אנו מבקשים להודות סבין Reckinger לקבלת סיוע טכני מעולה ותמיכה.

1. הכנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף דוגמאות הערה: השיטה הבוחשת המגנטית יכולה לשמש דגימות שריר בודדות או תקווינה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימות מאתרי הנטייה המתאימים בסכום מתאים 9. עיין בדרישות המדינה או להמלצות של ICT, OIE או ISO. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור האיחוד האירופי, למשל, לקחת דגימת 1 גרם מתוך עמוד סרעפת על מעבר החלק השרירי של חזירים מקומיים. ודא שכל דגימות שריר הן ללא כל שומן fascia. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הלשון נבחנת, להסיר את שכבת פני השטח לפני הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשמור על עצמך אם דגימות קפואות, כמו רוב זחלי Trichinella אינם להקפיא עמידים uncoil לאחר מותו, הם עמידים פחות עיכול נוטים להיצמד קירות מכל, וכתוצאה מכך רגיש assay ירד. הערה: אם קפוא, להכפיל את גודל המדגם ב lמהמזרח ולהגדיל את זמן השקיעה (ראה להלן). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת נוזל עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25% HCl (16 ± 0.5 מ&quot;ל) ל -2 ליטר של מי ברז שחומם מראש ב 46 - 48 ° C לתוך כוס זכוכית 3 L. נמוך מדי של תוצאות טמפרטורה לעיכול שלם; גבוה מדי של טמפרטורה מנטרל את המאפיינים האנזימטית של פפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מוט בחישה בכוס, ומערבבים הפתרון על צלחת שחומם מראש (46 - 48 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 ± 0.2 גרם של פפסין (1: 10,000 NF, 1: 12,500 BP, 2,000 FIP) לפתרון חומצי. הערה: איכות פפסין היא פעילות חשיבות ואנזים עליונות חייבות להיות מאושר על ידי היצרן. מטעמי בטיחות במעבדה ועל מנת לשמור על פעילות פפסין, הרצף של הוספת רכיבים נוזלים עיכול חייב להיות דבק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שריר מדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוצץ עד 100 גרם של דגימות שריר בבלנדר או במטחנה. כדי להקל blenדינג, להוסיף 2 מ&quot;ל שחומם מראש מים על דגימות ומערבלים במהירות מקסימלית עבור 2 - 3 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני המיזוג השני, פתח את הבלנדר ולהעביר כל מדגם שרירים בחלק העליון של מרווח קצה מיזוג קערה על המיזוג התחתון וחזור. המשך מיזוג עם התפרצויות של 2 - 3 שניות עד אין חתיכות גלויות של בשר להישאר. הערה: ערבוב מעט מדי עלול לגרום עיכול לא שלם, תוך ערבוב מדי יכול לפגוע בהווה הזחלים Trichinella בדגימות 6. </li></ol></li></ol> נוהל 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיכול שרירי מדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 1 ליטר של נוזל העיכול לגליל. מעבירים את הבשר הטחון לתוך כוס ולהפיץ בנוזל העיכול בעזרת כף או מזלג. לשטוף ביסודיות את המכסה בבלנדר, להב בבלנדר קערה עם 500 מ&quot;ל של נוזל עיכול שחומם מראש לתוך כוס 3 L. הערה: שטיפת Incomplete יכולה לגרום לאובדן של sensitivity. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הכוס עם רדיד אלומיניום ולשמור על טמפרטורה קבועה של 44 - C ° 46 ולפקח עם מדחום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את נוזלי העיכול למשך 30 דקות כדי ליצור מערבולת עמוקה בלי מתיז עד חלקיקי הבשר להיעלם. בהתאם לסוג של בשר הנבדק (בשר למשל של חיות ברות), להאריך את משך זמן העיכול עד למקסימום של 60 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון ושיקוע של נוזל העיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את כמות הרקמה מעוכלת, להתאים את קנה המידה לאפס, לשקול את המסננת לפני השימוש, ושימו לב משקליו. המסננת צריכה להיות נקיה ונטולה כל חלקיקי רקמות, אשר יכול לעכב את זחלי Trichinella לכת משפך השקיעה. בדוק כי משפך ההפרדה מפולס אנכי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עיכול, בזהירות לשפוך את נוזל העיכול דרך מסנן 180 מיקרומטר לתוך משפך זכוכית הפרדה. רוחבו של משפך זכוכית הפרדה אסור bדואר גדול מ -55% מאורך לאפשר שקיעת זחל טובה. תשמור על עצמך כדי למנוע הצפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע אובדן של רגישות, לשטוף ביסודיות את כוס זכוכית ואת המסננת עם כ 200 מיליליטר של מים ברז מבקבוק לשטוף לסחוט ולהעביר את מי שטיפה לתוך משפך זכוכית שקיעה. תשמור על עצמך כדי לשטוף את הקצוות בקפידה את כוס 3 L. הרם את המסננת ולשטוף את האזור תחת המסננת ביסודיות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת כמות רקמה מעוכלת הערה: בשל טעויות בביצוע של השיטה, רקמת שריר יכולה להישאר על המסננת, כמו fascia גם ורקמות חיבור שהן בלתי ניתנות לעיכול. כמות הרקמה מעוכלת נקבעת במהלך שלב שקיעת 10 הדק &#39;הראשון (ראה 2.5). זה מאפשר כ -30 דקות עבור המסננת להתייבש, כמו מים שיורית יכולים להשפיע על המשקל הנחרץ של הרקמות המעוכלות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח מגבת נייר בסולם, ולשקול את המסננת עם undigesרקמות טד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת המשקל המסנן לפני הסינון מן המשקל המסנן עם רקמות מעוכלות. תהליך העיכול נחשב משביע רצון, אם לא יותר מ -5% ממשקל פתיחה לדוגמא נשארים על המסננת (כלומר 5 גר &#39;/ 100 גרמו חומר מוצא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כמות רקמה מעוכלת עולה על 5%, לחזור על הבדיקה באמצעות דגימות שריר טריות. אם הרקמה הנותרת מורכבת בעיקר של רקמות שריר מעוכלות דגימות טריות אינן זמינות, לעכל את השרידים המעוכלים שוב ולבחון בנוסף הדגימות המקוריות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקיעה של נוזל העיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את נוזל העיכול המסונן במשפך separatory למשך 30 דקות. אם נותר ללא הפרעה, זחלי Trichinella יישבו בתחתית המשפך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם דגימות קפוא משמשות, להאריך את משך זמן השקיעה עד למקסימום של 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השקיעה תושלם, מלא לפתוח את השסתוםשל משפך separatory לתת לפחות 40 מיליליטר של נוזל עיכול במהירות לברוח לתוך גליל מדידה (80 מיליליטר אם דגימות שריר שהוקפאו בעבר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, בואו וחצים של הנוזל לתוך הצילינדר ולאחר מכן מלא לפתוח את השסתום בכיוון ההפוך כדי לאפשר 10 מיליליטר של נוזל עיכול לעבור. לבסוף, פתח את השסתום בכיוון ההפוך עוד 10 מיליליטר. הליך זה מבטיח כי הזחלים Trichinella אינם לכודים ברזלים. הערה: מהירות מספקת נדרשת על מנת להימנע זחלים שנותרו משפך separatory, הפחתת רגישות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקיעה של נוזל עיכול בצילינדר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את המשקע בצילינדר במשך 10 דקות כדי לאפשר זחלים משקעים. הסר 30 supernatant מ&quot;ל ידי שאיבת עם טפטפת מבלי להפריע משקעים 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפחית את כמות סיבי רקמות במדגם, להוסיף ברז מיליליטר 30 מים משקעים ולהשאיר למשך עוד 10 מ &#39;ב. חזור על פעולה עד שהנוזלים ברורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ולהעביר את 10 מ&quot;ל שטף משקעים לצלחת פטרי gridded או אגן ספירת הזחל. שוטף את הגליל עם 10 מ&quot;ל מים ברז ולאחר מכן להוסיף את המים המדגמים. הערה: כפי כמויות גדולות של פסולת במדגם יכולות למנוע זיהוי של זחלי Trichinella (איור 1), צעדי כביסה נוספים צריכים להתבצע, אם נדרשו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקה מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש trichinoscope או-מיקרוסקופ סטריאו עם מקור אור המועבר תת-שלב בעצמה מתכווננת בהגדלה 15 עד 20X לבחון דגימות מייד לאחר שלבי הכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שמזג מדגם לתוך צלחת פטרי gridded, לבחון את המנה / אגן הרשת באופן שיטתי על ידי הרשת. אם אין מבנים חשודים נמצאים, בעדינות להזיז את הנוזל בצלחת פטרי gridded או אגן ספירת זחל בצורה מעגלית כדי לאפשר לכל Trichinella larvae, שהיו מתעלמים באופן פוטנציאלי, לצבור במרכז צלחת פטרי. חזור על הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מבנה חשוד נמצא, להגדיל גדלה ל -40 - 100X. הסר הזחלים Trichinella מצלחת / אגן עם טפטפת ולאסוף בתוך שפופרת עם אתנול 90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המנה המלאה נבדקת, לחזור על התהליך, החל הרעד העדין של המנה / אגן. חזור על התהליך לפחות שלוש פעמים או עד שלא זחלים יותר נמצאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת הזחלים. כדי לתאם את כמות רקמת שריר נבדק ובהווה כזחלים לגרם (גפ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יותר מדי זחלים נמצאים בנוזל העיכול כדי לקבוע את מספר הזחל באופן מהימן, להחזיר את הנוזל המכיל את הזחלים אל גליל המדידה, יש לשטוף במים ברז מבקבוק לשטוף לסחוט, ולהשאיר זחלים ליישב לתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן שקיעה 10 דקות, מנמיכים את supernatant לנפח מוגדר (למשל10 מ&quot;ל). כדי לקבוע את הנפח המדויק, להעביר את supernatant לגליל חדש עם טפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות זחלי homogenously בנוזל על ידי טלטול נמרץ. במהלך התנועה הרועדת, להוסיף 12 טיפות של 20 μL השעית זחל לצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון כל טיפה ידי מיקרוסקופ. לקבוע את מספר זחלי 240 μL ולמחוק את הספירה העליונה לעשירונים תחתונה. לחיץ במספר הזחלים לסך נפח (למשל 10 מ&quot;ל) של supernatant. הערה: איכות מיקרוסקופ סטריאו היא בעלת חשיבות עליונה לזיהוי זחלי Trichinella. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הזחלים נאספים צינור ידי טפטפת, לבדוק היטב כי הזחלים לא מקל על הקיר פיפטה אך מועברים הצינור. הערה: ממצאי Trichinella החיובי ממדגמים ונקוו חייבים להיות נעוצים מהברכה אל הפגר מוצא. הנה, את גודל הברכה צריך להיות ירידה בהדרגה עד הפגר החיובי היא iDENtified. גודל המדגם יכול גם להיות מוגבר במהלך תהליך זה כדי להגביר את הרגישות. איפה בדיקת מדגם קולקטיבי מייצרת תוצאה חיובית או לא בטוחה, מדגם 20 גרם עוד לקוח מתוך כל חזיר. 20 הדגימות גרמו מחמישה חזירים הם אספו ובדקו באמצעות השיטה המתוארת. בדרך זו דגימות מ -20 קבוצות של חמישה חזירים תיבחנה. כאשר Trichinella מזוהה מדגם נקווה מחמישה חזירים, 20 דגימות גרמו נאספות החזירים הבודדים בקבוצה וכל אחד מהם נבחן בנפרד עד הפגר מהמוצא החיובי מזוהה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gottstein, B., Pozio, E., N&#246;ckler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology,+Diagnosis,+Treatment,+and+Control+of+Trichinellosis.">Epidemiology, Diagnosis, Treatment, and Control of Trichinellosis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 22, 127-145 (2009).</li><li>Pozio, E., Murrell, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematics+and+epidemiology+of+Trichinella.">Systematics and epidemiology of Trichinella.</a> Adv. Parasitol. 63, 367-439 (2006).</li><li>9 CFR Part 318.10 - Prescribed treatment of pork and products containing pork to destroy trichinae. U.S. Government Publishing Office Available from: <a target="_blank" href="https://www.gpo.gov/fdsys/pkg/CFR-2016-title9-vol2/pdf/CFR-2016-title9-vol2-sec318-10.pdf">https://www.gpo.gov/fdsys/pkg/CFR-2016-title9-vol2/pdf/CFR-2016-title9-vol2-sec318-10.pdf</a> (2012)</li><li>Gamble, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Commission+on+Trichinellosis:+recommendations+on+methods+for+the+control+of+Trichinella+in+domestic+and+wild+animals+intended+for+human+consumption.">International Commission on Trichinellosis: recommendations on methods for the control of Trichinella in domestic and wild animals intended for human consumption.</a> Vet. Parasitol. 93 (3-4), 393-408 (2000).</li><li>Gajadhar, A. A., Forbes, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internationally+recognized+quality+assurance+system+for+diagnostic+parasitology+in+animal+health+and+food+safety,+with+example+data+on+trichinellosis.">An internationally recognized quality assurance system for diagnostic parasitology in animal health and food safety, with example data on trichinellosis.</a> Vet. Parasitol. 103, 133-140 (2002).</li><li>N&#246;ckler, K., Kapel, C. M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Detection+and+surveillance+for+Trichinella:+meat+inspection+and+hygiene,+and+legislation.">Chapter 3, Detection and surveillance for Trichinella: meat inspection and hygiene, and legislation.</a> FAO/WHO/OIE Guidelines for the surveillance, management, prevention and control of trichinellosis. , 69-98 (2007).</li><li>Boch, J., Schnieder, T., Supperer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Veterin&#228;rmedizinische Parasitologie. , (2006).</li><li>Despommier, D. D., M&#252;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stichosome+and+its+secretion+granules+in+the+mature+muscle+larva+of+Trichinella+spiralis.">The stichosome and its secretion granules in the mature muscle larva of Trichinella spiralis.</a> J. Parasitol. 62 (5), 775-785 (1976).</li><li>Marucci, G., Interisano, M., La Rosa, G., Pozio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+nematode+larvae+different+from+those+of+the+Trichinella+genus+detected+by+muscle+digestion.">Molecular identification of nematode larvae different from those of the Trichinella genus detected by muscle digestion.</a> Vet Parasitol. 194, 117-120 (2013).</li><li>Forbes, L. B., Gajadhar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+validated+Trichinella+digestion+assay+and+an+associated+sampling+and+quality+assurance+system+for+use+in+testing+pork+and+horse+meat.">A validated Trichinella digestion assay and an associated sampling and quality assurance system for use in testing pork and horse meat.</a> J. Food Prot. 62, 1308-1313 (1999).</li><li>Malakauskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+epidemiology+of+Trichinella+spp.+in+three+Baltic+countries:+Lithuania,+Latvia,+and+Estonia.">Molecular epidemiology of Trichinella spp. in three Baltic countries: Lithuania, Latvia, and Estonia.</a> Parasitol. Res. 100 (4), 687-693 (2007).</li><li>Kapel, C. M., Webster, P., Gamble, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+distribution+of+sylvatic+and+domestic+Trichinella+larvae+in+production+animals+and+wildlife.">Muscle distribution of sylvatic and domestic Trichinella larvae in production animals and wildlife.</a> Vet. Parasitol. 132 (1-2), 101-105 (2005).</li><li>Interisano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+latex+agglutination+test+for+the+detection+of+Trichinella+infections+in+pigs.">Validation of a latex agglutination test for the detection of Trichinella infections in pigs.</a> Vet. Parasitol. 194, 121-124 (2013).</li><li>Pozio, E., La Rosa, ., G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-derived+methods+for+the+identification+of+Trichinella+parasites+from+animal+and+human+samples.">PCR-derived methods for the identification of Trichinella parasites from animal and human samples.</a> Methods Mol. Biol. 216, 299-309 (2003).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

למרות ששיטת הבוחש המגנטית יכולה להתבצע בקלות, לא הקפדה על פרטים טכניים מובילה רגישות מספק, ובכך מסכנת את בריאות צרכנים. נקודות הבקרה הקריטיות הודגשו בטקסט לעיל. בנוסף, השימוש בציוד מתאים הוא קריטי עבור התוצאה המוצלחת של המבחן. כל הכלי צריך להיות עשויים טיפי זכוכית פיפטה מצופים סיליקון להפחית דבקות של זחלים אל פני השטח. הרגישות של שיטת העיכול תלוי צפיפות הזחל בשרירים וכמות מדגם שריר הנבדקת. עבור צפיפות זחל של 3 - 5 גפ&quot;מ רקמות שריר, רגישות של 100% נמסרה, אך מתחת גפ&quot;מ 1 הרגישות ירדה ל -40% 13. בהתאם מינים של בעלי החיים מארחים נבדקים, הרגישות של הבדיקה ניתן לשפר על ידי הגדלת כמות מדגם. האנינטל nfection חיות בר הוא בדרך כלל נמוך, ולכן גדלים מדגמים גדולים משמשים 14. אתרי נטייה גם להשתנות בין בעלי חיים מארחים. הנה, את הנעכלות הנמוכות של כמה רקמות שריר כגון הלשון צריכה להילקח בחשבון, אשר יכול גם לגרום מדגם גדול יותר בגדלי 15. יתר על כן, חשוב להבין כי שיטת הבוחש המגנטית אינה כוללת בקרות פנימיות. לכן, ניהול אבטחת איכות מדגימה בתיעוד חיוני להשיג תוצאות מדויקות ומדויקות. איכות ביצועי מעבדה כדי לזהות זחלי Trichinella בדגימות שריר צריך להיות במעקב על ידי השתתפות סדירה של כל אנליסט במבחני בקיאות. הגבלות נוספות של השיטה הן ששלב זיהוי הסופי של זחלים שרירים על ידי מיקרוסקופ הוא סובייקטיבי מאוד heavily תלוי בידיעת מורפולוגיה זחל על ידי המטפל לבחון. שיטה חלופית מעניינת לעקוף בעיה זו היא השיטה בוחשת המגנטית / על בידוד המסנן ואחריו זיהוי זחלים על ידי מבחן התלכדות לטקס. עם זאת, לפי חוקי איחוד שיטה זו נחשבת רק שווה ערך עבור הבדיקות של בשר חזירים מקומיים אך לא עבור בעלי חיים אשר נמצאים בסיכון גבוה יותר של הידבקות כגון חזיר בר 4. זיהוי של אנטיגן הזחל עם נוגדנים חד שבטיים עושה המבחן אובייקטיבי יותר, אך מכחיש במעבדה אפשרות קביעת מספר הזחלים לגרם בשר 16. וריאציות נוספות של השיטה הבוחשת המגנטית כוללות את טכניקת שיטה / שקיעת עיכול מדגם נקווה בעזרת מכשור המכאני, חפירה המדגמת ונקווית בעזרת מכשור המכאנישיטת estion / על טכניקת בידוד מסנן, ושיטת העיכול האוטומטית עבור דגימות משולבות של עד 35 טכניקה גרם. טכניקות אלו מבוססות כולם על העיכול המלאכותי של הבשר להדמית ספירת Trichinella הזחלים, אך נבדלות הציוד המשמש את צעדי הסינון ושיקוע. הזחלים המבודדים ניתן לזהות נוסף ברמת המין על פי מבחן מולקולרי (למשל, רב מפלסי PCR) 17. לפי תקנות איחוד אירופאיות, כל הדגימות החיוביות יש להעביר למעבדת ההתייחסות הלאומית או EURLP לקביעת מיני Trichinella.

נמטודות ממין Trichinella ניתן לאתר בשרירים מפוספסים של יונקים טורפים ו אומניבור, ציפור, וזוחל ברחבי העולם. נמטודות zoonotic אלה יכולים להגיע בני אדם כאשר גלם או חצי גלם מוצרים שמקורם בשר מן החזירים, סוס, וחיות המשחק מעובדים. זואונוסיס זה יכול להיות מחלה קשה בבני האדם מאופיינים בתסמינים פתוגנומוני, למשל שלשול, חום, בצקת periorbital ואת כאבי שרירים וסיבוכים אפשריים כגון דלקת שריר לב, מחלת תרומבואמבוליים ודלקת מוח 1. Spiralis Trichinella הוא סוכן אטיולוגי הנפוץ ביותר של דלקת Trichinella בטבע פראי ופנים וגורם למרבית של זיהומי אדם ברחבי עולם. באירופה, צפון ומערב אפריקה, ובמערב אסיה, Trichinella britovi הוא מקור נוסף של זיהומים האדם. בנוסף, עשרה מינים אחרים פחות מדווחים בכינויו סיבתי<html> סוכנים של המחלות האנושיות והן נמצאים באזורים שונים של העולם, בדרך כלל חיות בר 2. בנוסף חיות ברות כגון חזיר בר, דובים, סוסי ים וגיריות, חזיר מייצג את המקור החשוב ביותר של הידבקות בני אדם ברחבי העולם. הדרך הטובה ביותר למנוע trichinellosis היא להימנע מאכילת מוצרי בשר נאים לבשל כל בשר, בעיקר בשר משחק לטמפרטורות בטוחות (&gt; 65 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, כלומר לשנות את צבע בשר מורוד עד חום הליבה של מוצר בשר) 3. האיחוד האירופי USDA ציינו פעמי הקפאה ובישול וטמפרטורות עבור מוצרי בשר חזיר, שניתן להשתמש בם כדי להרוג זחלי ט spiralis בבשר 4, 5. יתר על כן, המלצות על האיון של Trichinella במוצרי בשר שפורסמו על ידי הוועדה הבינלאומית Trichinellosis&quot;Xref&quot;&gt; 6. באירופה, בנוסף המבוא של תנאי דיור נשלטו בעדרים מסחריים חזירים שבה סכנת זיהום Trichinella זניחה, למניעת trichinellosis אדם מבוססת על הבדיקה במעבדה של דגימות שריר מחיות רגישות 4. למטרות בטיחות מזון, מבחני עיכול הנהלים האמינים רק לצורך זיהוי הישיר של זחלי Trichinella בבשר 3, 7. גם אם יש כמה וריאציות של assay העיכול, השיטה הבוחשת המגנטית היא שיטת ההתייחסות המקובלת בעולם 3, 4, 7. Assay זה מבוסס על זיהוי של זחלי Trichinella ברקמות שריר מפוספסים. לאחר העיכול אנזימטי של דגימות שריר וצעדי סינון ושיקוע עוקבים Triזחלי chinella מזוהים על ידי מיקרוסקופ. בהתאם חובות סחר וחקיקה לאומית, יש שפע של וריאציות קטנות בפרוטוקול הכללי של שיטת הבוחש המגנטית. הנה, הפרטים הטכניים מבוססים על דרישות האיחוד האירופי 4 מפרטים ISO 8, הנחיות ICT 6, והחוויה של מעבדת יחוס האיחוד האירופי עבור טפילים (EURLP) ובמעבדה הפניה הגרמני Trichinella.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1019">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Knife,Scissors, Tweezers&#160;</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:363px;">Cutting samples and removing non-digestible tissue</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Blender&#160;</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">With a sharp chopping blade</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">With thermostatically controlled heating plate</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Stirring Rod</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Teflon-coated, approximately 5 cm long</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:220px;">Conical glass separation funnel</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Capacity of at least 2 litres, preferably fitted with Teflon safety plugs. The width should not be larger than 55% of the length to allow a good larva sedimentation</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Stands, rings and clamps</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:220px;">Sieve</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Mesh size 180 microns, external diameter 11 cm, with stainless steel mesh</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Funnel</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Internal diameter not less than 12 cm, to support the sieves</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Glass beaker</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Capacity 3 litres</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Glass measuring cylinder</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Capacity 50 to 100 ml, or centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:220px;">Stereo-microscope</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">With a substage transmitted light source of adjustable intensity or trichinoscope with a horizontal table</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:220px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">9 cm diameter, marked on their undersides into 10 &#215; 10 mm square examination areas using a pointed instrument or a larval counting basin for the tricinoscope</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Aluminium foil</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Alternatively a lid to cover the beakers</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">25 % hydrochloric acid</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:220px;">Pepsin</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Strength: 1:10 000 NF (US National Formulary) corresponding to 1:12 500 BP (British Pharmacopoeia) and to 2 000 FIP (F&#233;d&#233;ration internationale de pharmacie), or stabilised liquid pepsin with minimum 660 European Pharmacopoeia units/ml</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Ethanol</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">70-90% ethyl alcohol</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Tap water</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Heated to 46-48 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Balance</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Accurate to at least 0.1 g</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:220px;">Metal tray</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Capacity 10 to 15 litres, to collect the remaining digestive juice</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Pipettes and pipette holder</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Different sizes (1, 10 and 25 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:220px;">Thermometer&#160;</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Accurate to 0.5 &#176;C, temperature range at least from 20 &#176; C to 70 &#176; C</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Siphon&#160;</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">For tap water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic stirrer method for the detection of trichinella larvae in muscle samples

Trichinellosis היא מחלה מתישה בבני אדם והיא נגרמת על ידי צריכת בשר נא או שלא בושל של חיות נגועות עם הזחלים נמטודות מהמין Trichinella. המקורות החשובים ביותר של זיהומי אדם בעולם הם בשר משחק ומוצרי בשר חזיר או בשר חזיר. במדינות רבות, מניעת trichinellosis אדם מבוססת על זיהוי של בעלי חיים נגועים באמצעות העיכול המלאכותי של דגימות שריר מ פגרי בעלי חיים רגישים. ישנן מספר שיטות המבוססות על העיכול של בשר אבל השיטה הבוחשת המגנטית נחשבת תקן הזהב. שיטה זו מאפשרת זיהוי של זחלי Trichinella ידי מיקרוסקופ לאחר העיכול אנזימטי של דגימות שריר וצעדי סינון ושיקוע שלאחר מכן. אמנם שיטה זו אינה דורשת ציוד מיוחד ויקר, בקרות פנימיות לא ניתן להשתמש. לכן, ניהול איכות מחמירים יש applieד לאורך כל הבדיקה. מטרת העבודה הנוכחית היא לספק הוראות טיפול מפורטות ונקודות בקרה קריטיות של שיטת אנליסטים, על סמך הניסיון של המעבדת תחוס האיחוד האירופי עבור טפילים ובמעבדת ההתייחסות הלאומית של גרמניה עבור Trichinella.

<html> לאחר עיכול, את הצורה של זחלי שריר התולעת יכולה להשתנות, מה שהופך זיהוי קשה יותר. צורות אופייניות כוללות זחלים מפותלים היטב, זחלים או ג בצורה מפותלת קל או זחלי uncoiled לחלוטין (2B ומספרים - 2C). מספר הזחלים מצא לגרם יכול להשתנות במידה ניכרת והוא נע בין זחל אחד לכמה מאה זחלים. המורפולוגיה של זחל שריר זיהומיות מוצגת איור 2 א. זחלי Trichinella הם 0.7 1.5 מ&quot;מ ארוך כ 0.3 מ&quot;מ רוחב. הוושט הוא צר ויש לו סוף מעוגל מעט. לציפורן היא חלקה. במחצית הקדמית של חלל הגוף, stichosome, מבנה היווה של צינור ארוך וצר מוקף בשורה של 45 עד 55 תאים גדולים (stichocytes), ניתן לצפות. פי הטבעת הוא גם מעוגלת ללא כל תחזיות או כספיחיהם 10, 11. t &quot;&gt; מבנים אחרים, מלבד זחלי Trichinella, ניתן למצוא לאחר עיכול שרירים כמה דוגמאות מוצגות איורי 3A -.. 3F חיות ברות נגועות לעתים קרובות עם טפילים אחרים או דגימות השריר הזמינות לבדיקה הם מזוהמים במהלך תהליך הוצאת הקרביים על ידי נפש או מבנים דוממים / אורגניזמים. אורכו של הזחלים, את המראה של קצוות הקדמי וגם האחורי לבין התרחשות לסייע stichosome להפלות בין סוגים שונים נמטודות 12. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig1.jpg" /> איור 1: בדיקה מיקרוסקופית של Trichinella זחלים לאחר (א) לא מספק ו (ב) שלבי שטיפה מספיק. ברי סולם עולים 100 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55354/55354fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גדול ve</a>rsion של נתון זה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig2.jpg" /> איור 2: המורפולוגיה של זיהומיים Trichinella זחלים מציגים הרקטום, Stichosome והוושט של הזחל (א). צורות אפשריות של זחלי שרירים אחרי הראה העיכול (B) מפותלות היטב מפותלות קלות העברת זחלים (C) נפרשו עד זחלים. ברי סולם עולים 100 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55354/55354fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig3.jpg" /> איור 3: דוגמאות לממצאים אגב לאחר העיכול של שרירי דוגמאות עם שיטת סטירר המגנטית. (א) זיפים דמויי שיער שלתולעת מצאה אדמת חזיר בר; (ב) Alaria Alata מן חזיר בר; (C) סיבי השריר מן חזיר בר; (ד) Metastrongylus sp. מן חזירי בר; (ה) צמח סיבים נמצאים חזיר בר (F): sp Toxocara. הזחל מן חזיר בר. ברי סולם עולים 100 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55354/55354fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples at JoVE.com

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

מניעת trichinellosis אדם במדינות רבות ברחבי העולם בוסס על בחינת המעבדה של דגימות שריר מחיות רגישות בשיטות של עיכול, מתוכם שיטת הבוחש המגנטית נחשבת תקן הזהב.

סטירר שיטה מגנטית לצורך זיהוי של<em&gt; Trichinella</em&gt; זחלים בדגימות שריר

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

magnetic-stirrer-method-for-detection-trichinella-larvae-muscle

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

28.5K Views.  Federal Institute for Risk Assessment.  מניעת trichinellosis אדם במדינות רבות ברחבי העולם בוסס על בחינת המעבדה של דגימות שריר מחיות רגישות בשיטות של עיכול, מתוכם שיטת הבוחש המגנטית נחשבת תקן הזהב. 

Video: Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to the best of these authors' knowledge, no method has been developed to allow for the in situ visualization of the 
bacteria in histological sections.
While bacterial localization has been determined in vivo in previous studies using plate counts 3, radiometric labeled 4, 
or bioluminescent bacteria 5, most of these studies have only been performed at the gross organ level, with one exception 6. This limitation 
is of particular concern because E. ictaluri has a complex infection cycle 1,7, and it has a variety of virulence factors 8,9. 
The complex interaction of E. ictaluri with its host is similar in many respects to Salmonella typhi 10, which is in the same taxonomic family.
Here we describe a technique allowing for the detection of bacteria using indirect immuno-histochemistry using the monoclonal Ed9 antibody described by Ainsworth et al.11.
Briefly, a blocking serum is applied to paraffin embedded histological sections to prevent non-specific biding. Then, the 
sections are incubated with the primary antibody: E. ictaluri specific monoclonal antibody Ed9. Excess antibodies are rinsed away and the FitC 
labeled secondary antibodies are added. After rinsing, the sections are mounted with a fluorescent specific mounting medium. 
This allowed for the detection of E. ictaluri in situ in histological sections of channel catfish tissues.

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

Here we describe a procedure allowing the labeling of Edwardsiella ictaluri in situ in histological sections from channel catfish Ictalurus punctatus using indirect immunohistochemistry with monoclonal antibodies Ed9 as a primary, and fluorescent FitC labeled antibodies as a secondary. This allowed for the detection of the bacterium using fluorescent microscopy.

השימוש פלורסנט חיסונית-לכימיה לצורך זיהוי של Edwardsiella ictaluri ב שפמנון ערוץ ( א punctatus) דגימות

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated to a microbiota dominated by a number of bacterial species, including Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, and others1-3. This condition is associated with a range of negative health outcomes, including HIV acquisition4, and it can be difficult to manage clinically5. Furthermore, diagnosis of BV has relied on the use of Gram stains of vaginal swab smears that are scored on various numerical criteria6,7. While this diagnostic is simple, inexpensive, and well suited to resource-limited settings, it can suffer from problems related to subjective interpretations and it does not give a detailed profile of the composition of the vaginal microbiota8. Recent deep sequencing efforts have revealed a rich, diverse vaginal microbiota with clear differences between samples taken from individuals that are diagnosed with BV compared to those individuals that are considered normal9,10, which has resulted in the identification of a number of potential targets for molecular diagnosis of BV11,12. These studies have provided a wealth of useful information, but deep sequencing is not yet practical as a diagnostic method in a clinical setting. We have recently described a method for rapidly profiling the vaginal microbiota in a multiplex format using oligonucleotide-coupled fluorescent beads with detection on a Luminex platform13. This method, like current Gram stain-based methods, is rapid and simple but adds the additional advantage of exploiting molecular knowledge arising from sequencing studies in probe design. This method therefore provides a way to profile the major microorganisms that are present in a vaginal swab that can be used to diagnose BV with high specificity and sensitivity compared to Gram stain while providing additional information on species presence and abundance in a semi-quantitative and rapid manner. This multiplex method is expandable well beyond the range of current quantitative PCR assays for particular organisms, which is currently limited to 5 or 6 different assays in a single sample14. Importantly, the method is not limited to the detection of bacteria in vaginal swabs and can be easily adapted to rapidly profile nearly any microbial community of interest. For example, we have recently begun to apply this methodology to the development of diagnostic tools for use in wastewater treatment plants.

We describe a multiplex method for the detection of microorganisms within a sample using oligonucleotide-coupled fluorescent beads. Amplicon from all organisms within a sample is hybridized to a panel of probe-coupled beads. A Luminex or Bio-Plex instrument is used to query each bead for bead type and hybridization signal.

Multiplex זיהוי של חיידקים דוגמאות מורכבות קלינית הסביבה באמצעות oligonucleotide מצמידים פלורסנט microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on the hypotonic lysis of erythrocytes and can be applied to human samples as well as to blood of non-human origin. The small initial sample volume of about 50 to 100 &#181;l makes this method applicable to recurrent blood sampling from small laboratory animals. Moreover, leukocyte enrichment is achieved within minutes and with low material efforts regarding chemicals and instrumentation, making this method applicable in multiple laboratory environments.
Standardized purification of leukocytes is combined with a highly selective staining method to evaluate halogenating peroxidase activity of the heme peroxidases, myeloperoxidase (MPO) and eosinophil peroxidase (EPO), i.e., the formation of hypochlorous and hypobromous acid (HOCl and HOBr). While MPO is strongly expressed in neutrophils, the most abundant immune cell type in human blood as well as in monocytes, the related enzyme EPO is exclusively expressed in eosinophils. The halogenating activity of these enzymes is addressed by using the almost HOCl- and HOBr-specific dye aminophenyl fluorescein (APF) and the primary peroxidase substrate hydrogen peroxide. Upon subsequent flow cytometry analysis all peroxidase-positive cells (neutrophils, monocytes, eosinophils) are distinguishable and their halogenating peroxidase activity can be quantified. Since APF staining may be combined with the application of cell surface markers, this protocol can be extended to specifically address leukocyte sub-fractions. The method is applicable to detect HOCl and HOBr production both in human and in rodent leukocytes.
Given the widely and diversely discussed immunological role of these enzymatic products in chronic inflammatory diseases, this protocol may contribute to a better understanding of the immunological relevance of leukocyte-derived heme peroxidases.

This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

הערכה מהירה וספציפית של פעילות Halogenating Peroxidase בדגימות דם ליקוציט מועשר

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

שיטת הדגימה ספוגית לצורך זיהוי של norovirus האדם על משטחים

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as with all these technologies, reproducible results depend on a laboratory workflow that incorporates appropriate precautions and controls. This is particularly important with low-biomass samples where contaminating bacterial DNA can generate misleading results. This article details a semi-automated workflow to identify microbes from human breast milk samples using targeted sequencing of the 16S ribosomal RNA (rRNA) V4 region on a low- to mid-throughput scale. The protocol describes sample preparation from whole milk including: sample lysis, nucleic acid extraction, amplification of the V4 region of the 16S rRNA gene, and library preparation with quality control measures. Importantly, the protocol and discussion consider issues that are salient to the preparation and analysis of low-biomass samples including appropriate positive and negative controls, PCR inhibitor removal, sample contamination by environmental, reagent, or experimental sources, and experimental best practices designed to ensure reproducibility. While the protocol as described is specific to human milk samples, it is adaptable to numerous low- and high-biomass sample types, including samples collected on swabs, frozen neat, or stabilized in a preservation buffer.

A semi-automated workflow is presented for targeted sequencing of 16S rRNA from human milk and other low-biomass sample types.

שיטה של מטוסי אף-16 יישוב רצף של דגימות חלב

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

חילוץ מהיר, בטוח, ופשוט ידנית המיטה חומצת גרעין איתור וירוס בדגימות דם מלא

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...