אנו מודים כריסטין Kerschbamer, תומאס Letschka, סבין Oettl, מרגוט Raffeiner, ופלוריאן Senoner ממרכז המחקר Laimburg ו Mirelle בורחס Dias Schnetzer מ Dualsystems ביוטק AG לתמיכה טכנית ג&#39;וליה סטרובל להגהה את כתב היד. עבודה זו בוצעה כחלק הפרויקט APPL2.0 ו מומנה בחלקה על ידי המחוז האוטונומי של בוזן / Bolzano, איטליה ואת Consortium אפל דרום-טירולי.

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

במסך Y2H, החלבון מפעיל הפוטנציאל הוא שיתוף הביע עם חלבונים אינטראקציה היפותטי שונים (שלב 7). כל כפיל שמרים גדל מכיל את הפיתיון אלא interactor שונה (בפוטנציה). חלבוני האינטראקציה מקודדים בתוך ספריית cDNA כי הוא משובט לתוך פלסמידים טרף. הפיתיון ואת טרף פלסמידים כל קוד שיתוף cistronically עבור חלק גורם שעתוק שמרים. במקרה של אינטראקציה פיזית בין הפיתיון (מפעיל) וכן interactor פלסמיד מקודד טרף, חלקים גורמים שני שעתוק (התחום מחייב DNA ואת תחום ההפעלה) מאוחדים, וביטוי גן הכתב מושרה. השמרים הם מסוגלים לגדול על צלחות מבחר histidine- ו אדנין המדולדל SD. הסוג של ספריית cDNA טרף תלוי המפעיל הוקרן צריך להיבחר בהתאם. וקטור טרף פיתיון, כמו גם זן השמרים, חייב להיות תואם. במסך זה, ה- DNA LexA מחייב מושלם ואת domai ההפעלה Gal4n שמש יחידות גורמות שעתוק שמרים התואמות. ספריית cDNA ניתן לבנות בנפרד, בהתאמה אישית, או שהושג באופן מסחרי. הכנת ספריית טרף cDNA אינה חלק של פרוטוקול זה. בפרוטוקול זה, ספריית cDNA בהקמה עצמית, מנורמלת מן RNA של עלי domestica x Malus שמשה ו משובטת לתוך pGAD-HA 41. המפעיל (פיתיון) -expressing זן שמרים הפך עם הספרייה הטרפה, ומשכפל נבחר על צלחות מבחר histidine- ו אדנין המדולדל SD. כדי לחלץ DNA פלסמיד מן המושבות שמרים, ערכת מיני פלסמיד דנ&quot;א טור לחיידקים מומלץ בשילוב עם צעד הפרעה מכנית באמצעות חרוזי זכוכית לשפר תמוגה שמרים (שלב 8). בשנת טיהור פלסמיד זה, את הפיתיון וקטור טרף יהיה מטוהרים במקביל בריכוזים נמוכים יחסית. עם זאת, כמות ה- DNA פלסמיד הוא מספיק כדי לזהות את השותף אינטראקציה באמצעות שנינות רצףHout לפני התפשטות פלסמיד (שלב 8.4). כחלופה, ה- DNA מטוהר בשלב 8.4 ניתן להפוך חיידק מוכשר שנבחר עם עמידות לאנטיביוטיקה בתיווך וקטור טרף (למשל, אמפיצילין במקרה של pGAD-HA). .ה שנבחרה coli מושב לשאת רק את הפלסמיד ספריית pGAD-HA, וטיהור פלסמיד תשואה גבוהה יכולה להתבצע עם שיבוטים אלה. השינוי המוצלח של pLexA-N ו- pGAD-HA בונה משלים את טריפטופן לאוצין auxotrophy של NMY51. אינטראקציה בין המפעיל לבין חלבון (מקודד על pGAD-HA) מוביל ההפעלה של מערכת כתב NMY51 זנים. במקרה של הפעלה עצמית, NMY51 טרנספורמציה עם המפעיל להביע pLexA-N בשילוב עם וקטור הספרייה הריק pGAD-HA גדל על צלחות סלקטיבית חסרות TRP-Leu-שלו-ADE, בשל ההפעלה הרצויה של מערכת כתב NMY51 40. The-ההפעלה העצמית יכולה להיות weak ויכול להתרחש בהיעדר TRP-Leu-שלו, או את ההפעלה יכולה להיות חזקה התאפיינה בגידול על TRP-Leu-שלו-ADE צלחות 41. עצמית הפעלה יכולה לגרום רקע מסיבי של שיבוטים חיוביים שגויים מסך Y2H בפועל. כדי למנוע זאת, מבחן עצמי ההפעלה עם הפיתיון חייב להתנהל, שבו וקטור להביע מפעיל הוא טרנספורמציה שיתוף עם וקטור הספרייה הריקה. בהגדרה זו ניסיוני, ביטוי גני כתב אסור להיגרם. אם הפעלה עצמית (כלומר, צמיחה על צלחות סלקטיבית) גלויה את הבדיקה, המדיום יכול להיות השלים עם ריכוזים שונים של 3-אמינו-1,2,4-triazole 45 (3-AT). 3-AT הוא מעכב של dehydratase imidazoleglycerol-פוספט (HIS3), אנזים חשוב במהלך ביוסינתזה היסטידין 46. תוספת של 3-AT יכולה להפחית את ההשפעות החלשות של הפעלה עצמית במהלך מסכי Y2H 47,48. ריכוזים שונים של 3-AT צריכים להיבדק. בפרוטוקול זה, 1 - 40 מ&quot;מ 3-AT שמש. הריכוז הנמוך ביותר שמוביל לדיכוי של הפעלה עצמית צריך לאחר מכן לשמש מסך Y2H. הצלחות סלקטיבית של assay עצמית ההפעלה ניתן יהיה להעריך רק אם צלחות SD-TRP-Leu של שיתוף טרנספורמציה לכלול מספר מספיק של שיבוטים. בתור ≥ אינדיקציה 500 מושבות בכל 90 מ&quot;מ (קוטר) בצלחת פטרי מספיקות. כדי לקבוע את יעילות transfection המדויקת, מומלץ להכין דילולים סידוריים של שמרי שיתוף טרנספורמציה להפיץ אותם על צלחות SD-TRP-Leu. כדי לצמצם את תופעת הפעלה עצמית, המפעיל ניתן לשכפל לתוך pLexA-C, וקטור ביטוי פיתיון, המשלב את תג LexA אל C- הסופי של החלבון. האוריינטציה של תג לקס-A יכול להחליש הפעלה עצמית 24. עם זאת, אין זה אפשרי בכל מקרה להפחית או לבטל הפעלה עצמית. היווצרותמושבות אדומות או אדמדמות מצביעות על אינטראקציה חלשה או חיובית-כוזבת. גן כתב ade2 של NMY51 מופעל רק כאשר מדובר על אינטראקציה בין חלבונים, אשר בבלוקים בתורו ההצטברות של צבע אדום זן שמרים זה 40. בהעדר אינטראקציה, NMY51 הם אדמדם, ואילו מושבות נושאת interactors החזק לבנות. התצפית של צבע המושבה על צלחות בחירה ובכך מספקת רמז חשוב נוסף לשפוט אם מושבות בהתאמה הם interactors true- או חיוביות שגויות. זה בסופו של דבר צורך להתאים או לשנות את גדרות assay מסוימות ביחס לאופי הפיתיון ואת מאפייני האינטראקציה. בשלב זה, מספר השיפורים וטכניקות הנגזרות של Y2H המשותף הוקם כדי לאפשר הניתוח של אינטראקציות חלבון קשות למדי במערכות מארחת שונות. סקירה על ידי ואח Stynen. 49 מטפלnd מתאר היבטים שונים של Y2H, השיפורים שלה, ועיבודים, ובכך מספק מידע שימושי על איך לבחור את assay לאינטראקציה הנאות. מסכי Y2H וטכניקות נגזרות הפכו בשימוש נרחב בתחומי מחקר שונים, בכל המקום בו זיהוי של אינטראקציות חלבון בינארי נדרש. גם אם מבוצעים בקרות קריטיות, כגון בדיקות עצמי הפעלה של פיתיון אחד-על-אחד מחדש טרנספורמציות של חלבוני אינטראקציה המזוהה, Y2H נוטה לייצר תוצאות שווא 26, 50, 51. השמרים כמודל הוא לא מתאים לכל מחקרי האינטראקציה. שמרים אינם מהווים בהכרח בסביבת הסלולר שתומכת שינוי שלאחר translational המתאים וקיפול של כל חלבון 24. יתר על כן, בקביעת Y2H, החלבונים הם ביטוי יתר, והבעית שאינם שליטהבראשות האמרגן הטבעי שלהם. Y2H מאלץ שותפי האינטראקציה חלבוניים לגרעין, אשר אינו בהכרח יעד subcellular הטבעי שלהם. הנסיבות הסלולר יליד האינטראקציה ובכך לא יבואו לידי ביטוי על ידי שמרים עשוי להוביל לתוצאות false-negative או חיוביות שגויות. רוב Y2H מבוססים על השלמה שמרים auxotrophy כעיקרון סלקטיבית. מבחר תזונתי זה מאופיין רגישות גבוהה, אך במחיר של הסלקטיביות ירד לעומת אחרים (למשל, כתב chromogenic) מבחנים 49. אם הפעלה עצמית unreducible (ראה לעיל) או מגבלות אחרות להתרחש עבור מפעיל מסוים, Y2H אינו assay מתאים 25. בלוח 1 ואיור 1, התוצאות הצפויות של מבחן ההפעלה העצמית מקבלות. היעדרם של אינטראקציות ריאליות (כלומר, שליליים שגוי) יכול להיגרם על ידי רעילות חלבון, חלבון translational שגוי<html> עיבוד, הפרעה סטרית של אינטראקציה, שותפים אינטראקציה מיוצגות כראוי בספרייה טרף, לוקליזציה קרום של הפיתיון, או חסר כל המרכיבים הדרושים על האינטראקציה 24. מומלץ דה נובו להגביר את הגן באורך מלא של חלבון אינטראקציה זיהה מן cDNA, subclone אותו pGAD-HA, ולבצע assay אינטראקציה אחד-על-אחד על ידי הפיכת pGAD-HA שנוצר לבנות לתוך הפיתיון להביע זן NMY51. זה הכרחי מאז נצפה interactor הנוכחי בספריית הטרף יכול רק להיות שבר של חלבון גדול. עם זאת, המידע עבור הגן באורך מלא בהתאמה נגיש רק אם נתוני רצף גנומי transcriptomic ניכרים זמינים. פרוטוקול טרנספורמציה עבור assay העצמית ההפעלה המתוארת כאן יכול להיות מיושם על כזה assay אחד-על-אחד, ואת האינטראקציה בין הפיתיון ואת interactor חייבת להיות לשחזור. תחת = &quot;jove_content&quot;&gt; אינטראקציות מזוהות מסך Y2H חייב תמיד להיות מאושרים על ידי טכניקה נוספת עצמאית. טכניקה עצמאית זה חייבת להיות קרובה יותר בסביבה הטבעית של האינטראקציה בין החלבונים בפועל. במקרה של ATP_00189 מפעיל phytoplasmal, האינטראקציה עם גורמי שעתוק TCP של domestica x Malus אומתה planta עם השלמה פלורסנט bimolecular (BiFC) ב ניקוטיאנה benthamiana פרוטופלאסט 28 (לא חלק של פרוטוקול זה). ATP_00189 חלבון מפעיל נגזרה מאלי פ הפתוגן צמח. ב Planta BiFC ובכך נבחר כדי לאמת אינטראקציות ATP_00189 עם גורמי שעתוק domestica x Malus בעבר שזוהו Y2H 28. BiFC הוא assay אינטראקציה בין חלבונים שאינו דורש טרנסלוקציה subcellular של חלבוני אינטראקציה לגרעין כדי להפעיל את מערכת הכתב &lt;sup class = &quot;Xref&quot;&gt; 52. יתר על כן, ב Planta הביטוי ומכונה שינוי מחק את הסביבה של האינטראקציה הטבעית בין מפעיל חיידקי הצמח ב מארח מפעלה. עם זאת, מסך גלובלי באמצעות BiFC הוא לא ריאלי. ישנם מספר צעדים בפרוטוקול כי יש להתייחס בזהירות. כאשר הם מגבירים את הגן של עניין (שלב 4), חשוב לשלול כי פריימרים נקשרים ל- DNA הצמח. לפיכך, DNA מצמחים שאינם נגועים חייב להיכלל כביקורת שלילית. הרצף של הגן של עניין לא חייב להכיל את אתרי הגבלת EcoRI ו סאלי המשמשים השיבוט כיוונית של הכנס. אם הרצף אכן מכיל את האתרים הללו, אנזימי הגבלה שונים עבור שיבוט חייבים להיבחר. שינוי שמרים הוא שיטה מרכזית במהלך בפרוטוקול זה. יעילות Transfection תלויה המיומן של תאי שמרים, הכדאיות שלהם, מדינת הצמיחה, ואת איכות transfection reagאף אוזן גרון 53, 54. בשביל הפרוטוקול המוצע, מומלץ מאוד להשתמש שמרים מצלחות טריות לא מבוגרים שבועות (כל זמן ב 4 ° C) בעת ביצוע טרנספורמציות. לעתים קרובות, את הצמיחה של שמרי טרנספורמציה מתעכבת כאשר תרבויות נוזלות סלקטיבית הם מחוסנים עם מושבות צלחות אגרו ישנות. כמו כן הוא מועיל להשתמש תרבות המתנע נוזלית כמו בידוד עבור הניסויים בפועל ולא להשתמש השמרים ישירות מהצלחת. יעילות נמוכה כאשר transfecting טרף לתוך השמרים להביע פיתיון יכול להוביל underrepresentation של חלבוני טרף מסוימים (interactors פוטנציאל) ולכן יכול להטות את המסך כולו. בפרוטוקול זה, יעילות transfection שמרים של ~ 150,000 CFU / DNA transfected מיקרוגרם ב Y2H עבד היטב. לדעת את הפגמים וחסרונות של טכניקת Y2H ו לפרש את התוצאות בצורה ביקורתית וראויה הוא הכרחי כדי לצייר את הקורect מסקנות. מבחני Y2H ואת הנגזרים שמשו במשך שנים רבות עברו שיפורים רבים והתאמות ביחס למאפייני הפיתיון השונים, לוקליזציה subcellular של האינטראקציה, השותפים המחייבים הצפויים, וגורמים אחרים שעשויים להידרש האינטראקציה (ראו 55 Y3H, 56, 57). לאחרונה, מסך Y2H מבוסס מערך הפותחים המאפשרים אוטומטית, ניתוח תפוקה גבוהה של פיתיונות רבים נגד מ&#39;פושט 58. העתיד ביותר טמון סיכוי בגישות אוטומציה תפוקה גבוהה כדי assay זה כדי לאפשר להבהרת מסלולי איתות מורכבות interactomes בתחומי מחקר שונים.

<html> מסכי השני היברידי שמרים (Y2H) פותחו לפני כ 27 שנים 1 ויש לי מאז היה בשימוש נרחב בתחומים שונים כדי לקבוע אינטראקציות חלבון-חלבון מסוימים 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . האינטראקציה הפיסית של מפעיל חיידקים עם חלבון מטרה מארחת היא לעתים קרובות התנאי מוקדם המניפולציה התפקודית של חלבון המטרה הזאת. ניתוח אינטראקציות אלה עבר המוקד של מגזרים שונים של זיהום ביולוגיה 12, 13, 14, 15,&quot;&gt; 16, 17, 18. העיקרון של מסך Y2H הוא שהאינטראקציה של שני חלבונים מוביל הכינון מחדש של גורם שעתוק פונקציונלי שמניע את הביטוי של גני כתב. המפעיל הידוע (&quot; הפיתיון &quot;) הוא קבע translationally לתחום ה- DNA מחייב (DBD) של גורם השעתוק, ושותפי אינטראקצית הפוטנציאל (להלן: &quot;טרף&quot;) הם התמזגו לתחום ההפעלה (AD) של גורם שעתוק בהתאמה. מאז שותף האינטראקציה אינו ידוע, ספרייה של פוטנציאל interactors משובט לתוך מה שנקרא &quot;הטרף-הספרייה.&quot; בדרך כלל, ספרייה זו נעשית על ידי שיבוט cDNAs לתוך פלסמיד ביטוי וקטור הטרף מתאים קידוד לספירה תואמת הווקטור-הפיתיון המקודד DBD. במקרה של אינטראקציה, את גורמי שעתוק מחדש להשרות את הביטוי של גני כתב, המאפשרים את בחירת הצמיחה בדרך כלל של שמרים.זיהוי של interactors מושג על ידי רצף הפלסמיד טרף עם פריימרים פלסמיד ספציפי. חיידקים פיתחו אסטרטגיות שונות כדי להפעיל ולנצל את חילוף החומרים של המארח שלהם או כדי להתחמק ממנגנוני ההגנה ומפרישים מולקולות מפעיל באמצעות מערכות הפרשת חיידקים שונים 19, 20, 21. קביעת השותפים המחייבים של effectors החיידקים אלה היא אפוא הצעד הראשון בזיהוי מסלול מניפולציות המארח. זה מוביל הבנה משופרת של המנגנונים פתוגניות הספציפיים. מסכי Y2H מבוצעים לזהות אינטראקציות מפעילות חיידקים במהלך phytoplasmoses, ולעתים קרובות, Y2H הוא ניסוי ראשוני מכריע עבור האפיון הנוסף של מנגנוני הפתוגניות מולקולריים במחקר phytoplasma 22, 23. עם זאת, נפגשתיאור הוד ברוב הפרסומים די נדיר, וטכניקות אלו במיקור חוץ לעתים קרובות לחברות הביוטק. כדי למשוך תשומת לב את הכדאיות של שיטה זו, פרוטוקול זה מספק צעד אחר צעד במידע כדי לזהות שותפי אינטראקציה של מולקולת מפעיל חיידקים המארח שלו טבעי. למרות השימוש הנרחב ואת המחשבה קדימה המהירה של מסך Y2H, זה אסור לשכוח כי אינטראקציות מסוימות עשויות לא להתרחש במערכת השמרים. זאת בשל העובדה כי תא השמרים משמש כסוג של &quot;in vivo תגובת כלי&quot; עם מגבלותינו ביולוגיות מסוימות. כמה מחברים התייחס היתרונות והחסרונות של Y2H ונגזרותיו 11, 24, 25, 26, 27. שיקולים כלליים הם, למשל, כי תא שמרים אולי לא לספק את המתאיםביטוי גנים, (שלאחר) translational, או תנאי translocational עבור החלבונים בהתאמה נלמד. זה יכול להוביל לתוצאות false-negative במסך. אינטראקציות חיוביות בתורו יכול להיות חפצים ו עשויים לא להתרחש במצב טבעי (כלומר, במקרה של effectors ב המארח המתאים). זהו אפוא הכרחיים כדי לאשר את האינטראקציות ממערכת ביטוי שמרי Heterologous עם מבחן אינטראקציה עצמאי מערכת ביולוגית יותר קשורה זה לזה. במחקר זה, השותפים המחייב של ATP_00189 מפעיל מן הפתוגן צמח שאינו לעיבוד Candidatus Phytoplasma מאלי (פ מאלי) זוהו. התוצאות מספקות תובנה חשובות על המנגנונים המולקולריים שבבסיס פיתוח הסימפטום של התפשטות התפוחה 28, מחלה הגורמת להפסדים כלכליים גבוהים באזורים תפוחים וגדל מושפעים באירופה 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1514">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:565px;">Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:211px;">Applichem</td>
			<td style="width:324px;">A6284</td>
			<td style="width:415px;">for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trishydroxymethylaminomethane (Tris)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodiumchloride (NaCl)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2942</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">N-Lauroylsarcosin sodium salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A7402</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ammonium acetate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>9688</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1108</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3928</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>51976</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNAse</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2760</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chloroform:Isoamyl 24:1</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1935</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proofreading Polymerase (e.g. iProof)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>203433</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EcoRI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SalI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0641</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1493</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td>for self-activation assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Arginine Monohydrochloride&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3680</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Isoleucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3642</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-lysine Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3448</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Methionine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3897</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Phenylalanine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3464</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Threonine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3946</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tyrosine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3401</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Uracile</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0667</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Valine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3406</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Adenine Hemisulfate Salt&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1596</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.22 &#181;m Pore Filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16541</td>
			<td>for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Histidine Monohydrochloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3719</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Leucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3496</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tryptophane&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3410</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Nitrogen Base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51483</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1349</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-1</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peptone</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2208</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene Glycol 4000 (PEG)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1249</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3478</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Salmon Sperm DNA&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2159</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-719</td>
			<td>for Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>for plasmid purification from yeast and bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acid Washed Glass Beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>for plasmid purification from yeast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0839</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Extract</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1552</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z368245 (Sigma)</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bait vector (e.g. pLexA-N)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prey vector (e.g. pGAD-HA)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control prey vector (e.g. pLexA-p53)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control bait vector (e.g. pACT-largeT)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C640003</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3&#916;200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>676 051</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td>for quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free)</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2500010</td>
			<td>for PCR and DNA works</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpell</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0301</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile filter (0.22 &#181;m; Polyethersulfone))</td>
			<td>VWR-International</td>
			<td>514-0073 (European Catalogue number)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 90 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633180</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 150 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>639161</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer (e.g. BioPhotometer)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>550507804</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WB7</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Western Blot Equipment</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>diverse</td>
			<td>for protein detection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dNTPs</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2201210</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z232793, Z232858, Z232866</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaking Incubator (e.g. GFL 3031)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3031</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>KB 53 (E3.1)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825)</td>
			<td>Omniwash</td>
			<td>IF 825</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 &#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>diverse</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SPR-L-S01</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3617000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T4-Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fridge (4&#176;C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>81.767.580.4</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Freezer (-20&#176;C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>G5216</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Graduated Cylinder (e.g. Brand)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z327352; Z327417; Z327441&#160;&#160;</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S55701</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2)</td>
			<td>Integra-Biosciences</td>
			<td>155000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cuvettes for Electroporation (1 mm)</td>
			<td>Molecular Bio Products</td>
			<td>5510-11</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electroporator (e.g. Eporator)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml)</td>
			<td>VWR-International&#160;</td>
			<td>525-0403 (European Catalogue number)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM))</td>
			<td>Ambion&#160;</td>
			<td>AM8110G (distributed by Thermo Scientific)</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2021 Sigma&#160;</td>
			<td>for yeast culture (ready-made mix)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen

Unravelling המנגנונים המולקולריים של גילויי המחלה חשוב להבין פתולוגיות ופיתוח סימפטום במדעי הצמח. חיידקים פיתחו אסטרטגיות שונות כדי לתפעל מטבוליזם המארח שלהם לתועלתם. מניפולציה חיידקי זה בשילוב לעיתים קרובות עם פיתוח סימפטום חמור או מוות של הצמחים הנגועים. קביעת המולקולות הספציפיות חיידקי אחראי המניפולציה המארחת הפכה תחום חשוב במחקר מיקרוביולוגית. לאחר זיהוי של מולקולות חיידקים אלה, שנקראו &quot;effectors,&quot; חשוב להבהיר את תפקידם. גישה פשוטה לבדוק את רמת התפקוד של מפעיל הוא לזהות שותף מחייב חלבוניים שלה מארח הטבעי באמצעות מסך שמרים השני היברידי (Y2H). בדרך כלל המארח בחובו רבי שותפים מחייבים פוטנציאל שלא ניתן לחזות במידה מספקת על ידי כל אלגוריתם ממוחשב. לפיכך הבחירה הטובה ביותר perfoRM מסך עם מפעיל היפותטי נגד ספרייה שלמה של חלבונים מארחים לידי ביטוי. זה מאתגר במיוחד אם הגורם הסיבתי הוא ניתן לעיבוד חקלאי כמו phytoplasma. פרוטוקול זה מספק צעד אחר צעד הוראות טיהור DNA מצמח מארח וודי phytoplasma נגוע, ההגברה של מפעיל הפוטנציאל, ואת ההזדהות הבאה של שותף האינטראקציה המולקולרי של הצמח עם מסך Y2H. למרות מסכי Y2H משמשים, קיימת מגמה לבצע מיקור חוץ של הטכניקה הזו לחברות ביוטכנולוגיה המציעות את שירות Y2H במחיר. פרוטוקול זה מספק הוראות כיצד לבצע Y2H בכל מעבדה בביולוגיה מולקולרית מצוידת בהגינות תוך שימוש בטכניקות מעבדה סטנדרטיות.

לפני מסך Y2H בפועל יכול להתבצע הפיתיון חייב להיבדק על-הפעלה עצמית. זו מושגת על ידי הפיכת וקטור ביטוי פיתיון יחד עם וקטור ספריית טרף הריק ובדיקת צמיחה על צלחות סלקטיבית. כדי לנתח אם ATP_00189 חלבון phytoplasmal הוא-הפעלה עצמית, המבחן עצמי ההפעלה בוצע כמתואר בסעיף 5. פלסמיד הפיתיון המשלימה את TRP ואת הטרף פלסמיד auxotrophy Leu של ס cerevisiae NMY51 40. טרנספורמציה-שיתוף מוצלחת ובכך מתאפיינת בצמיחה על צלחות סלקטיבית חסרות TRP ו Leu. אינטראקציה של פיתיון חלבון טרף מוביל שלם של auxotrophy שלו ade של NMY51. אם הפעלה עצמית על ידי הפיתיון בהעדר אינטראקציה מופיעה, השמרים גדלו על צלחות סלקטיבית החסרות שלו ADE. עצמית חזקה וחלשההפעלה יכולה להתרחש. עצמית הפעלה חזקה של הפיתיון מאופיינת בצמיחה של שמרים טרנספורמציה-שיתוף על צלחות מבחר TRP-Leu--ADE שלו מדולדל. עצמית הפעלה חלשה מובילה לצמיחה על TRP-Leu-שלו אבל לא על צלחות מבחר TRP-Leu--ADE שלו מדולדלת. בקרות חיוביות נאות הן הכרחיות עבור בפירוש תוצאות של assay-ההפעלה העצמית. סיכום של התוצאות הצפויות של assay עצמית ההפעלה ופירושם מסופק בטבלה 1 ו דמיינו באיור 1. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> איור 1: דוגמא של בדיקות פיתיון עצמית הפעלה של פיתיון לפני ביצוע מסך Y2H. ס cerevisiae NMY51 היה שיתוף הפך עם אינטראקציה הפיתיון (Plex-p53) וטרף (PACT-largeT) כביקורת חיובית (פאנל משמאל: AC) חברה הפעלת עצמית חלש פלוס טרף ריק Libraוקטור ר&quot;י (פנל באמצע: DF) ו פיתיון עצמי הפעלה לא בתוספת וקטור ספריית טרף ריק (פנל מימין: GI). השמרים שיתוף טרנספורמציה היו בתרבית על צלחות SD חסר TRP ו Leu (הפאנל העליון: א, ד, ז), TRP, Leu ו שלו (פאנל באמצע: B, E, H) TRP, Leu, שלו ADE (נמוך לוח: ג, ו, ט). בחירה על המדיום חסר TRP ו Leu הוא פקד חיובי על שיתוף טרנספורמציה מוצלחת, כמו וקטור הפיתיון משלים את auxotrophy TRP ואת וקטור הצד טרף Leu auxotrophy של NMY51 (צמיחה על-Leu SD-TRP). במקרה של אינטראקציה בין הפיתיון טרף או הפעלה עצמית של הפיתיון, ביטוי הכתב של NMY51 מופעלת ומשלים את auxotrophy שלו ADE (הצמיחה על SD-TRP-Leu-שלו-ADE). מופעלת עצמית חלשה מאופיינת בצמיחה על SD-TRP-Leu-שלו צלחות (פנל באמצע, DF). עצמית הפעלה חלשה של פיתיון חייבת להצטמצם לפני לניתוח הפיתיוןב מסך Y2H, למשל על ידי הוספת 3-AT אל התקשורת סלקטיבית. depletions חומצת אמינו מסומן &quot;-&quot; בשם מדיה בהתאמה. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> אף לא אחד </td><td> מושבות </td><td> אין צמיחה </td><td> אין צמיחה </td><td> אין צמיחה </td><td> אין צמיחה </td></tr><tr><td> אף לא אחד </td><td> pGAD-HA </td><td> אין צמיחה </td><td> מושבות </td><td> אין צמיחה </td><td> אין צמיחה </td><td> אין צמיחה </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> אף לא אחד </td><td> מושבות </td><td> אין צמיחה </td><td> אין צמיחה </td><td> אין צמיחה </td><td> אין צמיחה </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> pGAD-HA </td><td> מושבות </td><td> מושבות </td><td&gt; מושבות </td><td> אין צמיחה </td><td> אין צמיחה </td></tr><tr><td> pLexA-p53 </td><td> ברית-largeT </td><td> מושבות </td><td> מושבות </td><td> מושבות </td><td> מושבות </td><td> מושבות </td></tr><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td> מושבות </td><td> מושבות </td><td> מושבות </td><td> אין צמיחה </td><td> אין צמיחה </td></tr></tbody></table> טבלה 1: התוצאות הצפויות ב assay פיתיון עצמית ההפעלה. הפיכתו של ס cerevisiae NMY51 מניבה בצמיחת הפרש על תקשורת סלקטיבית על בסיס המאפיינים של פיתיון שיתוף טרנספורמציה ונטרפים. צמיחה על צלחות סלקטיבית הוערכה על הטרנספורמציה של שילובים שונים וקטור (AF) לאחר דגירה 72 שעות ב 30 מעלות צלזיוס. עצמית הפעלה חלשה מאופיינת בצמיחה שמרים על Leu-SD-TRP-שלו עצמית הפעלה חזקה על ידי צמיחה על plat מבחר SD-TRP-Leu--ADE שלוes בהיעדר שותף אינטראקציה. ATP_00189 מפעיל phytoplasmal מקודד pLexA-N אינו תערוכת הפעלה עצמית, אשר מאופיינת על ידי חוסר היכולת של וקטור פיתיון טרנספורמציה NMY51 לגדול בהעדר ואייד שלו. בהתאם הפיתיון, מסך Y2H יכול להרוויח שיבוטים שמרים רבים גדל על צלחות סלקטיבית. כל הם צריכים להיות הבנים מנותחים ונבדקים לעובדים בפרישה אפשרית. גם אם ספריית cDNA מנורמלת נוצלה בעבר, סביר מאוד כי interactor מיוצגת שיבוטים שונים. בהתאם טכניקת שכפול הספרייה, אפשר גם כי רק שברי הגן המלא מוכנס כמה וקטורים טרפים. לפיכך רצוי דה נובו להגביר (מ cDNA) ו subclone הגן באורך מלא של interactor וכדי לבחון את האינטראקציה בניתוח Y2H אחד-על-אחד (איור 2). <img aLT = &quot;איור 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55,150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; איור 2: דוגמה של אינטראקציה בין הפיתיון טרף בניסוי Y2H. שמרי השני היברידי (Y2H) מסך בוצע פלסמידים של שיבוטי interactor חיוביים היו מטוהרים. וקטור הטרף היה רצף לבין שותפי אינטראקצית מארח Malus domestica x MdTCP24 ו MdTCP25 זוהו. כתוצאת MdTCP34 בקרה שלילית (בגינם לא interactor זוהה מסך ספריית Y2H) היה subcloned במקביל. הגנים באורך המלאים היו מוגברים מ cDNA התפוח, subcloned לתוך וקטור הטרף (שיתוף cistronically להביע לספירת תחום ההפעלה) ואת דה נובו-טרנספורמציה שיתוף עם וקטור הפיתיון המבטא את ATP_00189 מפעיל החיידקים מצמיד את תחום ה- DNA המחייבת (BD). נתון זה נלקח מתוך 28. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גדול</a>גרסה של נתון זה.

Watch this Scientific Journal Video about Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen at JoVE.com

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

חלבונים מפעיל בקטריאלי חשובים לקביעת זיהומים מוצלחים. פרוטוקול זה מתאר את זיהוי ניסיוני של שותפים מחייבים חלבוניים של חלבון מפעיל חיידקים המארחים הצמח הטבעי שלה. זיהוי אינטראקציות מפעיל אלה באמצעות השנייה היברידי מסכי שמרים הפך לכלי חשוב נפרם אסטרטגיות פתוגניות מולקולריות.

Unravelling תפקידו של מפעיל בקטריאלי מ פתוגן צמחים ללא לעיבוד בעזרת שמרי מסך דו-היברידי

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

unravelling-function-bacterial-effector-from-non-cultivable-plant

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K Views.  Laimburg Research Centre.  חלבונים מפעיל בקטריאלי חשובים לקביעת זיהומים מוצלחים. פרוטוקול זה מתאר את זיהוי ניסיוני של שותפים מחייבים חלבוניים של חלבון מפעיל חיידקים המארחים הצמח הטבעי שלה. זיהוי אינטראקציות מפעיל אלה באמצעות השנייה היברידי מסכי שמרים הפך לכל?...

Video: Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

הפלישה של תאים אנושיים על ידי פתוגן חיידקי

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

אינדוקציה של מחלת שתל נגד מארח ו<em&gt; In Vivo</em&gt; ניטור תא T תוך שימוש במודל Murine MHC התאמה

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks to human and animal health. Among cereal production, maize is arguably the most affected crop, due to pathogen-induced losses in grain integrity and mycotoxin seed contamination. The two most prevalent and problematic mycotoxins for maize growers and food and feed processors are aflatoxin and fumonisin, produced by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides, respectively.
Recent studies in molecular plant-pathogen interactions have demonstrated promise in understanding specific mechanisms associated with plant responses to fungal infection and mycotoxin contamination1,2,3,4,5,6. Because many labs are using kernel assays to study plant-pathogen interactions, there is a need for a standardized method for quantifying different biological parameters, so results from different laboratories can be cross-interpreted. For a robust and reproducible means for quantitative analyses on seeds, we have developed in-lab kernel assays and subsequent methods to quantify fungal growth, biomass, and mycotoxin contamination. Four sterilized maize kernels are inoculated in glass vials with a fungal suspension (106) and incubated for a predetermined period. Sample vials are then selected for enumeration of conidia by hemocytometer, ergosterol-based biomass analysis by high performance liquid chromatography (HPLC), aflatoxin quantification using an AflaTest fluorometer method, and fumonisin quantification by HPLC.

The devastation of cereal crops by seed-infecting fungi has prompted numerous research efforts to better understand plant-pathogen interactions. To study seed-fungal interactions in a laboratory setting, we developed a robust method for the quantification of fungal reproduction, biomass, and mycotoxin contamination using kernel bioassays.

כימות של קולוניזציה Sporogenesis פטרייתי, ולאחר הפקה של mycotoxins שימוש bioassays-Kernel

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

This protocol outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and colitis, as well as the methods used to characterize Citrobacter rodentium infection in mice. C. rodentium is a gram negative, murine specific bacterial pathogen that is closely related to the clinically important human pathogens enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli. Upon infection with C. rodentium, immunocompetent mice suffer from modest and transient weight loss and diarrhea. Histologically, intestinal crypt elongation, immune cell infiltration, and goblet cell depletion are observed. Clearance of infection is achieved after 3 to 4 weeks. Measurement of intestinal epithelial barrier integrity, bacterial load, and histological damage at different time points after infection, allow the characterization of mouse strains susceptible to infection.
The virulence mechanisms by which bacterial pathogens colonize the intestinal tract of their hosts, as well as specific host responses that defend against such infections are poorly understood. Therefore the C. rodentium model of enteric bacterial infection serves as a valuable tool to aid in our understanding of these processes. Enteric bacteria have also been linked to Inflammatory Bowel Diseases (IBDs). It has been hypothesized that the maladaptive chronic inflammatory responses seen in IBD patients develop in genetically susceptible individuals following abnormal exposure of the intestinal mucosal immune system to enteric bacteria. Therefore, the study of models of infectious colitis offers significant potential for defining potentially pathogenic host responses to enteric bacteria. C. rodentium induced colitis is one such rare model that allows for the analysis of host responses to enteric bacteria, furthering our understanding of potential mechanisms of IBD pathogenesis; essential in the development of novel preventative and therapeutic treatments.

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter rodentium infection provides a valuable model to study enteric bacterial infections as well as host immune responses and colitis in mice. This protocol outlines the measurement of barrier integrity, pathogen load and histological damage allowing for the thorough characterization of pathogen and host contributions to murine infectious colitis.

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; דגם עכבר: תרומות הפתוגן ומארח לומדים קוליטיס המדבק

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

הפרדה אוטומטית של<em&gt; ג elegans</em&gt; יישבו variably ידי פתוגן חיידקים

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

זיהוי Cortex שבר במהלך בקטריאלי Spore נביטה

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...