,+protrusions,+and+fluorescence+intensities.">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).</li><li>Machacek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+Rho+GTPase+activities+during+cell+protrusion.">Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion.</a> Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).</li><li>Saha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+filopodial+length+and+spatially+resolved+protein+concentration+via+adaptive+shape+tracking.">Automated analysis of filopodial length and spatially resolved protein concentration via adaptive shape tracking.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3616-3626 (2016).</li><li>Argiro, V., Bunge, M. B., Johnson, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+study+of+growth+cone+filopodial+extension.">A quantitative study of growth cone filopodial extension.</a> J Neurosci Res. 13 (1-2), 149-162 (1985).</li><li>Mogilner, A., Rubinstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+filopodial+protrusion.">The physics of filopodial protrusion.</a> Biophys J. 89 (2), 782-795 (2005).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Courtney, J., Woods, E., Scholz, D., Hall, W. W., Gautier, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MATtrack:+A+MATLAB-Based+Quantitative+Image+Analysis+Platform+for+Investigating+Real-Time+Photo-Converted+Fluorescent+Signals+in+Live+Cells.">MATtrack: A MATLAB-Based Quantitative Image Analysis Platform for Investigating Real-Time Photo-Converted Fluorescent Signals in Live Cells.</a> PLoS One. 10 (10), e0140209 (2015).</li><li>Schell, M. J., Erneux, C., Irvine, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+1,4,5-trisphosphate+3-kinase+A+associates+with+F-actin+and+dendritic+spines+via+its+N+terminus.">Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase A associates with F-actin and dendritic spines via its N terminus.</a> J Biol Chem. 276 (40), 37537-37546 (2001).</li><li>Korobova, F., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+synaptic+actin+cytoskeleton+in+hippocampal+neurons+reveals+a+mechanism+of+dendritic+spine+morphogenesis.">Molecular architecture of synaptic actin cytoskeleton in hippocampal neurons reveals a mechanism of dendritic spine morphogenesis.</a> Mol Biol Cell. 21 (1), 165-176 (2010).</li><li>Cheadle, L., Biederer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+synaptogenic+protein+Farp1+links+postsynaptic+cytoskeletal+dynamics+and+transsynaptic+organization.">The novel synaptogenic protein Farp1 links postsynaptic cytoskeletal dynamics and transsynaptic organization.</a> J Cell Biol. 199 (6), 985-1001 (2012).</li><li>Tarnok, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+tool+for+the+quantitative+analysis+of+dendritic+filopodial+motility.">A new tool for the quantitative analysis of dendritic filopodial motility.</a> Cytometry A. 87 (1), 89-96 (2015).</li><li>Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-dynamics:+automated+quantification+of+dendrite+filopodia+dynamics+in+living+neurons.">F-dynamics: automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons.</a> J Neurosci Methods. 236, 148-156 (2014).</li><li>Fanti, Z., Martinez-Perez, M. E., De-Miguel, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuronGrowth,+a+software+for+automatic+quantification+of+neurite+and+filopodial+dynamics+from+time-lapse+sequences+of+digital+images.">NeuronGrowth, a software for automatic quantification of neurite and filopodial dynamics from time-lapse sequences of digital images.</a> Dev Neurobiol. 71 (10), 870-881 (2011).</li><li>Costantino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+quantification+of+filopodial+dynamics.">Semi-automated quantification of filopodial dynamics.</a> J Neurosci Methods. 171 (1), 165-173 (2008).</li><li>Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloDetect:+automatic+detection+of+filopodia+from+fluorescence+microscopy+images.">FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images.</a> BMC Syst Biol. 7, 66 (2013).</li></ol>

למחברים אין מה לגלות.

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט למעקב דינמיקה הצמיחה filopodial וניתוח של ריכוזי חלבון יחסית מבנים דינמיים אלה באמצעות אלגוריתם קמור האל. באמצעות התוכנה, עד 3 ערוצים ניתן להשוות זוג חכם בריצה אחת, לפיה הריכוזים היחסיים של שני ערוצים ( כלומר חלבונים) נקבע במהלך מחזור הרח...

שליטה ספציו-טמפורלית של חלבונים רגולטוריים אקטין קשורה דינמיקה פילופודיום 1 , 2 . מעקב ריכוז חלבונים בריכוז מרחבי לאורך כל אורך filopodial דרך הזמן ולכן חיוני כדי לקדם את הבנתנו את המנגנונים ביסוד היזום, הארכה, ייצוב או קריסה של מבנים דינמיים אלה 3 , 4 . שלא כמו ניתוח חלבון cytosol, שבו שינויים רבים צורה התא מתרחשים בקנה מידה גדול יותר, filopodia הם מבנים דינמיים מיקרו אשר כל הזמן אבזם 5 וכופף, ובכך מונע ניתוח באמצעות גישה פשוטה כגון קו סריקה. פתרונות תוכנה שונים למעקב אחר הצורה filopodial זמינים 6 , 7 , 8 , 9 . כמו כןIse, תוכנה למעקב ratiometric של הדינמיקה חלבון בתוך הגוף התא פותחה 10 , 11 . כדי לשלב מעקב אוטומטי של הצורה filopodial וניתוח חלבון זמן ספטיו, פיתחנו לאחרונה ניתוח תמונה תוכנה המבוססת על קמור גוף האלגוריתם 12 . שיטת ניתוח חדשנית זו, המופעלת באמצעות ממשק משתמש גרפי (GUI), משלבת לראשונה את ריכוז החלבון היחסי לאורך אורך הגדילה ומהירות הגדילה, ומאפשרת מדידה מדויקת של התפלגות חלבונים מזמניים-טמפורליים ללא תלות בתנועה של אלה מבנים דינמיים 12 . הרעיון מאחורי התוכנה (קוד המקור זמין באופן חופשי, ראה להלן) היא כי אחד הקודקודים של גוף קמור יעלה בקנה אחד עם קצה של פילופודיום ( איור 1 א ). על ידי הסתכלות על מסגרת הבאהR את הקודקוד הקרוב ביותר של גוף קמור, עצה מרגש ניתן לעקוב לאורך כל הסרט. לאחר קצה מזוהה בכל מסגרת, המיקום שלה משמש לצייר ציר על ידי הצטרפות קצה עם נקודת התייחסות בבסיס של פילופודיום ( איור 1 ב ). לבסוף, תוך שימוש בנקודות ראשיות שווה, שתפקידן נקבע על ידי הפיקסל החציוני בעוצמה מקסימלית לאורך הקו האורתוגונלי לציר, משמשות לקביעת עמוד שדרה העוקב אחר הצורה הפילופודיאלית. ניצול של עמוד שדרה זה מסתגל, kymograph מופק כדי לעקוב אחר הצמיחה filopodial ריכוז חלבון עד שלושה ערוצים לאורך אורך filopodial ( איור 1C ). <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig1.jpg" /> איור 1: עקרון העבודה של תוכנת ניתוח תמונה. ( א ) האלגוריתם שמאחוריהתוכנה. ב Step1 המשתמש מציין את הפניה (בסיס) ואת קודקוד (קצה) של פילופודיום. בשלב 2-1 את עמוד השדרה של פילופודיום מתקבל באמצעות פיקסל חציון עם ערך אינטנסיביות מקסימלית. בשלב 3 את עמוד השדרה משמש פרופיל חלבון מרחבי פרופיל. בשלב 2-2 התוכנה עוקבת באופן אוטומטי את קצה במסגרת הבאה. כל התהליך חוזר. ( ב ) תצלום של אלגוריתם עם פילופודיום אמיתי מציגה אלמנטים חשובים כגון גוף קמורה כי הוא משמש למעקב. ( ג ) סקירה של פרמטרים שניתן למדוד עם האלגוריתם. נתון זה שונה מהתייחסות 12 . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55653/55653fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> תוכנת ניתוח התמונה מופעלת ב Matlab (המכונה תוכנה תכנות) באמצעות שימוש גרפיממשק. כדי למקסם את הגמישות והחוסן להגדרה הניסויית, המשתמש יכול להתאים סדרה של פרמטרים למעקב ( למשל זווית כיפוף מותרת ותנועה בין-מסגרתית) וכן לבצע כמה תיקונים לסרטים ( למשל חיתוך, סיבוב, הסרת אובייקטים לא רצויים) ( איור 2 א וטבלה 1) . <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> GUI </td><td> לא. </td><td> חובה </td><td colspan="5"> תאור </td><td> שם (ב- GUI) </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1 א </td><td> Y </td><td colspan="5"> טעינת קובץ .tiff מוערמים המייצגים את גוף התא (עם תיבת מסומנת) או ליצור גוף תא superimposed מערוצים </td><td> סלבודי </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1b </td><td> Y </td><td colspan=&quot;5&quot;&gt; טוען קובץ תמונה מוערם המתאים לחלבון 1 </td><td> חלבון 1 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1 ג </td><td> Y </td><td colspan="5"> טעינת קובץ תמונה מוערם המתאים לחלבון 2 </td><td> חלבון 2 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1 ד </td><td> Y </td><td colspan="5"> טעינת קובץ תמונה מוערם המתאים לחלבון 3 </td><td> חלבון 3 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1e </td><td> N </td><td colspan="5"> איפוס הכל לטעינת קובצי תמונות מוערמים מראש </td><td> אִתחוּל </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2 א </td><td> Y </td><td colspan="5"> גלילה בר כדי לקבוע את המסגרת הראשונית לניתוח בחלון GUI # 2 </td><td> NA </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2 ב </td><td> Y </td><td colspan="5"> גלילה בר כדי לקבוע את המסגרת הסופית לניתוח בחלון GUI # 2 </td><td> NA </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2 ג </td><td> Y </td><td colspan="5"> סרגל גלילה המייצגמסגרת nt </td><td> NA </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2 ד </td><td> N </td><td colspan="5"> הערך האפור של הפיקסלים שמתחתיו כל הפיקסלים יוגדרו לאפס </td><td> NA </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2e </td><td> N </td><td colspan="5"> הערך האפור של הפיקסלים שמעליהם כל הפיקסלים יוגדרו לערכים מקסימליים </td><td> NA </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2 ו </td><td> N </td><td colspan="5"> הגדר את ערכי העוצמה של הפיקסלים שצוינו על ידי &lt;2e&gt; &lt;2f&gt; </td><td> מַעֲרֶכֶת </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2 גרם </td><td> N </td><td colspan="5"> הפעל את הסרט מותאם-עוצמה </td><td> לְשַׂחֵק </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2h </td><td> N </td><td colspan="5"> חתוך תמונה </td><td> יְבוּל </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2i </td><td> N </td><td colspan="5"> סובב תמונה </td><td> לְסוֹבֵב </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2 </td><td> N </td><td colspan="5">מחק אזורים בכל הערימה </td><td> מחק אזורים </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 3 א </td><td> Y </td><td colspan="5"> לחץ כדי לפתוח את &#39;חלון ניתוח&#39; (חלון GUI # 2) </td><td> חלון מעקב </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 3 ב </td><td> Y </td><td colspan="5"> הזן את הגודל של פיקסל במיקרונים </td><td> הזן גודל פיקסל </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 4 </td><td> Y </td><td colspan="5"> לחץ כדי ליצור את התמונה גבול / קצה של גוף התא על גבי </td><td> גְבוּל </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 5 </td><td> Y </td><td colspan="5"> לחץ כדי לבחור את הבסיס ואת קצה filopodia </td><td> הפניה </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6 א </td><td> Y </td><td colspan="5"> הזן את מספר הפלחים או הצמתים </td><td> לא של מקטעים </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6 ב </td><td> Y </td><td colspan="5"> הזן את אורך הסריקה (בניצב לציר) </td><td> רוחב סריקה </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6 ג </td><td> Y </td><td colspan="5"> הזן את אורך מעל אשר filopodia מתחיל כיפוף </td><td> דקות מדויקות לאחר </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6 ד </td><td> Y </td><td colspan="5"> הזן את הרדיוס של מעגל איתור קצה (כלומר אזור שבו קודקוד יכול להיות מקומי במסגרת הבאה) </td><td> רדיוס של איתור קצה </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6e </td><td> Y </td><td colspan="5"> הזן את הזווית המקסימלית פילופודיום יכול לכופף מן הציר האנכי </td><td> זווית סף </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6F </td><td> N </td><td colspan="5"> הוסף נקודות התייחסות לבסיס ולעצה עבור מסגרת ספציפית זו </td><td> בחר התייחסות </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6 גרם </td><td> N </td><td colspan="5"> הזן את אורך מעל אשר filopodia מתחיל כיפוף עבור מסגרת מסוימת </td><td> דקות מדויקות לאחר </td></tr><tr><td> # 2 </td> &lt;Td&gt; 6h </td><td> N </td><td colspan="5"> הזן את הרדיוס של מעגל האיתור עבור המסגרת הספציפית הזו </td><td> רדיוס של איתור קצה </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6i </td><td> N </td><td colspan="5"> לאחר הזנת כל הפרמטרים עבור המסגרת הספציפית לחץ כדי לאחסן את הערכים לזיכרון ולקובץ לעיון נוסף </td><td> לְהוֹסִיף </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6 </td><td> N </td><td colspan="5"> לחץ כדי למחוק את הפרמטרים באופן ידני עבור אותה מסגרת </td><td> לִמְחוֹק </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6k </td><td> N </td><td colspan="5"> לחץ כדי למחוק את כל הפרמטרים המאוחסנים ידנית באמצעות &#39;לוח תכונות אופציונלי&#39; עבור כל המסגרות </td><td> אִתחוּל </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6l </td><td> N </td><td colspan="5"> בדוק לפני המעקב כדי לאחסן את כל תוצאות המעקב בזיכרון לצורך הפניה בעתיד </td><td> היסטוריה עקבות </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 7 </td><td> Y </td><td colspan="5"> לחץ כדי להתחיל במעקב </td><td> לעקוב ולנתח </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8 א </td><td> N </td><td colspan="5"> לחץ כדי להתחיל מעקב אחר עוצמת ערוץ חלבון </td><td> ניתוח חלבון אינטנסיבות </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8 ב </td><td> N </td><td colspan="5"> בדוק כדי לעקוב אחר עוצמת ערוץ חלבון לאורך אורך filopodial </td><td> פילופודיה שלמה </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8 ג </td><td> N </td><td colspan="5"> בדוק עבור מעקב אחר חלבון התייחסות או חלבון A </td><td> פרוטאין </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8 ד </td><td> N </td><td colspan="5"> בדוק את המעקב אחר החלבון B </td><td> פרוטיין </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8e </td><td> N </td><td colspan="5"> בדוק את המעקב אחר החלבון C </td><td> ProteinC </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8F </td><td> N </td><td colspan="5"> בדוק כדי לעקוב אחר עוצמת החלבון הממוצע ב thעצה </td><td> קצה מוביל </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8g </td><td> N </td><td colspan="5"> הזן את אורך הקצה </td><td> אורך עצה </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8h </td><td> N </td><td colspan="5"> הזן את המרחק המינימלי מבסיס שמעליה מתחיל הקצה להיווצר </td><td> סף </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8i </td><td> N </td><td colspan="5"> לחץ כדי לשמור את התוצאות המוביל ניתוח קצה לקובץ </td><td> לחץ על הכפתור </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9 א </td><td> N </td><td colspan="5"> לחץ כדי להתחיל ניתוח חלבון ratiometric </td><td> לְהַשְׁווֹת </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9b </td><td> N </td><td colspan="5"> בדוק כדי להשוות בין חלבון B לגבי A </td><td> Log10 (B / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9 ג </td><td> N </td><td colspan="5"> בדוק כדי להשוות חלבון C ביחס A </td><td> Log10 (C / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td> &lt;Td&gt; 9d </td><td> N </td><td colspan="5"> בדוק כדי להשוות חלבון B ביחס A בקצה </td><td> Log10 (B / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9e </td><td> N </td><td colspan="5"> בדוק כדי להשוות חלבון C ביחס A בקצה </td><td> Log10 (C / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10 א </td><td> N </td><td colspan="5"> בחר מפת צבע אחרת (ברירת מחדל: Jetplot) </td><td> מפת צבע </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10 ב </td><td> N </td><td colspan="5"> ערוך את colormap </td><td> עריכת colormap </td></tr></tbody></table> טבלה 1: סקירה כללית של כל הפונקציות המופיעות ב- GUI Windows # 1 ו- # 2. ברגע שזה נעשה, התוכנית יוצרת גוף קמורה באופן אוטומטי מסלולים קצה לאורך הסרט. פרמטרים שחולצו מהסרט, כגון קימוגרפיה רטיומטרית, מהירות גדילה ואורך פילופודיאליRe מוצג גם מאוחסן בתיקיית העבודה כתמונות וכקובצי נתונים. פרמטרים אחרים כגון החיים filopodial, קצב הצמיחה שיעור נסיגה לאחר מכן ניתן לחלץ ונותח נוספת מקבצי הנתונים המאוחסנים ( איור 2 ב ). <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig2.jpg" /> איור 2: ממשק משתמש גרפי לשימוש בתוכנת ניתוח התמונות. ( A ) GUI חלון # 1 משמש לטעינה ועיבוד של תמונות. התוכנית יכולה לטעון עד 3 ערוצי חלבון, לפיה 2 ערוצים מושווים זוג חכם. החלון מגיע עם חובה (כחול) תכונות אופציונלי (ירוק) לעיבוד מראש את התמונות לפני המעקב ( B ) GUI חלון # 2 משמש למעקב אחר פילופודיום, כמו גם ספטיו- temporal ו יחס- metric ניתוח חלבון. שוב, תכונות אופציונליות מסומנות בירוק. נתון זה היה modifiEd מתוך התייחסות 12 . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55653/55653fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להכנת המדגם וטיפול בתוכנה. אנו מתחילים עם הוראות מפורטות על תאים culturing ו רכישת סרטים אופטימיזציה עבור ניתוח התמונה. סעיף זה על רכישת נתונים ואחריו תיאור מפורט להפעלת תוכנת ניתוח התמונה. לאורך הפרוטוקול, אנו מציגים צעדים קריטיים ותכונות אופציונליות שיש לקחת בחשבון בעת ​​איסוף ועיבוד נתונים. לבסוף, אנו מנתחים filopodia ממערכות מודל שונים עם תוכנת ניתוח התמונה, לפני הסגירה עם השוואה של התוכנה המתוארת ניתוח התמונה עם תוכניות אחרות הזמינות לכימות filopodial ודיון על מגבלות והכיוון העתידי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="816">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">DMEM</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">31966-021</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">10% Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:204px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:204px;">L11-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">1% penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:204px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:204px;">12212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Neurobasal Medium</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">B27</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">HEPES (1M stock solution)</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Citrine-N1</td>
			<td style="width:204px;">Addgene</td>
			<td style="width:204px;">54593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Labtech</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Glutamax-I</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Hela</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ</td>
			<td>ACC-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">COS 7</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ</td>
			<td>ACC-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">3T3 cells</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ</td>
			<td>ACC-59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Microscope</td>
			<td>Nicon Eclipse</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU888 Ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Confocal Unit</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a graphical user interface for software-assisted tracking of protein concentration in dynamic cellular protrusions

פילופודיה הן בליטות תאיות דינמיות, דמויי אצבע, הקשורות בהעברה ובתקשורת תאית. על מנת להבין טוב יותר את מנגנוני האיתות המורכבים העומדים בבסיס החניכה הגופנית, הארכה וייצוב או נסיגה שלאחר מכן, חשוב לקבוע את פעילות החלבון הזמני-הטמפורלי במבנים דינמיים אלה. כדי לנתח את תפקוד החלבון ב filopodia, פיתחנו לאחרונה אלגוריתם חצי אוטומטי מעקב שמתאים לשינויים צורה filopodial, ובכך מאפשר ניתוח מקבילי של הדינמיקה בליטה וריכוז חלבון יחסית לאורך כל אורך filopodial. כאן, אנו מציגים מפורט שלב אחר שלב פרוטוקול עבור טיפול התא אופטימיזציה, רכישת התמונה וניתוח תוכנה. בנוסף, אנו מספקים הנחיות לשימוש בתכונות אופציונליות במהלך ניתוח תמונות וייצוג נתונים, וכן הנחיות לפתרון בעיות עבור כל השלבים הקריטיים לאורך הדרך. לבסוף, אנו כוללים גם השוואה של דEscribed תוכנת ניתוח תמונה עם תוכניות אחרות הזמינות לכימות filopodia. יחד, הפרוטוקול המוצג מספק מסגרת לניתוח מדויק של הדינמיקה חלבון ב בליטות filopodial באמצעות תוכנת ניתוח התמונה.

באמצעות תאים COS transfected עם סמן עבור אקטין נימי (F-tractin 18 , אדום) ואת הפניה cytosolic (ירוק), מצאנו אקטין עשיר filopodial בליטות ( איור 3 א , פאנל העליון). סדרות זמן הראו כי filopodia להרחיב במהירות לחזור ( איור 3 א , לוח באמצע). בא?...

Watch this Scientific Journal Video about A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions at JoVE.com

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

אנו מציגים פתרון תוכנה למעקב חצי אוטומטי של ריכוז חלבון יחסי לאורך של בליטות תאיות דינמיות.

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

a-graphical-user-interface-for-software-assisted-tracking-protein

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Views.  University of Muenster.  אנו מציגים פתרון תוכנה למעקב חצי אוטומטי של ריכוז חלבון יחסי לאורך של בליטות תאיות דינמיות. 

Video: A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

יישום של שרף אור נרפא, דבק שיניים אלקטרודות הרכבה או בדיקות Microdialysis בניסויים כרונית

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

ראייה ריח מעקב מתווכת במהלך טיסה ב תסיסנית

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

ריכוז חלבון Microvolume קביעת באמצעות 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-יוביקוויטין ממברנה שמרים בהתבסס שני היברידי (מיתוס) מערכת: כלי רב עוצמה עבור זיהוי חלבונים אינטראקציות

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

חשיבותה של ריכוז חלבון נכון עבור קינטיקס וקביעת זיקה בניתוח מבנה פונקציה

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

מכשיר microfluidic לכימות Chemotaxis חיידקים Gradients ריכוז אורווה

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

מעקב אחר דפורמציות המוךפו&quot;גנטי שהולך רקמות בעובר צ&#39;יק מוקדם

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

מעקב נייד באמצעות חלבוני Photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...