Diese Forschung wurde von der Abteilung für Veteranen Angelegenheiten Karriere Entwicklung Award 1IK2BX001701, CTSA Award UL1TR000445 aus dem National Center for Advancing Translational Sciences, die National Science Foundation Award Nummern 1547757 und 1400969 und NIH Grant GM05551 unterstützt. Ihr Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt offizielle Ansichten des Nationalen Zentrums für die Förderung der Translationswissenschaften oder der National Institutes of Health dar.

1. Ausdruck von S100A12 <ol><li> Transformieren Sie kompetente BL21 DE3-Zellen mit einem pGEMEX-S100a12-Plasmid unter Verwendung eines Standard-Hitzeschock-Protokolls 18 . Füge 1 bis 5 μl Plasmid zu 50 μl Bakterien in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis hinzu. Inkubieren für 20 min. </li><li> Schütteln Sie die Zellen bei 42 ° C für 30 s. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen auf Eis für 2 min. </li><li> Füge 500 μl SOC-Medium zu den Zellen hinzu. Inkubieren bei 37 ° C unter Schütteln bei 250 U / min auf einem Orbitalschüttler für 1 h. </li><li> Plättchen 150 μl der Transformationsreaktion auf LB-Agar-Medium (ergänzt mit 100 μg / ml Ampicillin). Inkubieren für 12-16 h bei 37 ° C. </li><li> Wähle eine Kolonie. Inokulieren Sie 2 ml LB (ergänzt mit 100 μg / ml Ampicillin). </li><li> Inkubieren für 4-6 h bei 37 ° C auf einem Orbitalschüttler (300 U / min). Die OD 600 sollte zwischen 1-3 Absorptionseinheiten lesen. </li><li> Füge 500 μl Starterkultur zu 50 ml ZYM-5052 Autoindu hinzuCtion media 26, ergänzt mit 100 μg / ml Ampicillin. Für eine optimale Belüftung und maximale Expression verwenden Sie einen 250 mL verwirrten Erlenmeyerkolben. Schütteln Sie (300 U / min) für 24 h bei 37 ° C. </li><li> Bakteriensuspension in ein Zentrifugenröhrchen überführen. Pellet die Zellen durch Zentrifugation (4.000 xg, 10 min) bei 4 ° C. </li><li> Dekantieren Sie das Medium, protokollieren Sie Probe und speichern Sie Zellpaste bei -80 ° C. Die Probe ist seit Jahren stabil. </li></ol> 2. Reinigung von S100A12 unter Verwendung von Niederdruckchromatographie <ol><li> Resuspendieren von Zellen in 30 ml 20 mM Tris, pH 8,0. </li><li> Sonate die Suspension auf Eis, um Zellen zu lysieren. Verwenden Sie ~ 20 W Ausgang, 5 s und 5 s aus Zyklus für 5 min. </li><li> Übertragen Sie die Lösung auf Hochgeschwindigkeitszentrifugenröhrchen. Klären Sie das Zelllysat durch Zentrifugation, 20.000 xg für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand dekantieren und auf einen sauberen 100 ml Polypropylen-Becher überführen. Kühlen Sie die Lösung ab, indem Sie den Becher auf Eis legen. Rührei hinzufügenR und fügen langsam 11,20 g Ammoniumsulfat hinzu. Lassen Sie die Lösung auf Eis für weitere 1 h rühren. Dies wird eine 60% ige Lösung von Ammoniumsulfat schaffen und die meisten der E. coli endogenen Proteine ​​präzipitieren. S100A12 bleibt löslich. </li><li> Die Lösung bei 4 ° C, 20.000 xg für 20 min zentrifugieren, um das ausgefällte Protein zu pelletieren. </li><li> Den Überstand dekantieren und auf Dialyseschlauch übertragen (MWCO 3.500 kDa). Dialyse gegen 1 l 20 mM Tris, pH 8,0 bei 4 ° C. Ändern Sie den Dialysepuffer zweimal. Erlaube 4 Stunden zwischen den Änderungen. </li><li> Anionenaustauschchromatographie <ol><li> Führen Sie die Chromatographie auf einem Niederdrucksystem durch. Die typische Durchflussmenge beträgt 1 mL / min. </li><li> Äquilibrieren einer 5 ml Sepharose-Säule mit 10 ml 20 mM Tris, pH 8,0. </li><li> Laden Sie die ~ 40 ml S100A12-Lösung mit der Probenpumpe (sammeln Sie den Durchfluss). </li><li> Die Säule mit 10 ml 20 mM Tris, pH 8, waschen. </li><li> Entwickeln Sie die Säule mit einem 0-30% Gradienten (BuFfer B ist 20 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl) über 19 Säulenvolumina (CV, 95 ml). Sammle 5 ml Fraktionen. </li><li> Nehmen Sie ein 10 μl Aliquot jeder Fraktion und analysieren Sie mit MES SDS PAGE mit Coomassie Färbung. Gel mit konstanter Spannung (20 V / cm) für 30 min laufen lassen. </li><li> Poolfraktionen mit S100A12. S100A12 läuft bei ~ 10 kDa Protein auf einem denaturierenden Gel. </li><li> Konzentrieren Sie die Fraktionen auf 5 ml unter Verwendung einer Ultrafiltrationsvorrichtung (MWCO 10 kDa). Zentrifuge bei 3.000 xg für ~ 8 min. Nehmen Sie den Spitzenbruch. </li></ol></li><li> Größenausschlusschromatographie <ol><li> Äquilibrieren Sie die S75-Säule mit 1 CV (120 ml) 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl. </li><li> Injizieren Sie &lt;5 ml konzentrierte S100A12-Fraktionen (aus der Ionenaustauschchromatographie). </li><li> Die Säule mit einer Durchflussmenge von 1 mL / m über 120 mL entwickeln. Sammle 5 ml Fraktionen. </li><li> Nehmen Sie ein 10 μl Aliquot jeder Fraktion und analysieren Sie mit SDS PAGE mit Coomassie Färbung. Validieren Sie die Proteinidentität mitWestern-Blot oder Massenspektrometrie (berechnete Molekülmasse der monomeren Untereinheit 10.575.0 Da, gemessen 10575.4 Da). </li></ol></li><li> Poolfraktionen <ol><li> Messen Sie die Extinktion des Proteins A 280 mit einem Spektrophotometer. Verwenden Sie den SEC-Puffer als Leerzeichen. Der berechnete Extinktionskoeffizient für S100A12-Homodimer beträgt 5960 M -1 cm -1 . HINWEIS: Typische Ausbeuten sind 35-45 mg S100A12 pro 50 ml Kultur. </li><li> Aliquot S100A12 in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen (1 mg / Röhrchen) einfrieren, in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 ° C aufbewahren. </li></ol></li></ol> 3. Antimikrobielle Aktivität Assays <ol><li> Streifen H. pylori- Stamm G27 auf tryptische Soja-Agarplatten, ergänzt mit 5% Schafblut (Blut-Agar-Platten). Wachsen 2-3 Tage bei 37 ° C in Raumluft, ergänzt mit 5% Kohlendioxid. </li><li> Hacken Sie H. pylori in Brucella Brühe, ergänzt mit 1x Cholesterin. Kultur überNachtschütteln (250 U / min) bei 37 ° C in Raumluft, ergänzt mit 5% Kohlendioxid. </li><li> Verdünnen Sie H. pylori 1:10 in 50% Brucella-Bouillon, 50% Calprotectin-Puffer plus 1x Cholesterin und Kultur im Medium allein oder ergänzt mit 100 μM Zinkchlorid plus 0, 100 oder 1000 μg / ml gereinigtem S100A12. Kultur über Nacht schütteln (250 U / min) bei 37 ° C in Raumluft, ergänzt mit 5% Kohlendioxid. </li><li> Am nächsten Tag führen Sie serielle Verdünnungen und Platten auf Blut-Agar-Platten. Bakterienkolonien für 2-3 Tage bei 37 ° C in Raumluft wachsen lassen, ergänzt mit 5% Kohlendioxid. Aufzählen der koloniebildenden Einheiten zur Berechnung des Bakterienwachstums in Gegenwart oder Abwesenheit von S100A12 und / oder exogenem Zink. </li></ol>

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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase-dependent+lipid+peroxidation+promotes+the+oxidative+modification+of+cytosolic+proteins+in+phagocytic+neutrophils.">Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils.</a> J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Es wird ein effizientes Protokoll für die Expression und Reinigung von humanem S100A12 vorgestellt. Das E. coli- Expressionssystem ist das häufigste Mittel, das für die Herstellung von rekombinanten Proteinen verwendet wird, insbesondere wenn mg-Mengen für biochemische und biophysikalische Studien erforderlich sind. Eine Schlüsselverbesserung des hier beschriebenen Verfahrens ist die Verwendung von Autoinduktionsmedien 26 , die die Ausbeute an gereinigtem Protein um einen Faktor von fast dreißig im Vergleich zur Expression mit Standard-Luria-Brühe-Medien 18 erhöht. Darüber hinaus vereinfacht Auto-Induktionsmedien den Protein-Expression-Workflow erheblich. Unter Verwendung herkömmlicher Wachstumsmedien müssen die Kulturen kontinuierlich überwacht werden, so dass ein Induktionsmittel während der exponentiellen Wachstumsphase zugegeben werden kann. Es besteht keine Notwendigkeit, die Verdopplungszeiten bei der Verwendung von Auto-Induktionsmedien zu überwachen. Die Kulturen können bis zur Sättigung wachsen. Während der Anfangsphasen des Wachstums mit Auto-InduktiAuf medien verwendet E. coli Glukose als Kohlenstoffquelle. Sobald die Glukose verbraucht ist, wechseln die Bakterien zu Lactose als Kohlenstoffquelle, die die Proteinexpression 26 induziert. Die Zusammensetzung des Autoinduktionsmediums ist exquisit abgestimmt, um das Wachstum von hochdichten Kulturen und damit eine erhöhte Expression von rekombinantem Protein zu ermöglichen. In unserer Erfahrung mit S100A12, Auto-Induktion Medien stark erhöht die Menge an exprimiertem Protein, aber wir sind darauf aufmerksam, dass dies kann Protein abhängig und sollte experimentell überprüft werden. S100A12 wird in der zytoplasmatischen Fraktion von E. coli exprimiert, was darauf hindeutet, dass es löslich und gut gefaltet ist. Der erste Schritt der Reinigung beinhaltet die Zugabe eines hohen Prozentsatzes an Ammoniumsulfat, der viele der endogenen E. coli- Proteine ​​ausfällt. Dieser Schritt nutzt die hohe Stabilität und Löslichkeit der S100-Familie von Proteinen. S100A12 ist mäßig sauer (pI 5.81). So wird S100A12 weiter mit einem starken Anionenaustauscherharz gereinigt. Der letzte Schritt des Reinigungsprozesses ist eine Größenausschluss-Chromatographie-Säule, die sicherstellt, dass S100A12 monodispers und dimer ist. Dieser Schritt des Protokolls ist entscheidend, da S100A12 gezeigt worden ist, um lösliche Oligomere 15 zu bilden, und es ist unbekannt, was die Oligomerisierung auf ihre antimikrobielle Aktivität haben kann. Da Mitglieder der S100-Klasse eine hohe Sequenz und strukturelle Homologie teilen, sind ihre physikalischen Eigenschaften ähnlich 27 . Daher kann dieses Verfahren zur Reinigung von S100A12 weitgehend auf alle S100-Proteine ​​anwendbar sein, die in der löslichen Fraktion von E. coli exprimiert werden . Bisherige Arbeiten haben gezeigt, dass S100-Proteine ​​wie Calprotektin eine antimikrobielle Wirksamkeit gegen bakterielle Pathogene wie H. pylori aufweisen und dass diese Aktivität von der Zinkbindungsaktivität abhängig ist. Das AntimikrobumDie Aktivität von S100A12 ist ebenfalls zinkabhängig, aber die Wachstumshemmung, die in bakteriellen Wachstumsassays gezeigt wird, zeigt, dass signifikant mehr S100A12 erforderlich ist, um das Wachstum im Vergleich zu anderen S100-Familienproteinen wie Calprotektin zu hemmen. Daher ist es entscheidend, höhere Konzentrationen von S100A12 als Calprotectin zu verwenden, um ähnliche Phänotypen zu erreichen (Wachstumshemmung oder Veränderungen in der Virulenz). Zukünftige Anwendungen dieses Protokolls könnten angewendet werden, um globale Veränderungen in der bakteriellen Genexpression, metabolischen oder proteomischen Veränderungen in Reaktion auf die Metallsequestrierung, die durch S100A12 auferlegt wird, zu bestimmen.

S100-Proteine ​​sind eine Klasse der EF-Hand-Familie von Calcium-bindenden Proteinen mit einer Vielzahl von Funktionen 1 . Sie werden in einer gewebe- und zellspezifischen Weise exprimiert und regeln ein breites Spektrum an zellulären Funktionen 2 , 3 . Einzigartige Calcium-bindende Proteine, S100-Proteine ​​zeigen sowohl intrazelluläre als auch extrazelluläre Funktionen 4 , 5 . Innerhalb der Zelle induziert die Ca 2+ -Bindung eine Konformationsänderung, die eine hydrophobe Oberfläche aussetzt, die spezifisch auf Proteinbindungspartner 6 abzielt. Dieser intrazelluläre Mechanismus reguliert wichtige Prozesse wie Zellproliferation, Differenzierung und Energiestoffwechsel. Im extrazellulären Milieu zeigen S100-Proteine ​​zwei Funktionen 7 . In einem, sie fungieren als Schmerz assoziierte molekulare Muster (DAMP) Proteine ​​und initiieren einen Pro-inflammAtory Immunantwort durch Interaktion mit Mustererkennungsrezeptoren 8 , 9 . Zusätzlich sind mehrere Mitglieder der S100-Protein-Klassen-Sequester-Übergangsmetalle, eine Funktion, die dazu dient, mikrobielle Pathogene in einem Prozess zu verhungern, der als Ernährungsstörung 10 , 11 bezeichnet wird . S100A12 (auch bekannt als Calgranulin C und EN-RAGE) wird in Makrophagen und Neutrophilen stark exprimiert und als potentieller Biomarker für entzündliche Erkrankungen identifiziert 12 , 13 . Zusätzlich zu dem Binden von Calcium an seinen EF-Hand-Stellen hat S100A12 zwei hochaffine Übergangsmetall-Bindungsstellen, die sich an gegenüberliegenden Enden der Dimer-Grenzfläche 14 , 15 befinden . Jede Bindungsstelle besteht aus drei Histidinresten und einem Asparaginsäurerest und kann Zink oder Kupfer chelatierenSup class = &quot;xref&quot;&gt; 16 , 17 . In letzter Zeit haben wir berichtet, dass S100A12-abhängiger Zink-Hunger bei der Regulierung des Helicobacter pylori -Wachstums und der Aktivität der entzündlichen Virulenzfaktoren wichtig ist. H. pylori infiziert den Magen von etwa der Hälfte der menschlichen Bevölkerung der Welt; Es ist wohl einer der erfolgreichsten bakteriellen Pathogene 19 . Infektion mit H. pylori kann zu signifikanten Magen-Krankheit Ergebnisse einschließlich Gastritis, Magen-und Zwölffingerdarm-Geschwür, Schleimhaut assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT) Lymphom und invasiven Magen-Adenokarzinom (Magenkrebs) führen. Magenkrebs ist die führende Ursache für Nicht-Cardia-Krebs-assoziierten Tod in der Welt, und der einzige größte assoziierte Risikofaktor für Magenkrebs ist Infektion mit H. pylori . H. pylori bleibt in der Magen-Nische trotz einer robuEine Immunantwort auf den Erreger und unterstreicht die Notwendigkeit eines besseren Verständnisses von Immunmechanismen zur Bekämpfung dieser bakteriellen Infektion 20 , 21 , 22 , 23 . H. pylori- assoziierte Entzündungen zeichnen sich durch eine tiefe Infiltration von polymorphonuklearen Zellen oder Neutrophilen aus, die ein Repertoire antimikrobieller Proteine, einschließlich S100A12, an der Stelle der Infektion 18 , 24 , 25 ablagern. In dem Bemühen, den komplexen Dialog zwischen Host und Pathogen zu verstehen, suchten wir die Technik zu verfeinern, um S100A12 zu reinigen und es zu verwenden, um die antimikrobielle Wirkung zu untersuchen, die sie auf diesen medizinisch relevanten Erreger ausübt. Das Protokoll unten beschreibt eine verbesserte Technik für die S100A12-Reinigung in ihrem biologisch aktiven Zustand; Fähig, Nährstoffmetalle mit hohem Affini zu bindenTy und chelatisieren sie weg von eindringenden Mikroorganismen. Darüber hinaus unterstreichen die nachstehenden Methoden die Nützlichkeit dieses Proteins als kritisches Reagenz, um den Mechanismus zu untersuchen, durch den angeborene antimikrobielle Moleküle das Wachstum von bakteriellen Pathogenen einschränken. S100A-Familie Proteine ​​haben Anerkennung als eine wichtige Gruppe von angeborenen Immunsystem Moleküle gewonnen, die an der Immunsignalisierung sowie Host Verteidigung teilnehmen 27 . Das am meisten untersuchte ist Calprotectin (MRP-8/14, Calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Calprotectin ist ein Neutrophil-assoziiertes Protein, das ein Heterodimer der S100A8- und S100A9-Untereinheiten bildet, die Übergangsmetalle an der Dimer-Grenzfläche 31 bindet. Es wurde gezeigt, dass Calprotektin zwei Metallbindungsstellen besitzt: Standort 1 kann Zn 2+ , Mn 2+ oder Fe 2+ binden und Standort 2 können<html> Binden Zn 2+ 31 , 32 . Zahlreiche Berichte haben gezeigt, dass Calprotektin antimikrobielle Aktivitäten gegen verschiedene Pathogene wie Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli und H. pylori aufweist und dass die hemmenden Wirkungen auf die Metallchelataktivität von Calprotectin 25 , 28 zurückzuführen sind , 29 . Bisherige Arbeiten zeigten, dass Calprotektin zahlreiche Aktivitäten auf H. pylori ausübt, einschließlich der Veränderung der Lipid-A-Struktur in der äußeren Membran und unterdrückt das Cag-Typ IV-Sekretionssystem (das ein wichtiger proinflammatorischer Virulenzfaktor innerhalb von H. pylori ist ), wodurch die Biofilmbildung und die Unterdrückung induziert wird H. pylori Wachstum und Lebensfähigkeit in einer dosisabhängigen WeiseClass = &quot;xref&quot;&gt; 25 , 33 . Darüber hinaus zeigten genetische und biochemische Assays die antibakterielle Aktivität von Calprotectin gegen H. pylori wurde weitgehend aus seiner Fähigkeit, Nährstoff Zink 25 zu binden abgeleitet. H. pylori erfordert Zink, wie es bei früheren Untersuchungen bestimmt wurde, die ein chemisch definiertes Medium nutzten, um die Mikronährstoffanforderungen für dieses Pathogen zu ermitteln, um zu wachsen und zu vermehren 34 . Zusätzlich war Calprotectin in H. pylori- infizierten Geweben sehr reichlich vorhanden und mit neutrophilen Infiltraten assoziiert, was anzeigt, dass der Wirt Calprotektin als antimikrobielle Strategie während der Infektion und nachfolgende Entzündung 25 , 35 einsetzen kann . Der jüngste Beweis von den unvoreingenommenen Proteomik-Screening-Techniken deutet darauf hin, dass unter Bedingungen, bei denen reaktive Sauerstoffspezies reichlich vorhanden sind, calprotecZinn unterliegt posttranslationalen Modifikationen, die die Hexa-Histidin-Bindungsstelle verändern und dadurch die Metallbindungsaktivität des Proteins 36 hemmen. Als solches haben wir vermutet, dass andere S100A-Familienproteine ​​unter dem breiten Repertoire dieser Moleküle potentiell als Hilfsmetall-Chelatoren wirken könnten. Wir haben S100A12 für eine weitere Studie ausgewählt, weil es in dem oben erwähnten Screen für die posttranslationale Modifikation nicht identifiziert wurde, es hat die Fähigkeit, Zink zu binden, und es ist sehr reich an menschlichen Geweben, die von H. pylori- infizierten Individuen stammen. Unsere Arbeit zeigt, dass S100A12 H. pylori Wachstum und Lebensfähigkeit in einer dosisabhängigen Weise im G27-Stamm von H. pylori hemmen kann und dass die antimikrobielle Aktivität dieses Proteins durch die Zugabe von überschüssigem Nährstoff-Zink umgekehrt werden kann. Diese Arbeit ergänzt unsere bisherige Arbeit, die darauf hinweist, dass S100A12 antimikrobielle Aktivität gegen PMSS1 und 7.1 ausübt3-Stämme von H. pylori , die ihre breite antibakterielle Wirkung gegen zahlreiche klinische Isolate und Labor-adaptierte Stämme von H. pylori 18 zeigen . Gemeinsam bestätigen diese Ergebnisse die Bedeutung von S100A12 als Mechanismus zur Kontrolle des Bakterienwachstums und der Proliferation durch Ernährungsunempfindlichkeit. Zukünftige Untersuchungen dieser wichtigen Wirtsbakterien-Interaktion könnten die Ausnutzung der Aktivität von S100A12 zur Verringerung der Bakterienbelastung innerhalb von Wirtsgeweben oder die Bestimmung des Beitrags dieses Proteins zur Immunsignalisierung im Kontext der H. pylori- Infektion umfassen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>S100A12 Expression</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL 21 (DE3) competent cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C25271</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoinduction medium components</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>Y20020-250.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23020-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60060-250.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2877</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>M65240-100.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23100-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P41200-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20424-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S25150-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>G22020-1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>G32040-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2643</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection agent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A40040-5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100A12 Purification</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Start Chromatography System</td>
			<td>GE</td>
			<td>29-220-94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q Sepharaose Fast Flow</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-5156-01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 16/60 S-200 HR</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-1166-01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop lite spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040-1000.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H. pylori Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Lab Supply Company</td>
			<td>BBL221261</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brucella broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3051</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol (250X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12531018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, and antimicrobial activity of s100a12

Calgranulin-Proteine ​​sind wichtige Mediatoren der angeborenen Immunität und sind Mitglieder der S100-Klasse der EF-Hand-Familie von Calcium-bindenden Proteinen. Einige S100-Proteine ​​haben die Fähigkeit, Übergangsmetalle mit hoher Affinität zu binden und sie effektiv von eindringenden mikrobiellen Pathogenen in einem Prozess abzuscheiden, der als &quot;ernährungsbedingte Immunität&quot; bezeichnet wird. S100A12 (EN-RAGE) bindet sowohl Zink als auch Kupfer und ist in angeborenen Immunzellen wie Makrophagen und Neutrophilen sehr reichlich vorhanden. Wir berichten über eine verfeinerte Methode für die Expression, Anreicherung und Reinigung von S100A12 in ihrer aktiven, metallbindenden Konfiguration. Die Verwendung dieses Proteins in Bakterienwachstums- und Lebensfähigkeitsanalysen zeigt, dass S100A12 eine antimikrobielle Wirkung gegen den bakteriellen Pathogen, Helicobacter pylori, aufweist . Die antimikrobielle Aktivität beruht auf der Zinkbindungsaktivität von S100A12, die Nährstoffzink chelatisiert und dadurch H. pylori verhungert, was Zink für Wachstum und p erfordertRolltation

S100A12 Expression und Reinigung Eine dreistufige Reinigung ergab 40 mg rekombinantes S100A12 aus 50 ml Bakterienkultur. Der erste Schritt war eine Ammoniumsulfat-Präzipitation von endogenen E. coli- Proteinen. Dieser Stufe folgte eine Anionenaustauschchromatographie (Abbildung 1A ). Das Protein wird von einer SDS-PAGE verfolgt, die mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt ist (Abbildung 1B ). Der letzte Schritt des Reinigungsverfahrens war das Binden von Fraktionen, die S100A12 enthielten, für die Größenausschlusschromatographie, die Proteine ​​durch Molekulargewicht und Form trennt ( 2A ). S100A12 ist ein Homodimer (92 Aminosäuren pro Untereinheit) und hat ein Gesamtmolekulargewicht von etwa 21 kDa. Fraktionen, die aus der Größenausschlusschromatographie gesammelt wurden, wurden durch SDS-PAGE analysiert und durch Coomassie-Färbung sichtbar gemacht ( 2B </sTrong&gt;). S100A12 unterdrückt das Bakterienwachstum durch Zinkchelationsaktivität Um die antimikrobielle Aktivität von S100A12 zu untersuchen, wurden bakterielle Lebensfähigkeitsanalysen über quantitative mikrobiologische Kulturtechniken durchgeführt (Abbildung 3 ). Die Aufzählung von Bakterienzellen zeigt, dass die Exposition gegenüber 100 μg / ml S100A12 in Gegenwart oder Abwesenheit einer exogenen Quelle von Nährstoff-Zink die Bakterienlebensfähigkeit im Vergleich zu Kontrollen ohne S100A12 nicht signifikant inhibiert (P&gt; 0,05, Einweg-ANOVA). Die Exposition gegenüber 1000 &amp; mgr; g / ml S100A12 im Medium allein führt jedoch zu einer 69-fachen Abnahme der Bakterienlebensfähigkeit im Vergleich zu Medium allein (P = 0,0193, Student&#39;s Test, P&gt; 0,05 Einweg-ANOVA); Ein Ergebnis, das durch die Zugabe einer exogenen Quelle von Nährstoff-Zink (P = 0,023, Student&#39;s Test) umgekehrt wurde. Diese Ergebnisse deDie antimikrobielle Aktivität von S100A12 ist abhängig von der Zink-Sequestrierungsaktivität. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55557/55557fig1.jpg" /> Abbildung 1: Zelllyse und S100A12-Reinigung durch Anionenaustauschchromatographie . ( A ) Chromatogramm der Ionenaustauschreinigung. Spur der UV-Absorption bei 280 nm in blau, Salzgefälle in rosa dargestellt, gesammelte Fraktionen in rot markiert. ( B ) SDS-PAGE-Gel von Reinigungsschritten Bahnen: 1) Molekulargewichtsstandard 2) lösliche Lysatfraktion 3) Ammoniumsulfatpellet 4) Ammoniumsulfatüberstand 5-14) Q-Chromatographiefraktionen 6-15. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55557/55557fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" srC = &quot;/ files / ftp_upload / 55557 / 55557fig2.jpg&quot; /&gt; Abbildung 2: Größenausschlusschromatographie Ergebnisse der S100A12-Reinigung. ( A ) Chromatogramm der Größenausschlussergebnisse. Spur der UV-Absorption bei 280 nm in blau dargestellt, gesammelte Fraktionen in rot markiert. ( B ) SDS-PAGE-Gel der Größenausschlusschromatographie. Bahnen: 1) Molekülgewichtsmarker 2) Probenbelastung 3-15) Fraktionen 10-21. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55557/55557fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55557/55557fig3.jpg" /> Abbildung 3: Quantitative Kulturanalysen der bakteriellen Lebensfähigkeit in Reaktion auf die Exposition gegenüber S100A12-abhängiger Zinkchelation. Bakterien wurden 0, 100 oder 100 μg / ml S100A12 in Medium allein (graue Balken) oder Medium, ergänzt mit 100 &amp; mgr; M Zinkchlorid, ausgesetzt(Schwarze Balken). Die Exposition gegenüber 1.000 μg / ml in Abwesenheit einer exogenen Quelle von Nährstoffzink führt zu einer signifikanten Hemmung der Bakterienlebensfähigkeit (* P &lt;0,05, Student&#39;s Test im Vergleich zu Medium + Zink-Zustand). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55557/55557fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Hier stellen wir eine Methode zur Expression und Reinigung von S100A12 (Calgranulin C) vor. Wir beschreiben ein Protokoll zur Messung seiner antimikrobiellen Aktivität gegen den menschlichen Pathogen H. pylori .

Expression, Reinigung und antimikrobielle Aktivität von S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

expression-purification-and-antimicrobial-activity-of-s100a12

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Serie: Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug used to treat depression and anxiety by binding to the serotonin transporter with high-affinity, blocking serotonin reuptake. Here we report an efficient procedure and a set of tools to stabilize, express, purify, and crystallize serotonin transporter-antibody complexes bound to S-citalopram and other antidepressants. Mutations which stabilize the serotonin transporter were identified using an S-citalopram binding assay. Serotonin transporter expressed in baculovirus-transduced HEK293S GnTI- cells, was reconstituted into proteoliposomes and used to raise high-affinity antibodies. We have developed a strategy to discover antibodies that are useful for structural studies. A straightforward approach for the expression of antibody fragments in Sf9 cells has also been established. Transporter-antibody complexes purified using this procedure are well-behaved and readily crystallize, producing complexes with S-citalopram that diffract X-rays to 3-4 &#197; resolution. The strategies developed here can be utilized to determine the structure of other challenging membrane proteins.

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

This manuscript describes how to screen for thermostabilizing mutations, purify the human serotonin transporter, generate high affinity antibodies, and crystallize the serotonin transporter-antibody complex bound to the antidepressant drug S-citalopram. This protocol can be adapted to the study of other challenging membrane transporters, receptors, and channels.

Thermostabilization, Expression, Reinigung und Kristallisation des menschlichen Serotonin-Transporter-Bound<em&gt; S</em&gt; -Citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Forschung

Biochemie

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

Labormaßstab Herstellung und Reinigung eines therapeutischen Antikörpers

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a chemical defense because it has antimicrobial activity and is considered a natural insecticide. Caffeine can also produce negative allelopathic effects that prevent the growth of surrounding plants. In addition, people around the world consume caffeine for its analgesic and stimulatory effects. Due to interest in the technological applications of caffeine, research on the biosynthetic pathway of this compound has grown. These studies have primarily focused on understanding the biochemical and molecular mechanisms that regulate the biosynthesis of caffeine. In vitro tissue culture has become a useful system for studying this biosynthetic pathway. This article will describe a step-by-step protocol for the quantification of caffeine and for measuring the transcript levels of the gene (CCS1) encoding caffeine synthase (CS) in cell suspensions of C. arabica L. as well as its activity.

This protocol describes an efficient methodology for the extraction and quantification of caffeine in cell suspensions of C. arabica L. and an experimental process for evaluating the enzymatic activity of caffeine synthase with the expression level of the gene that encodes this enzyme.

Koffein-Extraktion, enzymatische Aktivität und Genexpression von Koffein-Synthase aus Anlage Zellsuspensionen

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

Anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse über Sauerstoff-Elektrode für das Studium DesB Dioxygenase Aktivität und Hemmung

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung der eukaryotischen Borat-Transporter

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

Expression und Reinigung von Nuklease-freier Sauerstofffänger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.