I. 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר הטכנולוגיה NanoDrop מבוסס על מערכת שימור חדשנית מדגם המשתמשת מתח הפנים להחזיק למדוד דגימות microvolume בין שני כנים אופטי ללא שימוש cuvettes או נימים. 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר משתמשת בטכנולוגיה זו כדי למדוד בקלות ובמהירות 0.5-2 טיפות μL של חלבונים, DNA, RNA, ביומולקולות אחרים. יכולת זו הפך חשוב יותר ויותר בטכניקות מולקולריות להתפתח ללא הרף להשתמש בכמויות קטנות של החומר לניתוח. האידיאל ספקטרופוטומטר microvolume התנאים שבהם מדגם מוגבל. עם זאת, קלות השימוש, מחזור מדידה מהיר, טווח הריכוז נרחב גם להפוך ספקטרופוטומטר המתאים כאשר כמויות גדולות של מדגם זמינים. מחזור המדידה היא גם הקטינה באופן משמעותי, מסייעים למדענים ברחבי workflows להגביר את היעילות שלהם. Microsample ממוקם ישירות על גבי משטח איתור טור נוזל נוצר בין הקצוות של סיבים אופטיים על ידי מתח הפנים. זה טור נוזל צורות נתיב אופטי אנכי. פלאש קסנון מנורה מספק את מקור האור ספקטרומטר ניצול מערך ליניארי CCD משמש כדי לנתח את האור שעובר דרך המדגם. הסרת התקנים ההכלה המסורתית כגון cuvettes מהמערכת יש מספר יתרונות: כמויות קטנות מאוד של המדגם יש צורך מדידה, ניקוי פשוט דורש לנגב את משטחי אופטי עם מעבדה לנגב, ואת אורך הדרך ניתן לשנות בזמן אמת במהלך המדידה. 2000c NanoDrop קובע את אורך מסלול אופטימלי אוטומטית (1 מ&quot;מ עד 0.05 מ&quot;מ), מתן מגוון רחב ביותר של מדידות ריכוז חלבון אפשרי בלי דילולים. על ידי קיצור אורך הדרך, ריכוזים גבוהים יותר של החלבון ניתן למדוד. פעולה זו מסירה ביעילות את הצורך לבצע דילולים עבור דגימות חלבון ביותר. לדוגמה, 2000c NanoDrop יכולים למדוד ריכוזי BSA גבוה ככל 400 מ&quot;ג / מ&quot;ל. 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר הוא ספקטרופוטומטר ספקטרום מלא למדידת ספיגת של DNA, RNA, חלבונים, ביומולקולות אחרים. זה פרוטוקול וידאו תתמקד המדידה של חלבונים. השנייה. ריכוז חלבון Microvolume קביעת שימוש A280 מדידות ספיגת א עקרון A280 מדידות השיטה A280 חלבון ישים מטוהרים חלבונים המכילים טריפטופן, טירוזין, פנילאלנין או שאריות ציסטאין-ציסטאין אג&quot;ח disulphide ואת ספיגת בתערוכה 280 ננומטר. שיטה זו משתמשת בערך A280 ספיגת בשילוב עם או מקדם הכחדה המונית או מקדם הכחדה טוחנת כדי לחשב את הריכוז של חלבון מטוהרים. היתרון של A280 מדידה ישירה היא שהדור של עקומת סטנדרט אינה נדרשת כדי לקבוע ריכוז החלבון. אם המדגם הוא פתרון חלבון uncharacterized, lysate התא, או לחלץ חלבון גולמי, לאחר מכן באמצעות אחד מוגדר מראש שיטות colorimetric זמין על 2000/2000c NanoDrop, כגון BCA, פירס 660 ננומטר, ברדפורד, מבחני לורי, היא מומלץ. ב Microvolume חלבון A280 מדידות - אתחול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את היישום A280 חלבון מהתפריט הראשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את סוג המדגם כדי להימדד מהרשימה הנפתחת. הגדרת ברירת המחדל היא המומלצת ביותר תערובות חלבון ידוע שבו Abs 1 = 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. אם מדידת חלבון מזוכך מאופיין בעבר, אז גם ההכחדה ההמונית מקדם או מקדם הכחדה טוחנת ועל משקל מולקולרי ניתן להזין על מנת לקבוע את ריכוז החלבון באופן מדויק יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את יחידות הריכוז מהרשימה הנפתחת. </li></ol> ג A280 Microvolume חלבון מדידות - blanking <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקמת ריק באמצעות המאגר המתאים. חשוב להשתמש חיץ שבו החלבון הוא מושעה. המאגר משמש את ה-pH צריך להיות אותו כוח יוניים דומה כפתרון המדגם. הערה: מאגרים Ripa לתרום ספיגת יותר מדי על 280 ננומטר ולכן הם בקנה אחד עם מדידות חלבון ישיר A280. עבור חלבונים המרחפים חיץ Ripa, מומלץ ריכוז חלבון ייקבע באמצעות חיץ תואם Ripa assay colorimetric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 2 μL הפתרון המתאים blanking על הדום התחתונה, להוריד את היד ולחץ על ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגבו את הפתרון ריק מן כנים העליון והתחתון באמצעות מעבדה יבש לנגב. </li></ol> ד A280 Microvolume חלבון מדידות מדידת שיקולים חשוב: ההומוגניות של המדגם הוא מאודחשוב מאז נפח קטן כזה נמדדת. על מנת להבטיח כי הדגימות הן הומוגניות, בעדינות אך ביסודיות לערבב את דגימות מייד לפני נטילת aliquot למדידה. הימנע מציגה בועות כאשר ערבוב pipetting. בשל השתנות של מתח הפנים בין חלבונים שונים, אנו ממליצים טעינת 2 μL של דגימות כדי להבטיח בטור המתאים. השתמש תמיד נמוך טפטפת טיפים השמירה. כדי לטעון מדגם, גע עם קצה פיפטה אל פני השטח הדום אופטי נמוכה תוך גירוש פתרון כדי למנוע את הפתרון מתוך דבקות החיצוני של קצה פיפטה. לגרש פחות הסכום המלא של המדגם כדי למנוע את ההתפרצות מבוא של בועות במדגם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן מזהה מדגם בשדה המתאים, לטעון 2 μL של המדגם הראשון כמתואר עבור מדוד את ריק ולחץ. Aliquot 2μL טרי המדגם אמור לשמש עבור כל מדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הדוגמה כנים העליון והתחתון באמצעות מעבדה יבש לנגב. </li></ol> ה Microvolume חלבון A280 מדידות ניקוי רגילה, נטולת סיבים, במעבדה לנגב הוא לעתים קרובות מספיק לניקוי כנים אופטי בין המדידות. ו ביצוע מדידות A280 חלבון שפוץ פתרונות ריאגנטים המכיל חומרים פעילי שטח יכול uncondition את הכן משטחי מדידה לאורך זמן, למנוע את עמודת נוזל דוגמת הטופס. השטחת אגל על ​​כן התחתונה מעיד על המשטח האופטי להיות מותנית. אם מאפייני פני השטח נפרץ, שפוץ כנים חשוב לוודא טור היווצרות המדגם. במקרה זה, בעירום משטחים אופטיים למחות נמרצות באמצעות מעבדה או להשתמש במגרש Pedestal NanoDrop שפוץ (PR-1) על פי ההנחיות. ג. Microvolume ריכוז חלבון באמצעות קביעת מבחני Colorimetric א עקרון הגילוי colorimetric ספקטרופוטומטר 2000c NanoDrop יכול לשמש גם כדי למדוד פתרונות חלבון uncharacterized, lysates תא, תמציות חלבון גולמי באמצעות מבחני colorimetric. שיטות Colorimetric שיטות עקיפות הכרוכות האינטראקציה של צבע עם למרכיב החלבוני של המדגם כדי לייצר מורכבות חדשה סופג אור בטווח אורך גל הנראה. ספקטרופוטומטר 2000c NanoDrop יש מספר מוגדר מראש מבחני colorimetric כולל BCA, פירס 660, ברדפורד, ושיטות לורי. Assay BCA יהיה הפגינו כמו assay דוגמה colorimetric באמצעות ספקטרופוטומטר microvolume. (צילום מסך) Assay (חומצה Bicinchoninic) BCA היא שיטה colorimetric נפוץ המשמש לעתים קרובות לפתרונות חלבון וחלבונים לדלל בנוכחותם של רכיבי כי יש ספיגת UV משמעותית (280 ננומטר). בניגוד לשיטה A280 חלבון, שיטת חלבון BCA דורש עקומת סטנדרט להיווצר לפני חלבון ריכוזי מדגם ניתן למדוד. השיטה משתמשת חומצה bicinchoninic (BCA) כמו מגיב לגילוי. CU-BCA Chelate נוצרו בנוכחות חלבון נמדד ב 562 ננומטר מנורמל ב 750 ננומטר. ב Microvolume BCA מדידות Assay BCA הכנה Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים הנדרש כלולים בערכה סוכן הפחתת תואם (Thermo Scientific חתול פירס לא 23250..): מגיב BCA A, B BCA מגיב, מגיב תאימות, חיץ הכינון, ו אלבומין (BSA) סטנדרטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את כל החלבונים ידוע סטנדרטים חלבון לטמפרטורת החדר ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מספיק מגיב עובד טרי הסטנדרטים דגימות כדי להימדד באמצעות יחס של 50:1 מגיב: B </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור assay המיקרו, השתמש יחס של 1:01 מגיב הפועלים המדגם. הוסף 10 μL לעבוד מגיב על צינור אחד עם צינורות מספיק כדי לכסות את כל דגימות סטנדרטים. עבור assay גבוהה בטווח, השתמש יחס של 20:01 מגיב הפועלים המדגם. הוספת 190 μL לעבוד מגיב על צינור אחד עם צינורות מספיק כדי לכסות את כל דגימות סטנדרטים. עיין BCA פירס ערכת ספרות כדי לקבוע איזה יחס מתאים דגימות שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μL של תקן או מדגם צינור שכל אחת מהן מכילה מגיב. מערבבים היטב על ידי בעדינות vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצינורות על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תגובות לאזן לטמפרטורת החדר (~ 10 דקות). </li></ol> ג Microvolume BCA מדידות Assay יצירת Curve רגילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את שיטת חלבון BCA מהתפריט הראשי. אם החלון אימות גל מופיע, להבטיח הזרוע היא כלפי מטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את הערכים עבור כל הריכוז תקן בטבלה החלונית השמאלית. התוכנה מאפשרת עבור ההפניה ועד 7 additסטנדרטים לאומיים. וההפניה / או סטנדרטים צריך להימדד משכפל. הערה: הדרישה המינימלית עבור הדור עקומת הסטנדרטי הוא המדידה של שני סטנדרטים או מדידת ההתייחסות אפס אחד לפחות סטנדרטי. מומלץ תקנים נוספים שייכללו לפי הצורך כדי לכסות את הריכוז הצפוי בטווח assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקמת ריק. ריק עבור מבחני colorimetric הוא deionized בדרך כלל H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 2 μL של DH 2 O על הדום התחתונה, להוריד את היד ולחץ על ריק. רק אחד ריק יש צורך לכסות את כל המדידות הבאות של הפניה סטנדרטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים את הפניה על ידי pipetting aliquot 2 μL המכיל רק מגיב עבודה חיץ עם חלבון לא על רגל התחתון. מנמיכים את הזרוע למדוד לחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה התקנים, לסמן את רמת המבוקש פיפטה 2 μL ברמה הרצויה על בסיס התחתון. מנמיכים את הזרוע למדוד לחץ. חזור על התהליך עבור כל הסטנדרטים. הקפד למדוד את כל הסטנדרטים לפני דגימות מדידה. כדי להציג את עקומת סטנדרט לחץ צפה Curve רגיל. </li></ol> ד Microvolume BCA מדידות Assay 2 מדידות חלבון μL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל התקנים נמדדו, לחץ על הכפתור דוגמאות. הזן את מזהה המדגם. טען 2 μL של המדגם על המעמד התחתון לחץ מדוד. Aliquot טרי 2 μL המדגם אמור לשמש עבור כל מדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגבו את הדוגמה כנים העליון והתחתון באמצעות מעבדה יבש לנגב. </li></ol> ה Microvolume מדידות BCA Assay ניקוי שפוץ בצע ניקוי שפוץ כמתואר A280 מדידות ישירות ספיגת. נציג תוצאות: ריכוז Microvolume נחישות חלבון מתבצע על ידי מדידה או A280 ישיר או עקיף assay colorimetric. הדוגמה A280 המדידה קובעת ריכוז חלבון על בסיס מקדם הכחדה של החלבון של עניין. הדוגמה colorimetric BCA assay קובע ריכוז חלבון מבוססת של עקומת תקן של ריכוזי חלבון ידועים.

<ol>
	<li>Aitken, A., Learmonth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+determination+by+UV+absorption.">Protein determination by UV absorption.</a> , (1996).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).</li><li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Coomassie+Brilliant+Blue+G250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrilamide+gels.">Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. , (2006).</li><li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. u. j. i. m. o. t. o., Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein.">Quantitation of protein.</a> Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li></ol>

המחברים הם עובדים של תרמו פישר סיינטיפיק המייצרת ריאגנטים וכלים המשמשים במאמר זה.

Quantitation Microvolume משתמש המתח הפנימי משטח המאפיינים של מדגם כדי ליצור עמודה נוזל בין שני משטחים המדידה. היעדר של התקן בלימה, המאפשר אורך הדרך לשנות בזמן אמת, למעשה מבטל את הצורך לבצע דילולים. יכולת זו מגדילה באופן דרמטי את הטווח הדינמי של ריכוזי חלבון, כמו גם את מהירות המדידה. באמצעות כמויות מינימליות של המדגם, מספר רב של דוגמאות ניתן לנתח במהירות ובאופן מדויק, מאפשרת למדענים לבצע מדידות יותר להשיג שליטה באיכות טובה יותר. בנוסף, ובמידת הצורך, דגימות יקרות ניתן לשחזר לאחר לקיחת המדידה. כאשר בנפחים קטנים כאלה נמדדים, מדגם הומוגניות הוא מאוד חשוב כדי למנוע טעויות דגימה. נמוכה פיפטה טיפים שמירה תמיד צריך לשמש עבור דגימות העמסה את הטיפים צריך להיות שונה בין מדגם משכפל. משטחים הדום יש לנקות כראוי מותנה כדי להבטיח את התוצאות המדויקות ביותר. לבסוף, ספקטרופוטומטר microvolume הוא אידיאלי כאשר המדגם הוא מוגבל, לעומת זאת, קלות שימוש, מהירות, טווח דינמי רחב של הספקטרומטר להפוך אותו מתאים כאשר המדגם הוא בשפע.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laboratory wipes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>23250</td>
<td>Reducing agent compatible</td>
</tr>
<tr>
<td>PR-1 Reconditioning Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microvolume protein concentration determination using the nanodrop 2000c spectrophotometer

לספקטרופוטומטריה מסורתית דורשת הצבת דגימות לתוך cuvettes או נימים. זה בדרך כלל לא מעשי בשל כרכים מדגם מוגבל לעתים קרובות לניתוח חלבונים. המדעית Thermo NanoDrop 2000c ספקטרופוטומטר פותרת בעיה זו באמצעות מערכת שימור חדשנית מדגם המכיל דגימות microvolume בין שני משטחים מדידת מתח פנים באמצעות תכונות של נוזלים, המאפשר כימות של דגימות בכמויות נמוכות ככל μL 0.5-2. חיסול cuvettes או נימים מאפשר שינויים בזמן אמת אורך הדרך, אשר מפחית את זמן המדידה תוך הוגדל הטווח הדינאמי של ריכוזי חלבון זה ניתנת למדידה. הצורך דילולים מסולק גם, ההכנות כימות מדגם קל יחסית כמו משטחי מדידה יכול להימחק פשוט עם מעבדה לנגב. מאמר זה מציג וידאו שינויים בשיטות מסורתיות ריכוז חלבון נחישות עבור כימות של כמויות microvolume של חלבון באמצעות A280 קריאות ספיגת או assay colorimetric BCA.

Watch this Scientific Journal Video about Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer at JoVE.com

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

דגימות Microvolume הם לכמת ידי מערכת ספקטרופוטומטר המשתמשת מתח הפנים הטבעי לשמור דגימות ללא שימוש cuvettes או נימים. טווח דינמי של ריכוזי חלבון מהירות שבה הם יכולים להימדד הם גדל מאוד בשיטה זו.

ריכוז חלבון Microvolume קביעת באמצעות 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

<a class="grey_button" href="/video/1770">&#x4E2D;&#x6587;</a><a class="grey_button" href="/video/1920">Deutsch</a> <a class="grey_button" href="/video/1921">Fran&#231;ais</a> <a class="grey_button" href="/video/1922"> Espa&ntilde;ol </a> <a class="grey_button" href="/video/2187"> &#x65E5;&#x672C;&#x8A9E; </a>

microvolume-protein-concentration-determination-using-nanodrop-2000c

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

113.7K Views.  Thermo Scientific NanoDrop Products. 中文Deutsch Français Español 日本語 

Video: Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

חשיבותה של ריכוז חלבון נכון עבור קינטיקס וקביעת זיקה בניתוח מבנה פונקציה

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

רקמות קביעת שווי שימוש בבעלי חיים להשתלות (ACT) Assay ב Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

כימות dsDNA באמצעות ה-F-7000 Hitachi Fluorescence ספקטרופוטומטר ו PicoGreen דיי

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

קביעת ריכוז חומצות גרעין וחלבונים שימוש Micro בנפח Bio-spec ספקטרופוטומטר Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

נחישות של אינטראקציות חלבון ליגנד שימוש דיפרנציאל סריקת Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...