This work was made possible by funding from the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, 1315883) as well as by the S&#228;chsische Aufbaubank (SAB) project 100116526 from a funding of the European Regional Development Fund (ERDF).

כל הדגימות דם אדם התקבלו מתנדבים בריאים, ואת פרוטוקול העשרה לויקוציטים להחיל פועל בהתאם להנחיות של ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת לייפציג. הניסויים עם דם עכברוש אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית האחראית (Landesdirektion Sachsen, &quot;רפראט 24), על פי ההנחיות הגרמניות על טיפול בבעלי חיים ולשימוש. 1. התקנה ניסיונית הערה: ככל הליך תמוגה hypotonic עבור הדלדול של אריתרוציטים מן דגימות הדם הוא הליך קריטי בזמן, להכין את כל הציוד הדרוש (למשל, מאגרים) עבור חלק זה של הפרוטוקול מראש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל אחד 15 מיליליטר צינור צנטריפוגות במשך תמוגה hypotonic צינור דגימה אחת 1.5 מיליליטר עבור והעמסת aminophenyl עוקבת (APF) מכתים לדגימת דם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם העשרה לויקוציטים יבוצע בתנאים סטריליים, לבצע תיוג זה תחת זרםקופסא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן על 12 מ&quot;ל פוספט שנאגרו מלוחים (PBS, 10 מ&quot;מ) לדגימה. תלוי אם לויקוציטים יבודד בתנאים סטריליים או לא, להכין PBS או באמצעות פתרון מוכן סטרילי מן הספק או על ידי המסת טבליות PBS במים מזוקקים. בדוק את ערך ה- pH, ובמידת הצורך, להסתגל pH 7.4 באמצעות כמויות קטנות של 0.1 M פתרונות HCl ו NaOH. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים טבליות PBS (ראו טבלה של חומרים) ב 200 מ&quot;ל מים מזוקקים כדי להשיג פתרון חיץ שאינו סטרילי מספיק לכ 16 דגימות. אם תרצה, לעקר את הפתרון הזה על ידי סינון סטרילי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן על 1 מיליליטר תמיסת מלח מאוזן הנקס (HBSS) השלימה עם Ca 2 + לדגימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 970 מ&quot;ג מלח HBSS ב 100 מ&quot;ל (נפח סופי) מים פעמיים מזוקקים. לפני מילוי עד נפח הסופי, לבדוק את ערך ה- pH ולהתאימו pH 7.4. בשל קיבולת החיץ הנמוכה שלה, להכין חיץ זה טרי כל יוםd לבצע את התאמת ה- pH עם טיפול מיוחד באמצעות כמויות קטנות של 0.1 M HCl ו NaOH פתרונות. הערה: פתרון סטרילי ניתן להשתמש, בהתאם הניסוי. הפתרון עשוי להיות מעוקר על ידי סינון סטרילי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלבד שני מאגרים, התווית להכין צינור (למשל, 50 מ&quot;ל צינור צנטריפוגה) או בקבוק (למשל, 250 מ&quot;ל לכוס מידה) עם מים מזוקקים פעמיים עבור ההליך תמוגה hypotonic מראש. הכן על 10 מ&quot;ל מים לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן מכל עם קרח כתוש עבור מכתים APF (סעיף 3), אשר מבוצע על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן aliquots של APF מראש כדי לאפשר ההכנה המהירה של פתרונות עובדים בשימוש במהלך המכתים (שלב 3.2) וכדי למנוע מקפיא פשרה שוב ושוב של פתרון APF. הערה: APF מתקבל בכינויו 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(11.81 מ&quot;מ) פתרון המניות ב אצטט מתיל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא aliquots של 10-100 μl ב 0.5 מ&quot;ל צינורות. עבור APF מכתים סופיריכוז לצבוע של 10 מיקרומטר משמש (שלב 3.8). </li></ol></li></ol> 2. תמוגה hypotonic של אריתרוציטים הערה: בצע את שלבי תמוגה hypotonic (למעט צעדי צנטריפוגה) תחת ספסל זרימה למינרית כדי למנוע זיהום. בצע את ההליך כולו בטמפרטורת החדר. כמו תמוגה hypotonic הוא תהליך קריטי הזמן, להתאים את טפטפות מים (2 מ&quot;ל) ו PBS (5 מ&quot;ל) בנוסף מראש ולפתוח המים צלוחיות PBS לפני שתתחיל בהליך. אחסן את הפתרון PBS ואת מים מזוקקים בטמפרטורת החדר לפני השימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתוך כל העברת דגימת דם 100 μl אל הצינור 15 מ&quot;ל צנטריפוגה המתאים. הערה: בניסויים שלנו דגימות דם בדרך כלל מכילות 10 U / ml של הפרין כדי למנוע קרישה. זאת בשל מקורות שונים של החומר מדגם האופי והריכוז של הקרישה אנטי עשויים להיות שונה. השפעתו על מכתים APF צריך להיבדק על ידי comparing התוצאות לתוצאות שהושגו מדגימות דם בתוספת סוגים או ריכוזים אחרים של קרישה אנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל מים מזוקקים ומערבבים דגימות באמצעות מערבל מערבולת מוגדרת לרמה בינונית. דגירה דגימות עבור 60 שניות, ולאחר מכן להוסיף 5 מ&quot;ל PBS לדגימה ומערבבים בעזרת מערבל מערבולת. הערה: עד כ -5 דוגמאות ניתן להכין במקביל. לשמור על הסדר המדגם זהה עבור התוספת של מי PBS להשיג פעמי דגירה דומות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההתחדשות של תנאים איזוטוני על ידי תוספת PBS (שלב 2.2) גלולה תאים שלמים שנותרו כל הדגימות על ידי צנטריפוגה במשך 6 דקות בטמפרטורת החדר ו- g x 450. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant על ידי שפיכה אותו לפח פסולת שולחן. להסיר כמה שיותר נוזלים ככל האפשר על ידי צינור היפוך צנטריפוגה קשה על זה שפונה אל מגבת נייר. ודא כי התא גלולה יבש ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך תמוגה hypotonic כפי שתואר קודם לכן (שלב 2.2). NOTE: בעיקרון זה הליך תמוגה hypotonic (שלבי 2.3 עד 2.5) יוכל לחזור על עצמו יותר מפעם אחת, תלוי הטוהר של שבר לויקוציטים מעורב כדי להתקבל. לאחר שני תמוגה צעדי חלקיו של נותרים אריתרוציטים בשבריר התא המעורב המתקבל הוא כ -25%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת התאים השלמים שנותרו על ידי צנטריפוגה במשך 6 דקות בטמפרטורת החדר ו- g x 450. הסר את supernatant (ראה שלב 2.4). הוסף 500 μl HBSS כדי גלולה בעדינות לפזר אותו עד למציאת פתרון הומוגני מתקבל. העברת כל מדגם צינור 1.5 מ&quot;ל מדגם ולסמן אותם בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם הניסוי לנתח דגימות שהתקבלו ישירות (למשל, באמצעות cytometry זרימה) 25, כתם עם נוגדנים שכותרתו פלואורסצנטי (לזיהוי סוגי תא בודדים) 32, דגירה עם גירויי תא (לניסויי הפעלת תא) 33 או מאוחסן על קרח ושימוש יותר מאוחר. בהתאם מטרת המחקר, מיד לבצע ניסויים מאוחרים יותר עליש שבר לויקוציטים מעורב מאז גרנולוציטים קצר למדי מחצית חיים של כ -20 שעות. הערה: זה נכון גם לגבי מכתים peroxidase הפעולה המפורט להלן. </li></ol> 3. Halogenating Peroxidase פעילות מכתים הערה: HOCl- ו HOBr הייצור ידי peroxidases heme נגזר-דם MPO ו EPO היא לכמת באמצעות APF, אשר הוא מתחמצן ל והעמסת ידי חומצות hypohalous בשם. לכן אם תיוג תא עם נוגדנים שכותרתו קרינה מבוצע בשילוב עם מכתים APF, להימנע fluorophores כי להפריע לאות הפליטה וההעמסה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מכתים APF ב 4 ° C על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכנת פתרון עבודה של APF להפשיר aliquot המתאים של צבע (למשל, 10 μl, 11.81 מ&quot;מ) ו לדלל אותו עם HBSS בדיוק 1 מ&quot;מ (למשל, להוסיף 108.1 חיץ μl אל 10 μl). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה (500 פתרון התא μl) להכין 5 μl של הפתרון עובד APF תיאר. בהתאם לכך, השתמש באחת 10 aliquot μl של APF (11.81 מ&quot;מ), אשר מניב 118.1 הפתרון עובד APF μl (1 מ&quot;מ) כדי להכין כ -20 דגימות. בשל אובדן במהלך pipetting להכין כ -10% יותר פתרון APF עובד מ מחושב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק את הספציפיות peroxidase של מכתים APF, להכין דגימות בקרה עם hydrazide חומצה 4-aminobenzoic מעכב peroxidase heme (4-ABAH) 35. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות 1 M של 4-ABAH (151.17 g / mol) ב sulfoxide דימתיל (DMSO) על ידי דילול 75.6 מ&quot;ג 4-ABAH ב 500 μl ממס. בהמשך לדלל 4-ABAH 1/10 ב HBSS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעריכת תווית פתרון H 2 O 2 עבודה שני צינורות 1.5 מ&quot;ל צנטריפוגה עם &quot;70 מ&quot;מ H 2 O 2&quot; ו &quot;7 מ&quot;מ H 2 O 2&quot;, בהתאמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור שכותרתו &quot;70 מ&quot;מ H 2 O 2&quot;, לדלל טרי 10 μlשל פתרון המניות 30% (8.8 מ&quot;מ) של H 2 O 2 באמצעות 990 μl מים מזוקקים כדי לקבל ריכוז של כ -88 מ&quot;מ. חנות על הקרח ולהשתמש תוך 4 שעות. הערה: H 2 O 2 מועברת בדרך כלל כפתרון מניות 30% על ידי הספקים. כאשר מאוחסנים 4 ° C, הוא יציב במשך כ -3 שנים. בצע דילולים של H 2 O 2 במים מזוקקים כדי למנוע ריקבון. H 2 O 2 דילולים יכולים גם להיות מוכנים ב 0.1 פתרון M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקביעת ריכוז מדויק H 2 O 2 להכין דילול 1 עד 10 עוד מפתרון המניות הראשונה H 2 O 2 (כ -88 מ&quot;מ) על ידי הוספת 100 μl מפתרון זה ל -900 μl מים מזוקקים בצינור 1.5 מ&quot;ל שכותרתו &quot;7 מ&quot;מ H 2 O 2&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלט ספקטרום בטווח UV ליד (למשל, 200-300 ננומטר) באמצעות פוטו UV-Vis ולהשתמש את הספיגה ב 240 ננומטר (49; 240 = 34 M -1 cm -1) כדי לקבוע את ריכוז בפועל H 2 O 2 בתמיסת המניות השנייה H 2 O 2 34. ודא קובט הפניה מכיל מים מזוקקים בלבד. עבור cuvettes קוורץ שימוש מדידה כמו ספקטרום בטווח UV נרשם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתוצאה זו, לחשב את הריכוז המדויק של שני פתרונות מניות H 2 O 2. התאם את הריכוז של פתרון המניות הראשון במדגם צינור &quot;70 מ&quot;מ H 2 O 2&quot; בדיוק 70 מ&quot;מ על ידי הוספת כמות מתאימה של מים מזוקקים. אחסן את הפתרון עובד המתקבל על קרח ולהשתמש תוך שעה אחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של הפתרון עובד 4-ABAH (100 מ&quot;מימ) על הדגימות המתאימות לריכוז סופי של 1 מ&quot;מ. דגירת הדגימות במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחממה לפני כן APF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 הפתרון עובד APF μl (1 מ&quot;מ) לכלמדגם 500 μl כדי להשיג ריכוז לצבוע סופי של 10 מיקרומטר. מערבב את הדגימות בעדינות (למשל, על ידי שימוש מערבל המערבולת על הגדרה בינונית) דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl H 2 O פתרון עובד 2 (70 מ&quot;מ) מדגם 500 μl ריכוז סופי של 700 מיקרומטר. בעדינות מערבבים את דגימות דגירה אותם במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בצע מדידות בקרה נאותות במקביל. הערה: מדידות בקרה הראה כי 700 מיקרומטר H 2 O 2 אינם רעילים עבור התאים. גם לא היו כל תגובות הסלולר משמעותיות ציינו. הערה: מכתים APF יכול גם להתבצע על ידי השמטת התוספת של H 2 O 2, תלוי בשאלה המדעית. בהיעדר חמצן מימן MPO chlorinating הבזליים רק ופעילות EPO נקבע תוך התוספת של H 2 O 2 מאפשרת זיהוי של ייצור HOCl ו HOBr המקסימאלי על ידי התאים. Tהוא אחרון פירושו אות ניאון גבוהה משמעותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת pelleting התאים, צנטריפוגות את הדגימות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר 400 x גרם. ביסודיות להסיר את supernatant מבלי להרוס את הגלולה ולהוסיף 250 μl HBSS כדי resuspend תאים. הערה: הדגימות מוכנות כעת לניתוח באמצעות זרימת cytometry 25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הדגימות בחושך עד לניתוח כדי למנוע הלבנה. לאחר עירור ב 480-490 ננומטר לזהות את פליטת והעמסת בסביבות 525 37 ננומטר. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כפי נויטרופילים הם לויקוציטים הנפוצים ביותר בדם אנושי הבידוד של תאים חיוביים peroxidase לעתים קרובות מתמקד רק תאים אלה וכולל הפרדה של נויטרופילים מ לויקוציטים אחרים על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות 38. עם זאת, כפי נויטרופילים הם הרבה פחות בשפע בדגימות דם בעכברים 39 עבור השיטות מורכבות יותר האחרונות צריכים לשמש 40. יתר על כן, בשני השיטות גם להביא להעברתם של מונוציטים חיוביים peroxidase ממדגמים ו, בשל הצורך של כרכי דם גדולים יותר (למשל, 400 μl 41), אינם ישימים מייקרו דגימות שהתקבלו במהלך דגימת דם חוזרת ונשנית בחיות מעבדה קטנות 38,40. טיהור של נויטרופילים בעכברים מ תפליט הצפק גם צריך הקרבת חיות, ויתרה מזאת, לא להיכנע גרנולוציטים דם הנגזרות 38,40. לאחרונה פיתח שיטות להשיג שברים גרנולוציט מטוהרים מן bl murineood (למשל, היישום של נוגדנים) הם בדרך כלל יקר, מסובך וגוזל זמן 40,42,43 ושוב רק להתמקד טיהור מסוג לויקוציטים peroxidase-חיובי אחד. לכן השיטה המוצגת כאן יש כמה יתרונות על פני שיטות אחרות מועמדותן הטיהור של לויקוציטים peroxidase חיובי. כפי שהוא מבוסס על דגימות דם קטנות תאי המתקבלים מייצגים את המצב במחזור הדם. בשל היקף המדגם הראשוני הקטן הדרוש פרוטוקול השיטה ישימה הוא אדם ודם שאינו בני אדם, למרות ההבדלים ספציפי מינים בשפע של נויטרופילים. למעשה, אנחנו אפילו הצלחנו ליישם את השיטה המתוארת ראשוני כרכי דם קטנים כמו 50 μl (מידע לא מוצג). מדגם הדם הקטן הדרושים השיטה גם הופך אותו מתאים נסיגת דם חוזר ונשנית מצד בחיות מעבדה קטנות או ליישומים רפואיים מיוחדים (למשל, אבחנת יילוד). כמו tהוא העשרה לויקוציטים מבוססת על הדלדול של אריתרוציטים כל תאי peroxidase-חיובי (נויטרופילים, אאוזינופילים, מונוציטים) כלולים בשבריר לויקוציטים המעורב מתקבל ניתן לנתח בנפרד באמצעות cytometry זרימה. השיטה היא מהירה, אמינה ויש לו דרישות נמוכות לגבי כימיקלים ומיכשור, מה שהופכים את הפרוטוקול מתאים לסביבות מדעים מרובות. כפי נויטרופילים מופעלים בקלות צעד אחד קריטי במהלך השיטה המתוארת הוא ההתאמה המדויקת של ערך ה- pH של תמיסות בופר בשימוש (PBS ו HBSS, ראה צעדים 1.2 ו -1.3 של סעיף הפרוטוקול). זאת ועוד זמן הדגירה של תאי דם עם מים מזוקקים צריך להיות לא יותר מ -60 שניות לפני שחזור תנאי normosmotic (ראו שלב 2.2 של סעיף הפרוטוקול. (כמעט) ההסרה לחלוטין ממס מן התא הגלול (שלב 2.4) לפני התוספת מים עבור תמוגה hypotonic השנייה הוא עוד שלב קריטי כמו חובבשאריות אה תקטנה את היעילות של הליך תמוגה hypotonic. עוד צעד קריטי מתייחס לבקשה של H 2 O 2 במהלך מכתים APF. למרות הסכום מיושם לא צריך להיות ציטוטוקסיות, חיוניות תא צריכות להיבדק. במהלך לימודינו אנו בדרך כלל להחיל את צבע 5,5 &#39;, 6,6&#39;-tetrachloro-1,1 &quot;, 3,3&#39;-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine יודיד (JC-1) לצורך זיהוי של אירועים אפופטוטיים מוקדם. יתר על כן, יש כמה מגבלות בשיטת העשרה לויקוציטים פשוטה תארה. בעוד הטכניקה ניתן ליישם דגימות דם מכמה מינים (בחור, חולדה ועכבר נסים), הכמות לויקוציטים שהושגה לאחר תמוגה של אריתרוציטים תלוי השפע הראשוני שלהם בדם. האחרון בהחלט משתנה בין המינים 39, והוא גם תלוי מצב דלקתי של הפרט נחקר. יתר על כן, בעוד הליך תמוגה אפשר לעשות עם עד אחדמאות דגימות במקביל הצעדים צנטריפוגה ביניים מהווים הגבלה, תלוי צנטריפוגות בשימוש, רק עד 30 דגימות יכול להיות מעובד במקביל. יתר על כן, בעוד APF בקלות מזהה HOCl ו HOBr בנוכחות SCN -, פעילות halogenating של MPO ו EPO משפיע גם על-הליד פסאודו האחרון. ובכך hypothiocyanite (- OSCN) נוצר אשר אינו מסוגל לחמצן APF. מגבלה נוספת נובעת המאפיינים של צבע APF המשמש לקביעת HOCl- ו HOBr-ייצור על ידי MPO ו EPO. כמו הצבע הוא מתחמצן ל והעמסה, המכתים לא ניתן לשלב עם נוגדני ניאון עם פליטת ספקטרום באותו הטווח. כמובן כל התערבויות שבין קרינת APF הנגזרות ואת האות של אותות ניאון נוספים להיבדק ופיצו על בזרימת cytometer. אחרת, אם זיהוי של פעילות peroxidase halogenating אינו היקףללמוד, לאחר יישום שיטת האזילה הכדורית שיטות אנליטיות אחרות עשויות לשמש במקום APF. ככל הליך תמוגה hypotonic תאר מוביל רק דלדול חלקי של אריתרוציטים וכפי כל לויקוציטים עדיין קיים בשבריר התא מעורב שהושג, רק שיטות המאפשרות ניתוח תא בודד צריך להיות מיושם. שיטות הכוללות את תמוגה של תאים (למשל, ניתוח העלילה המערבי) לא תניב תוצאות אמינות. היקף המדגם הראשוני הקטן עשוי להיות מכשול נוסף לשיטות אנליטיות כאלה. לגבי התחקיר של MPO (ו EPO) פעילות לויקוציטים לעתים קרובות רק את ייצור החמצון הכללי של התא מופנה במקום הערכת פעילות peroxidase heme במיוחד 44,45. יתר על כן לעתים קרובות לא נעשים ניסיונות להבחין בין halogenating ואת פעילות peroxidase של MPO ו EPO 46,47. שיטות, אשר להתייחס ספציפית פעילות MPO chlorinating ידי quantifying מוצרים שמקורם HOCl כמו chlorotyrosine אינם מזהים יתר חמצון ו / או מטבוליזם מוצרים, ולכן לעתים קרובות להוביל הערכה נמוכה מדי של 48 HOCl הייצור האמיתי. יתר על כן שיטה זו כמו גם זיהוי של HOCl נגזר 2-chloroethidium הם גם זמן רב, צריך ציוד אנליטי יקר וכוללים תמוגה של תאי 48-50 .There דיווחים רבים על צבעים חדשים עבור הקביעה הספציפית של פעילות chlorinating MPO בתוך תאים חיוניים 44,51,52. עם זאת עד כה רק APF ו והעמסת hydroxyphenyl מתחם הקשורים אליה (HPF) זמינים מסחרית ולכן בשימוש שגרתי במחקר 25,33. למעשה, באמצעות APF נוכל להראות שפעילות MPO chlorinating לא ניתן לכמת רק באמצעות האנזים מבודד 53 אלא גם על ידי החלת צבע לתאים חיים 26,33. כך על ידי שילוב של העשרה לויקוציטים מהירה-דגימות מיקרו הדם כאמור לעיל עםn מכתים APF פתחנו פרוטוקול, אשר מתאים במיוחד ובמקביל לטפל בפעילות halogenating של MPO ו EPO בכל לויקוציטים החיובי peroxidase, כלומר, נויטרופילים, מונוציטים ו אאוזינופילים 32. יתר על כן השיטה אינה דורשת תמוגה התא, המאפשר מגוון רחב של שיטות אנליטיות, כולל cytometry זרימה מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. יתר על כן מכתים פעילות peroxidase זה יכול להיות בשילוב עם יישום של סמנים פני התא, המאפשרת ניתוח פרטני של שברים תת לויקוציטים, בהתאם למשימה מדעית. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי נוגדני קרינה שכותרתו השימושיים לא להפריע לאות קרינה המבוססת-והעמסה בשימוש לכמת את HOCl- ו HOBr הנגזר חמצון APF. לסיכום שיטה זו עשויה לספק כלי חדש כדי לקבל תובנות יותר לתוך התפקיד הפיזיולוגי של פעילות peroxidase halogenating של מחדש אימונולוגיתperoxidases הלבנט הנגזרות דם MPO ו EPO, אשר עדיין אינו מובן היטב 8,20,23. יתר על כן במחקר בבעלי חיים על דלקת מפרקים שגרוניות נוכל להתבונן לאחרונה כי פרוטוקול זה עשוי להוביל בהערכת ייצור HOCl MPO הנגזר כסמן קליני חדש ב מחלות דלקתיות כרוניות (נתונים שלא פורסמו).

לויקוציטים polymorphonuclear (PMNs, המכונה גם גרנולוציטים) ומונוציטים מייצגים מרכיבים תאיים חשובים של מערכת החיסון המולדת של 1,2 דם. הם לתרום להגנה העיקרית נגד פתוגנים כמו גם ההפעלה של מערכת החיסון הנרכשת ואת החניכה של תגובה סיסטמית דלקתית 2-4. זאת במיוחד נויטרופילים, הסוג הנפוץ ביותר של גרנולוציטים, מונוציטים ו גם לתרום באופן משמעותי ברגולצית סיום האירועים דלקתיים חריפים 5. לכן תאים אלה יכולים גם לשחק תפקיד חשוב במחלות דלקתיות כרוניות כמו 6,7 דלקת מפרקים שגרונית. למעשה, אסטמה, מחלה דרך נשימה דלקתית כרונית, מתאפיין אפופטוזיס לקוי של אאוזינופילים, סוג גרנולוציט השני הכי בדם 8. עם זאת, אפופטוזיס של גרנולוציטים וההסרה המהירה שלהם על ידי מקרופאגים הם שני צעדים חיוניים במהלך הסיום הסלולרשל דלקת 9-11. בתאים בשם החיסון שני אנזימים קשורים זה לזה, כלומר myeloperoxidase (MPO, נויטרופילים ומונוציטים) ו peroxidase אאוזינופילים (EPO, אאוזינופילים) ניתן למצוא 12,13. Peroxidases heme אלה קשורים באופן קלאסי לתגובה הלחות החיסונית: הם שני-אלקטרונית לחמצן (פסאודו) הלידים אל (פסאודו) היפו המתאים חומצות halous אשר ידועים בתכונות bactericidal שלהם 14-16. בתנאים פיסיולוגיים צורות MPO בעיקר חומצת hypochlorous (HOCl) ו hypothiocyanite (- OSCN) בעוד החומצה האחרונה ו hypobromous (HOBr) נוצרת על ידי EPO 17-19. תוצאות חדשות מרמזות כי (פסאודו) זו פעילות אנזים halogenating עשויה גם לתרום הסדרת תגובות דלקתיות של סיום הכהונה של תגובות חיסוניות 20,21. למעשה, הפקת HOCl ידי MPO ומוצרי שמקורם הוצגה לדכא מבוסס תאי T תגובות אדפטיבית חיסוניות 22-24. על מנת לקבל יותר תובנות לתוך התפקיד החיסוני של לויקוציטים ממערכת החיסון המולדת ב מחלות דלקתיות כרוניות ולקבוע את תרומת MPO ו EPO כדי תפקוד פיזיולוגי זה פיתחנו שיטה להעשיר לויקוציטים במהירות מדגימות דם קטנים למשך ספציפיים הבאים קביעת פעילות peroxidase halogenating בתאים אלה. דלדול כדורי בחרנו שיטה סטנדרטית כולל צעדי תמוגה hypotonic שני שלאחר מכן עם מים מזוקקים, מה שמוביל העשרה לויקוציטים מהיר ובעלויות חומר נמוכות. לקביעה הבאה של MPO halogenating ופעילות EPO והעמסת aminophenyl לצבוע HOCl- ו HOBr הספציפי (APF) שמשה 25-27. בניגוד יישום השיטות המכתימות peroxidase נוקב 28,29, גישה זו מאפשרת זיהוי סלקטיבי של פעילות peroxidase halogenating, אשר נפגע לעתים קרובות infl החמורהammation 30,31.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="738">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">materials/equipment</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">15 ml centrifugation tubes</td>
			<td style="width:203px;">VWR/Corning</td>
			<td style="width:120px;">734-0451</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">1.5 ml sample tubes</td>
			<td style="width:203px;">VWR/Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">211-2130DE</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:213px;">Pipettes for volumes up to 5 ml</td>
			<td style="width:203px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">e.g. 3120000070</td>
			<td style="width:203px;">We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 &#181;l, 10-100&#181;l, 100-1000 &#181;l an 500-5000&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">laminar flow bench</td>
			<td style="width:203px;">Thermo Electron Corperation</td>
			<td style="width:120px;">HeraSafe</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:203px;">Bender &#38; Hobein AG</td>
			<td style="width:120px;">Vortex Genie 2</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tabletop centrifuge</td>
			<td style="width:203px;">Kendro Laboratory Products</td>
			<td style="width:120px;">Laborfuge 400R</td>
			<td style="width:203px;">The centrifuge should be able to be used at 450x g</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Small centrifuge</td>
			<td style="width:203px;">eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">5415D</td>
			<td style="width:203px;">The centrifuge should be able to be used at 400x g</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Incubator</td>
			<td style="width:203px;">Heraeus</td>
			<td style="width:120px;">cytoperm 2</td>
			<td style="width:203px;">Settings: 37 &#176;C, 95% humidity, 5 % CO2 content</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:203px;">Varian</td>
			<td style="width:120px;">Cary 50 bio</td>
			<td style="width:203px;">A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Flow cytometer</td>
			<td style="width:203px;">Becton, Dickinson</td>
			<td style="width:120px;">BD Facs Calibur</td>
			<td style="width:203px;">Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g 488 nm argon laser)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:203px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Chemicals</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:203px;">amresco</td>
			<td style="width:120px;">K812</td>
			<td style="width:203px;">sterile solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;"></td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P4417</td>
			<td style="width:203px;">tablets for solving in 200 ml millipore water</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca(2+)</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">H1387</td>
			<td style="width:203px;">970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:203px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:120px;">1.09057.1000</td>
			<td style="width:203px;">1M solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:203px;">Riedel-deHa&#235;n</td>
			<td style="width:120px;">30620</td>
			<td style="width:203px;">Solid pellets. For a 1M solution solve 4 g/100 ml Millipore water</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:213px;">Aminophenyl fluorescein</td>
			<td style="width:203px;">Cayman</td>
			<td style="width:120px;">10157</td>
			<td style="width:203px;">5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquotes of e.g. 100 &#181;l should be prepared and stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:213px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">H1009</td>
			<td style="width:203px;">This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:213px;">4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH)</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A41909</td>
			<td style="width:203px;">A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">DMSO</td>
			<td style="width:203px;">VWR chemicals</td>
			<td style="width:120px;">23500.26</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast and specific assessment of the halogenating peroxidase activity in leukocyte-enriched blood samples

במאמר זה פרוטוקול להעשרה המהירה ואחידה של לויקוציטים מדגימים דם קטן שלם מתואר. הליך זה מבוסס על תמוגה hypotonic של אריתרוציטים וניתן להחיל דגימות אנושיות וכן דם ממקור לא אנושי. היקף המדגם הראשוני הקטן של כ 50 עד 100 μl עושה בשיטה זו החלימה על דגימת דם חוזרת ונשנית בחיות מעבדה קטנות. יתר על כן, העשרה לויקוציטים מושג בתוך דקות ועם מאמצי חומר נמוכים לגבי כימיקלים ומיכשור, מה שהופך שיטה זו ישימה בסביבות מעבדה מרובה. טיהור סטנדרטי של לויקוציטים הוא בשילוב עם שיטת מכתים בררנית במיוחד לשם הערכת הפעילות peroxidase halogenating של peroxidases heme, myeloperoxidase (MPO) ו peroxidase אאוזינופילים (EPO), כלומר, היווצרות של hypochlorous וחומצה hypobromous (HOCl ו HOBr). בעוד MPO לידי ביטוי בולט neutrophils, סוג תא החיסון הנפוץ ביותר בדם אנושי וכן מונוציטים, האנזים הקשור EPO מתבטא באופן בלעדי אאוזינופילים. פעילות halogenating של אנזימים אלה מופנה באמצעות כמעט HOCl- ו HOBr ספציפי וההעמסה לצבוע aminophenyl (APF) ואת מי חמצן מצע peroxidase העיקרי. לאחר ניתוח cytometry זרימת לאחר כל התאים peroxidase-חיובי (נויטרופילים, מונוציטים, אאוזינופילים) וניתן להבחין ופעילות peroxidase halogenating שלהם ניתן לכמת. מאז מכתים APF ניתן בשילוב עם יישום של סמנים פני התא, פרוטוקול זה יכול להתארך להתייחס-שברים תת לויקוציטים במיוחד. השיטה ישימה לזהות HOCl ו HOBr ייצור הוא אדם והן לויקוציטים מכרסמים. לנוכח התפקיד החיסוני דן בהרחבה מגוונת של מוצרים האנזימטית אלה במחלות דלקתיות כרוניות, פרוטוקול זה עשוי לתרום להבנה טובה יותר שלהרלוונטיות אימונולוגיים של peroxidases heme הנגזרות לויקוציטים.

<html> כפי שדווח בעבר השיטה המתוארת לעיל התבררה לחול הן אדם וכדי לא אנושי חומר 32. יתר על כן, כפי שמוצג על עכברים עם סימפטומים אסתמטיים המכתים APF עשוי להיות כלי מתאים כדי לזהות הבדלים במעמד פרו-הדלקתי המערכתי. לכן במחקר שלאחר מכן השתמשנו בפרוטוקול זה שוב ושוב להעריך את פעילותו halogenating של MPO (ו EPO) בחולדות נקבות Dark agouti עם דלקת הנגרמת pristane (PIA). דוגמה מייצגת של העשרת לויקוציטים והכתים שבוצעו במהלך ניסוי זה מוצג באיור 1. כ -200 μl כולו דם התקבל מקלעת ורידית retrobulbar של החיה תחת הרדמה heparinized. הדלדול הכדורי ו המכתים בא APF בוצעו באמצעות 100 נפחי דגימת μl. לאחר מכן המדגם נותח על ידי cytometry הזרימה. her.within-page = &quot;1&quot;&gt; כפי שניתן לראות על ידי התוויית גודל תא מול גרעיניות תא (איור 1 א), דלדול חזק של אריתרוציטים מהדגימה הושגה. זאת ועוד סוגים לויקוציטים שונים ניתן היה להבחין בבירור, אשר זוהו על ידי החלת סמנים פני התא שכותרתו פלואורסצנטי (לא מוצג). בקצרה את כדורית (CD235a חיובי) / תא פסולת באזור היוו רק 22% של אירועים תוך כ -48% מהמקרים שעליהם זוהו נויטרופילים CD16 חיובי. זאת ועוד 3% מהמקרים שעליהם כל זוהו אאוזינופילים CCR3-חיובי מונוציטים חיובית-CD14 וכ -19% מהמקרים שעליהם היוו CD5 / B CD19 חיובי ו לימפוציטים מסוג T, בהתאמה. חלוקת עוצמת קרינת APF הנגזרת (האיור 1B) בבירור מותר אפלית אריתרוציטים peroxidase השלילי לימפוציטים בעוד מונוציטים ו אאוזינופילים הובילו חמצון APF מתון נויטרופילים הביעו דעה נחרצת peroxidase חיוביים תחת chתנאי הניסוי אוסן. תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם השפע הגבוה של MPO בתאים האחרונים לעומת ריכוז האנזים מונוציטים 20. התגובה החלשה היחסי של אאוזינופילים יכולה להיות מוסברת על ידי העובדה, שאף ברומיד נוספה, שאולי מתבקשת היווצרות נגזרות EPO של HOBr. מחקרים ראשוניים על אאוזינופילים מבודדים באופן מפתיע לא הראו השפעה גדולה של ברומיד הוסיף חיצוני על חמצון APF על ידי תאים אלו. ובכל זאת, חמצון של APF ידי אאוזינופילים נצפו אשר עשוי להיות מוסבר על ידי ההקדמה של כמויות קטנות של Br - באמצעות פתרונות החיץ בשימוש (PBS ו HBSS). לחלופין EPO עשוי גם מייצרים כמויות קטנות של HOCl, לפחות בתנאים חומציים (למשל, ב phagolysosomes). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54484/54484fig1.jpg" /> איור 1: העשרה ליקוציט APF-לגזורהקרינה ד בתוך מיקרו-דגימת דם חולדה. סכום של כ -200 μl כולו דם התקבל מקלעת ורידית retrobulbar של עכברוש Dark agouti הנשי. לאחר יישום נוהל המוליזה תאר 100 דם μl וכן APF הבא מכתים את שבר התא המעורב נותח על ידי cytometry זרימה. כפי שמוצג על ידי FSC- / SSC- המגרש (א) אריתרוציטים היו מתרוקנים בחום מהדגימה, סוגי לויקוציטים השונים יכולים בקלות להיות מכובדים. חלוקת עוצמת הקרינה הנגזרת APF (B) הראתה בבירור heme peroxidase השלילי תאים (אריתרוציטים ו לימפוציטים) וכן לויקוציטים עם מתונה (אאוזינופילים מונוציטים) או חזקים (נויטרופילים) פעילות peroxidase halogenating. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54484/54484fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples at JoVE.com

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

הערכה מהירה וספציפית של פעילות Halogenating Peroxidase בדגימות דם ליקוציט מועשר

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

fast-specific-assessment-halogenating-peroxidase-activity-leukocyte

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.2K Views.  University of Leipzig. This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

Video: Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

דלדול של אוכלוסיות תאים ספציפיים על ידי דלדול משלים

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

טיהור אוכלוסייה תאים ספציפיים על ידי מיון פלואורסצנטי תא פעיל (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

קביעת פעילות Phagocytic דוגמאות של נוגדן קלינית

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome. Aging is associated with an increased susceptibility to viral and bacterial infections and decreased responsiveness to vaccines with a well-documented decline in humoral as well as cell-mediated immune responses1,2. We have recently assessed the effects of aging on Toll-like receptors (TLRs), key components of the innate immune system that detect microbial infection and trigger antimicrobial host defense responses3. In a large cohort of healthy human donors, we showed that peripheral blood monocytes from the elderly have decreased expression and function of certain TLRs4 and similar reduced TLR levels and signaling responses in dendritic cells (DCs), antigen-presenting cells that are pivotal in the linkage between innate and adaptive immunity5. We have shown dysregulation of TLR3 in macrophages and lower production of IFN by DCs from elderly donors in response to infection with West Nile virus6,7. 
Paramount to our understanding of immunosenescence and to therapeutic intervention is a detailed understanding of specific cell types responding and the mechanism(s) of signal transduction. Traditional studies of immune responses through imaging of primary cells and surveying cell markers by FACS or immunoblot have advanced our understanding significantly, however, these studies are generally limited technically by the small sample volume available from patients and the inability to conduct complex laboratory techniques on multiple human samples. ImageStream combines quantitative flow cytometry with simultaneous high-resolution digital imaging and thus facilitates investigation in multiple cell populations contemporaneously for an efficient capture of patient susceptibility. Here we demonstrate the use of ImageStream in DCs to assess TLR7/8 activation-mediated increases in phosphorylation and nuclear translocation of a key transcription factor, NF-&kappa;B, which initiates transcription of numerous genes that are critical for immune responses8. Using this technology, we have also recently demonstrated a previously unrecognized alteration of TLR5 signaling and the NF-&kappa;B pathway in monocytes from older donors that may contribute to altered immune responsiveness in aging9.

We describe use of ImageStream technology (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank">www.amnis.com</a>), which combines quantitative flow cytometry with simultaneous high-resolution digital imaging, to quantify cellular mechanisms of primary immune cells from well-defined patient cohorts. Our studies provide a blueprint for translational investigations to quantify lineage specific cellular responses in small samples from subject cohorts.

הדמיה כמותי של שושלת ספציפית חיוג כמו קולטן בתיווך איתות מונוציטים ותאים דנדריטים של דגימות קטנות של דם אנושי

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

ניתוח תזרים Cytometric נ בית נכנס חלקיקים 1 האלרגנים PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

לתוספי משפר את היעילות התמרה חושית Lentiviral של תאי NK העיקרי מאתר ואנושי

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode larvae of the genus Trichinella. The most important sources of human infections worldwide are game meat and pork or pork products. In many countries, the prevention of human trichinellosis is based on the identification of infected animals by means of the artificial digestion of muscle samples from susceptible animal carcasses.
There are several methods based on the digestion of meat but the magnetic stirrer method is considered the gold standard. This method allows the detection of Trichinella larvae by microscopy after the enzymatic digestion of muscle samples and subsequent filtration and sedimentation steps. Although this method does not require special and expensive equipment, internal controls cannot be used. Therefore, stringent quality management should be applied throughout the test. The aim of the present work is to provide detailed handling instructions and critical control points of the method to analysts, based on the experience of the European Union Reference Laboratory for Parasites and the National Reference Laboratory of Germany for Trichinella.

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

The prevention of human trichinellosis in many countries worldwide is based on the laboratory examination of muscle samples from susceptible animals by methods of digestion, of which the magnetic stirrer method is considered the gold standard.

סטירר שיטה מגנטית לצורך זיהוי של<em&gt; Trichinella</em&gt; זחלים בדגימות שריר

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...