המחברים מבקשים להודות במימון מדע יפן וטכנולוגית סוכנות גישוש מחקר לטכנולוגיה מתקדמת (JST-Erato), האנרגיה החדשה התעשייתי טכנולוגית הפיתוח הארגוני (NEDO), וצלב-משרדי אסטרטגי חדשנות קידום התכנית (SIP), יפן .

1. הכנת פורמולציות מבוסס פפטיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו פתרונות המניות של כל פפטיד כדלקמן: (KH) 9 -BP100 (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל או 800 ננומטר), Cytcox- (KH) 9 (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל), BP100 (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ו (BP100) 2 K 8 (70 מיקרומטר). לשקול את הכמות הנדרשת של כל פפטיד צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge ולהוסיף מים ultrapure autoclaved לפזר את הפפטיד. מערבבים היטב על ידי pipetting חוזר על עצמו עד פתרון ברור מתקבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר ולטהר את ה- DNA פלסמיד (pDNA), פעמיים גדילי דנ&quot;א (dsDNA) ו- RNA פעמיים תקועים (dsRNA) על פי מתודולוגיות מולקולרי רגיל. ב 1.5 מ&quot;ל צינורות microcentrifuge, להפוך פתרונות מניות עם ריכוז של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(pDNA ו dsDNA) או 400 ננומטר (dsRNA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון חלבון מניות עם ריכוז של 7 מיקרומטר, על ידי המסת 1 מ&quot;ג של חלבון (למשל., Dehydrogenase אלכוהול, ADH) אבקה ב 1 מיליליטר של תמיסת סודיום קרבונט (0.1 M, pH 9). לייבל החלבון עם fבדיקות luorescent כגון rhodamine B (RHB) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים כדי לאפשר להדמיה מיקרוסקופית של החלבון אל תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את המרכיבים השונים בתוך שפופרת microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ניסוחים פפטיד-pDNA מיקוד הציטופלסמה, להוסיף 6.4 μl של (KH) 9 -BP100 (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) עד 20 μl של pDNA (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ומערבבים היטב על ידי pipetting. אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. הוסף 773.6 μl מים ultrapure autoclaved כדי לדלל את התמיסה לנפח סופי של 800 μl. השתמש מבנה pDNA המיועד ביטוי גרעינית (P35S-RLuc-TNOS, טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ניסוחים פפטיד-pDNA מיקוד המיטוכונדריה, להוסיף 6.6 μl של Cytcox- (KH) 9 (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) עד 20 μl של pDNA (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ומערבבים היטב על ידי pipetting. אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 25 ° C ולאחר מכן להוסיף 2.4 μl של BP100 (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל). אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 256; צלזיוס במשך 15 דקות אחרות. להוסיף 771 μl של מי ultrapure autoclaved כדי לדלל את התמיסה לנפח סופי של 800 μl. השתמש מבנה pDNA המיועד ביטוי המיטוכונדריה (pDONR-COX2: rluc, טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ניסוחים פפטיד-dsDNA, להוסיף 5.1 μl של (KH) 9 -BP100 (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) עד 8 μl של dsDNA (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ומערבבים היטב על ידי pipetting. אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. הוסף 786.9 μl מים ultrapure autoclaved כדי לדלל את התמיסה לנפח סופי של 800 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ניסוחים פפטיד-dsRNA, להוסיף 50 μl של (KH) 9 -BP100 (800 ננומטר) 50 μl של dsRNA (400 ננומטר) ומערבבים היטב על ידי pipetting. אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. הוסף 700 μl של RNase ללא מים כדי לדלל את התמיסה לנפח סופי של 800 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ניסוחים-חלבון פפטיד, להוסיף 16 μl של (BP100) 2 K 8 (70 מיקרומטר) ל -16 μl של ADH (7 מיקרומטר) ומערבביםהיטב על ידי pipetting. אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. להוסיף 768 μl של מי ultrapure autoclaved כדי לדלל את התמיסה לנפח סופי של 800 μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הניסוחים לייצב במשך 15 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. </li></ol> .2 אפיון פורמולציות מבוסס פפטיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת כל פתרון (800 μl) לתוך קובט לניתוח דינמי פיזור אור (DLS). לקבוע את מדד בקוטר polydispersity הידרודינמית של מתחמי הקים עם nanosizer זטה, באמצעות לייזר 633 ננומטר הוא Ne-של 25 מעלות צלזיוס עם זווית גילוי backscatter של 173 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות מדידות גודל, להעביר כל פתרון (800 μl) לתוך תא נימי מקופל למדידות פוטנציאל זטה ב פרמטרים ברירת המחדל של קבוע דיאלקטרי, מקדם השבירה ואת צמיגות המים במהירות של 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים נפח קטן של פתרון מורכב, המשמש ניתוח DLS, על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). הפקדה של 10 μl של פתרון מורכב על גבי המשטח בקע חשוף הטרי של גיליון יציץ ולהשאיר את המיקה לאוורר לילה יבש בצלחת פטרי פלסטיק מכוסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונה של המתחמים באוויר ב 25 מעלות צלזיוס באמצעות שלוחת סיליקון עם קבוע קפיץ של 1.3 N / מ &#39;קשה במצב 27,28. </li></ol> הסתננות 3. עלי צמח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 3 צמחי קרקע-הזדקנו שבוע (ארבידופסיס thaliana 24, ניקוטיאנה benthamiana 24 או 26 צפצפה). Transfect לפחות 3 עלים לשמש בשלושה עותקים עבור כימות של ביטוי גנים או מסירת חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מזרק פלסטיק מחטים 1 מ&quot;ל עם 100 μl של פתרון מורכב עבור transfection של עלה אחד. מקם את קצה המזרק על פני שטח abaxial של העלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על קצה המזרק נגד עלה מעט לוחץ על מתג המזרק לאט תוך הפעלת א-לחץ נגדי עם iאצבע ndex של יד לטקס בכפפות מהצד ההפוך. ניתן לצפות חדירה מוצלחת כמו הפצת אזור ספוגת מים עלה. לייבל העלים הסתננו על מנת להקל על הזיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עלה טרנספקציה משכי אופטימיזציה הבאים חדירה עם-pDNA פפטיד (12 שעות), פפטיד-dsDNA (12 שעות), פפטיד-dsRNA (9 - 48 שעות) ו-חלבון פפטיד (6 שעות) ניסוחים בתנאים הבאים: 16 hr אור / 8 שעות בחושך ב 22 מעלות צלזיוס למשך א thaliana ו צפצפה, או 24 שעות אור קבוע ב 29 מעלות צלזיוס למשך נ benthamiana. </li></ol> הערכת 4. יעילות Transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> והבלו כולו עלה טרנספקציה של שהמפעלים הקטנים יותר (למשל., Thaliana א) או סעיף 1 ס&quot;מ 2 של האזור הסתננו לצמחים גדולים (למשל., נ benthamiana). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים transfection באמצעות בלוציפראז Renilla (Rluc) וקטור הכתב, לקבוע את transfectioיעילות n כמותית באמצעות ערכת Assay Rluc. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל עלה נכרת או סעיף עלה בצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. הוספת 100 μl של 1 × Rluc Assay הצפת תמוגה לכל צינור. באותו אופן, להכין lysates עלי שליטה הלא transfected (בשלושה עותקים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחן את העלים באמצעות עלי המגון דגירת lysate כתוצאה במהירות של 25 מעלות צלזיוס במשך 6 - 10 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate ב g 12,470 × ב microcentrifuge דקות 1. העברת 20 μl של lysate פינה אל באר בתוך microplate 96-היטב, ולהשתמש נפח הנותרים כימות של ריכוז החלבון הכולל באמצעות ערכת Assay חלבון BCA פי פרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של 1 × המצע Assay Rluc (מדולל באמצעות הצפת Assay Rluc) לתוך הבאר ומערבבים ידי pipetting איטי. מניחים את microplate ב קורא microplate multimode וליזום המדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת את הארת הרקע (ממוצע של לאn-טרנספקציה בשלושה עותקים) מכל ההארה של מדגם הניסיון. חשב את היחס בין photoluminescence (יחידות אור יחסי, RLU) לסכום של חלבון (מ&quot;ג). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים transfection באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וקטור הכתב או שכותרתו fluorescently חלבון (למשל., ADH-RHB), ולבחון את הקרינה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הקצוות של עלה שלם (כדי לסייע להסרת חללי האוויר), בעוד עלה מחולק יכול לשמש הוא. הסר את הבוכנה של מזרק 10 מ&quot;ל ומניח כל חלק לעלה או עלה ניכר בתוך המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את הבוכנה ולחץ עליו בעדינות לתחתית המזרק ללא ריסוק העלה. לשאוב מים לתוך המזרק עד שהוא כמחצית מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את המזרק כלפי מעלה ודוחפים את הבוכנה כדי להסיר אוויר מן המזרק דרך קצה. מכסה את קצה המזרק ולמשוך את הבוכנה כלפי מטה לאט לגרש אוויר מן לאהf. חזור על תהליך זה מספר פעמים עד העלה נראה שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את פני השטח של המיקרוסקופ שקופית עם דבק. חותכי שטח מרובע בקלטת הגדולה מספיק כדי להכיל את המדגם עלה באמצעות סכין, לקלף את הפיסה הרבועה של קלטת את עם מלקחיים כדי ליצור תא דגימה. הקלטת תשמש spacer בין השקופיות coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את עלה בתא עם המשטח abaxial פונה כלפי מעלה ולמלא באזור תא הנותרים עם מים. חותם את העלה בתוך תא עם coverslip זכוכית ולאבטח את הקצוות של coverslip עם סרט דביק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את המדגם עלה באמצעות מיקרוסקופ סורק לייזר confocal תחת מטרה 40X או טבילה אובייקטיבי מים 63X. GFP או קרינת RHB ניתן דמיין באורכי גל עירור של 488 ננומטר או 555 ננומטר, בהתאמה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Altman, A., Hasegawa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant biotechnology and agriculture: Prospects for the 21st century. , (2011).</li><li>Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+molecular+farming:+systems+and+products.">Plant molecular farming: systems and products.</a> Plant Cell Rep. 22, 711-720 (2004).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+plant+transformation:+the+biology+behind+the+&amp;#34;gene-jockeying&amp;#34;+tool.">Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the &amp;#34;gene-jockeying&amp;#34; tool.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).</li><li>Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-velocity+microprojectiles+for+delivering+nucleic+acids+into+living+cells.">High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells.</a> Nature. 327, 70-73 (1987).</li><li>Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+genes+transferred+into+monocot+and+dicot+plant+cells+by+electroporation.">Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 5824-5828 (1985).</li><li>Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., Schilperoort, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transformation+of+plant+protoplasts+with+Ti-plasmid+DNA.">In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA.</a> Nature. 296, 72-74 (1982).</li><li>Birch, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+transformation:+problems+and+strategies+for+practical+application.">Plant transformation: problems and strategies for practical application.</a> Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297-326 (1997).</li><li>Newell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+transformation+technology.+Developments+and+applications.">Plant transformation technology. Developments and applications.</a> Mol. Biotechnol. 16, 53-65 (2000).</li><li>Nielsen, K. M., Bones, A. M., Smalla, K., van Elsas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+gene+transfer+from+transgenic+plants+to+terrestrial+bacteria--a+rare+event?.">Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria--a rare event?.</a> FEMS Microbiol. Rev. 22, 79-103 (1998).</li><li>Chuah, J. A., Kaplan, D., Numata, K., Cai, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+25,+Engineering+peptide-based+carriers+for+drug+and+gene+delivery.">Chapter 25, Engineering peptide-based carriers for drug and gene delivery.</a> Engineering in Translational Medicine. , 667-689 (2014).</li><li>Nitta, S., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolymer-based+nanoparticles+for+drug/gene+delivery+and+tissue+engineering.">Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering.</a> Int. J. Mol. Sci. 14, 1629-1654 (2013).</li><li>Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(amino+acid)s/polypeptides+as+potential+functional+and+structural+materials.">Poly(amino acid)s/polypeptides as potential functional and structural materials.</a> Polym. J. 47, 537-545 (2015).</li><li>Numata, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+delivery+systems+of+bioactive+molecules.">Silk-based delivery systems of bioactive molecules.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1497-1508 (2010).</li><li>Numata, K., Subramanian, B., Currie, H. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+silk+protein-based+gene+delivery+systems.">Bioengineered silk protein-based gene delivery systems.</a> Biomaterials. 30, 5775-5784 (2009).</li><li>Chugh, A., Eudes, F., Shim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+nanocarrier+for+macromolecule+delivery+in+living+cells.">Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells.</a> IUBMB Life. 62, 183-193 (2010).</li><li>Eggenberger, K., Mink, C., Wadhwani, P., Ulrich, A. S., Nick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+peptide+Bp100+as+a+cell-penetrating+tool+for+the+chemical+engineering+of+actin+filaments+within+living+plant+cells.">Using the peptide Bp100 as a cell-penetrating tool for the chemical engineering of actin filaments within living plant cells.</a> ChemBioChem. 12, 132-137 (2011).</li><li>Numata, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+gene+carriers+with+cell+membrane+destabilizing+peptides.">Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides.</a> Biomacromolecules. 11, 3189-3195 (2010).</li><li>Numata, K., Hamasaki, J., Subramanian, B., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+mediated+by+recombinant+silk+proteins+containing+cationic+and+cell+binding+motifs.">Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs.</a> J. Control. Release. 146, 136-143 (2010).</li><li>Numata, K., Mieszawska-Czajkowska, A. J., Kvenvold, L. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+nanocomplexes+with+tumor-homing+peptides+for+tumor-specific+gene+delivery.">Silk-based nanocomplexes with tumor-homing peptides for tumor-specific gene delivery.</a> Macromol. Biosci. 12, 75-82 (2012).</li><li>Numata, K., Reagan, M. R., Goldstein, R. H., Rosenblatt, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider+silk-based+gene+carriers+for+tumor+cell-specific+delivery.">Spider silk-based gene carriers for tumor cell-specific delivery.</a> Bioconjugate Chem. 22, 1605-1610 (2011).</li><li>Chuah, J. A., Yoshizumi, T., Kodama, Y., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+introduction+into+the+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana+via+peptide-based+carriers.">Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers.</a> Sci. Rep. 5, 7751 (2015).</li><li>Numata, K., Yoshizumi, T., Kodama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+transformation+method.">Plant transformation method.</a> Patent. , (2015).</li><li>Ng, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+delivery+of+proteins+in+intact+plants+via+fusion+peptides.">Intracellular delivery of proteins in intact plants via fusion peptides.</a> PLoS ONE. 11, e0154081 (2016).</li><li>Lakshmanan, M., Kodama, Y., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+gene+delivery+into+plant+cells+using+designed+peptide+carriers.">Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers.</a> Biomacromolecules. 14, 10-16 (2012).</li><li>Lakshmanan, M., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Kodama, Y., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+introduction+into+intact+plants+using+peptide-DNA+complexes.">Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes.</a> Plant Biotechnol. 32, 39-45 (2015).</li><li>Numata, K., Ohtani, M., Yoshizumi, T., Demura, T., Kodama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+gene+silencing+in+plants+via+synthetic+dsRNA+and+carrier+peptide.">Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide.</a> Plant Biotechnol. J. 12, 1027-1034 (2014).</li><li>Numata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+degradation+processes+of+poly[(R)-3-hydroxybutyric+acid]+and+poly[(R)-3-hydroxybutyric+acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric+acid]+single+crystals+revealed+by+atomic+force+microscopy:+effects+of+molecular+weight+and+second-monomer+composition+on+erosion+rates.">Enzymatic degradation processes of poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric acid] single crystals revealed by atomic force microscopy: effects of molecular weight and second-monomer composition on erosion rates.</a> Biomacromolecules. 6, 2008-2016 (2005).</li><li>Numata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+biopolyester+depolymerase+on+silicon+wafer+and+poly[(R)-3-hydroxybutyric+acid]+single+crystal+revealed+by+real-time+AFM.">Adsorption of biopolyester depolymerase on silicon wafer and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] single crystal revealed by real-time AFM.</a> Macromol. Biosci. 6, 41-50 (2006).</li><li>Kawai, S., Nishizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+procedure+for+DNA+transfection+with+polycation+and+dimethyl+sulfoxide.">New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide.</a> Mol. Cell. Biol. 4, 1172-1174 (1984).</li><li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA.">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).</li><li>Luo, D., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+transfection+by+physical+concentration+of+DNA+at+the+cell+surface.">Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface.</a> Nat. Biotechnol. 18, 893-895 (2000).</li><li>Boynton, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+transformation+in+Chlamydomonas+with+high+velocity+microprojectiles.">Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles.</a> Science. 240, 1534-1538 (1988).</li><li>Sikdar, R. S., Serino, G., Chaudhuri, S., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+transformation.">Plastid transformation.</a> Arabidopsis thaliana Plant Cell Rep. 18, 20-24 (1998).</li><li>Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transformation+of+plastids+in+higher+plants.">Stable transformation of plastids in higher plants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 8526-8530 (1990).</li><li>Liu, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+of+plant+mutants+with+large+genomic+DNA+fragments+by+a+transformation-competent+artificial+chromosome+vector+accelerates+positional+cloning.">Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6535-6540 (1999).</li><li>Park, H. S., Lee, B. M., Salas, G. M., Srivatanakul, M., Smith, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shorter+T-DNA+or+additional+virulence+genes+improve+Agrobactrium-mediated+transformation.">Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation.</a> Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020 (2000).</li><li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation:+an+analysis+in+tomato.">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato.</a> Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).</li><li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+transformation+technology+development+for+commercial+event+generation.">Maize transformation technology development for commercial event generation.</a> Front. Plant Sci. 5, 379 (2014).</li><li>Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens+transfers+extremely+long+T-DNAs+by+a+unidirectional+mechanism.">Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism.</a> J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).</li><li>Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L., Bajaj, Y. P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+wheat+(Triticum+spp.).">Transgenic wheat (Triticum spp.).</a> Transgenic Crops I. , 14-36 (2000).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול אשר זוהו באופן אמפירי נדונים. על ידי חדירת מזרק, הניסוחים מבוססי פפטיד המוכנסים הנאדיות בתוך עלה הצמח דרך הפיוניות. כדי להבטיח ספיגה מקסימלי של הפתרון, בתהליך החדיר צריכה להתבצע כאשר הצמחים נמצאים תחת תנאים שהם תורמים פתיחת הפיוניות כלומר., מסופקים עם מספיק מים ובתקופת האור. באשר להכנת מתחמי transfection, על ניסוחים שכוללים שילוב של שני פפטידים (למסירת DNA במיקוד המיטוכונדריה), הרצף עבור תוספת של כל רכיב חיוני ולא צריך להיות הפוך. ישנם שינויים רבים סבירים לנוהל. אופציה נוספת עבור חדירת תאי צמח היא השימוש של חדירת אבק, אשר מסוגל להציג את הפתרון המורכב לתוך צמחים שלמים ו / או רקמות חלקיות כוללmeristems הפסגה. עבור הליך חלופה זו, שתילי שקועות הפתרון transfection, ובהתבסס על הלחץ שנוצר על ידי ואקום, מתחמי מטען הפפטיד נאלצים דרך הפיוניות ולתוך בתאי צמח (Yoshizumi, ט, נתונים שלא פורסמו). ביטוי גני חלוף, בהתבסס על מחקרים באמצעות תאים מן החי, מוכיח להגדיל עם ריכוזי DNA גבוהים 29-31. חשוב לציין כי היחס של פפטיד ל- DNA משפיע על מאפייני biophysical (גודל, פריצת שטח) של מתחמים (איור 4), אשר משפיע יעילה transfection; ומכאן, היחס האופטימלי צריך להישמר גם עם ריכוז ה- DNA מוגבר. אחד היתרונות העיקריים באמצעות פפטידים כסוכן למסירת גן / חלבון הוא כי הרצף שלה ניתן כוונון למלא תפקיד רצוי. לדוגמא, תחום מיקוד-המיטוכונדריה של הפפטיד המוביל מתואר הרבעה זוy יכול להיות מוחלף עם רצפים chloroplastic או peroxisomal מיקוד עבור לוקליזציה אברונים אלה. בעוד שתמורה הכלורופלסט אפשרי בכמה צמחים באמצעות biolistics 32-34, לא Agrobacterium ולא שיטת biolistic יכול להציג גנים לתוך המיטוכונדריה או אברונים אחרים מלבד גרעין (טבלה 2). אין מגבלות מארח לטווח קשיחים transfection מבוססי פפטיד, בשונה משיטת מבוססי Agrobacterium (טבלה 2). עד כה, ניסוחים עבור transfection של thaliana א, נ benthamiana וצפצפה מוטבו (טבלה 1), אבל השיטה יכול להיות מיושם גם עבור טבק, זן עגבניות מיקרו-טום, אורז (מבוסס על ניסויים ראשוניים), וצמחים ובי-dicotyledonous אחרים. נכון לעכשיו, אין שום מגבלה ידועה בגודל transgene כאשר פפטידים הם השתמשווקטורי transfection הים. לעומת זאת, מולקולות דנ&quot;א גדולות נמצאו להפחית את יעילות השינוי של שיטות בתיווך Agrobacterium 35,36, ו מגבלת גודל עליון transgenes של כ 200 kb דווח 37-39. שימוש biolistics, מצד השני, קטעי דנ&quot;א גדולים עשויים להיות טעונים במהלך הכנה או מסיר לתוך צמחי 38. אמנם אין גבול עליון נקבע לטרנספורמציה biolistic עד כה, אילוצים פיזיים נמצאו להגביל את הגודל של ה- DNA כי ניתן להעביר הרבה פחות מ -150 KB 40. היתרונות העיקריים של שימוש במערכת מבוססת-פפטיד עבור העברת גנים לעומת הגישות קיימות העסקה או Agrobacterium או הפגזת microprojectile, שנדונו לעיל, מסוכם בטבלה 2. במוגבלות מעטיבשביל שיטה זו כפי שהיא עומדת. ראשית, ממוקד משלוח של pDNA כדי האברונים ספציפיים, כגון mitochondria, הוכח אפשרי על ידי שילוב פשוט של ה- DNA מחייבת חודר תאים רצפים במעבר אברון למרות היעילות הייתה נמוכה. הביטוי transgene ניתן היה לזהות, על ידי מיקרוסקופ confocal, רק אוכלוסייה קטנה של המיטוכונדריה בתוך התאים. לפיכך, שינויים נוספים נחוצים כדי: (i) לשפר את טרנסלוקציה של מתחמים יותר על פני התא / קרום organellar, וכן (ii) לשפר את הניתוק והעברת pDNA מן פפטיד המוביל לתוך אברון היעד לביטוי. שנית, באמצעות מערכת מסירת DNA זה, הביטוי החולף של גני כתב אקסוגניים הושג בהצלחה בתא cytosolic ו המיטוכונדריה של תאים. התאגדות וביטוי יציב של הגנים הציגו את הכור הגרעיני / הגנום organellar לא הוקמו עדיין, עם זאת, בשל העדר של אסטרטגיות בחירה מתאימות. אף שהוא מודה כי ישנם אזורים לשיפור או ד נוסףevelopment, האסטרטגיה נגזרת פפטיד המתוארת כאן נשארת טכניקה פשוטה צדדית סללה את הדרך עבור משלוח מטענים שונים לסוגי צמח מגוונים.

Plant genetic engineering is conventionally used for transferring beneficial traits to plants. In recent years, this technology has been applied to convert plants into bio-factories for the production of pharmaceutically important and commercially valuable proteins, many of which cannot be chemically synthesized and are very costly to produce using animal or microbial systems1. By the introduction of new genes, the plant's own metabolism can be manipulated for the production of various biopharmaceuticals like antibodies, metabolic enzymes, hormones, antigens or vaccine2.
Established gene transfer technologies for plants are the Agrobacterium-mediated delivery3, bombardment with DNA-coated microprojectiles (biolistics)4, and electroporation5 or polyethylene glycol6 treatment of protoplasts. Techniques requiring protoplasts are generally avoided because they are time-consuming, cumbersome and yield inconsistent results7. As a result, virtually all plant modification work at present utilizes either Agrobacterium or microprojectiles for gene transfer. The Agrobacterium method is more extensively used but not applicable to many economically important plant species. Meanwhile, microprojectile bombardment is more versatile due to a broad range of susceptible plants but requires specialized equipment and often causes severe tissue damage. Furthermore, these methods involve either a random (biolistics) or complex (Agrobacterium) delivery mechanism and have variable transformation rates8. Hence, a novel plant transformation technology that is simple yet effective, and applicable to different plant types is required.
Currently, plants are subjected to genetic modification primarily by the delivery of exogenous DNA encoding a desired trait, rather than by direct delivery of a target protein. The higher stability of DNA over proteins is a prime advantage; nevertheless, potential problems associated with DNA delivery include the random insertion of exogenous DNA into the plant genome and unintended transmission of antibiotic resistance genes to pathogenic bacteria via horizontal gene transfer9. For genome-editing purposes, the ability to edit plant genomes without introducing foreign DNA into cells may circumvent regulatory concerns related to genetically modified plants. Thus, an alternative DNA-free strategy for the modification of plants by direct delivery of protein will be able to cater to these needs.
Here we introduce a peptide-based system, originally developed for human gene therapy10-14, for the targeted delivery of exogenous genes or proteins in intact plants. Peptides are able to protect DNA from nuclease degradation and can mediate gene transfer across cell as well as organellar membranes15-17. They also have diverse and tunable properties besides being non-cytotoxic18-20. More importantly, with the use of peptides, genes can be precisely targeted to intracellular organelles such as the mitochondria21 or plastids (chloroplasts)22 for expression-a task not achievable by biolistic or Agrobacterium-mediated transformation. Depending on the cargo type, this new plant modification technology can be exploited to deliver proteins23 and either express (plasmid21,24 or double-stranded DNA25) or down-regulate (double-stranded RNA26) specific genes within the plant, throughout its cytosolic space24-26 or within a specific organellar compartment21. The designed carrier peptides consist of a cationic domain in the form of either polylysine (K8) or polylysine-co-histidine (KH)9 for binding and/or condensation of negatively-charged cargoes, which is conjugated to cell penetrating (BP100 peptide) or mitochondria transit (Cytcox peptide) sequences.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2358">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:453px;">(KH)9-BP100 peptide</td>
			<td style="width:355px;">Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH- 
			KHKKLFKKILKYL</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:453px;">(BP100)2-K8 peptide</td>
			<td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td>Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- 
			KYLKKKKKKKK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BP100 peptide</td>
			<td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td>Sequence: KKLFKKILKYL</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Cytcox-(KH)9 peptide</td>
			<td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td>Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- 
			KHKHKHKHKHKH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS</td>
			<td style="width:355px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc</td>
			<td style="width:355px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS)</td>
			<td style="width:355px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GFP5 siRNA</td>
			<td style="width:355px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CHS siRNA</td>
			<td style="width:355px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">1 mL and 10 mL Plastic Syringes</td>
			<td>TERUMO Corporation</td>
			<td>SS-01T, SS-10ESZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">1.5 mL Microcentrifuge Tube</td>
			<td>AS ONE Corporation</td>
			<td>151212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">96-Well Flat-Bottom Plate</td>
			<td>Asahi Glass Co., Ltd.</td>
			<td>3860-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Adhesive Tape</td>
			<td>Sekisui Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>No. 835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Alcohol Dehydrogenase</td>
			<td style="width:355px;">Sigma-Aldrich Co., LLC.</td>
			<td style="width:315px;">A-7011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Atomic Force Microscope</td>
			<td>Seiko Instruments Inc.</td>
			<td>SPI3800, SPA 300HV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Atomic Force Microscope</td>
			<td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td>
			<td>AFM5300E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Cantilever</td>
			<td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td>
			<td>K-A102001593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Cork Borer</td>
			<td style="width:355px;">Sigma-Aldrich Co., LLC.</td>
			<td>Z165220</td>
			<td>For excision of leaves into 1-cm diameter disks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Coverslip</td>
			<td style="width:355px;">Matsunami Glass Ind., Ltd.</td>
			<td style="width:315px;">C02261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Cuvette</td>
			<td style="width:355px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:315px;">759116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Folded Capillary Cell</td>
			<td style="width:355px;">Malvern Instruments, Ltd.</td>
			<td style="width:315px;">DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Forceps</td>
			<td style="width:355px;">Shimizu Akira Inc.</td>
			<td style="width:315px;">Stainless pincet 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Homogenization Pestle</td>
			<td>Ieda Trading Corp.</td>
			<td style="width:315px;">9993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mica</td>
			<td>Nisshin EM Co., Ltd.</td>
			<td style="width:315px;">LC23Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:315px;">BKA46472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices Corporation</td>
			<td style="width:315px;">Spectra MAX M3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Microscope Slide</td>
			<td style="width:355px;">Matsunami Glass Ind., Ltd.</td>
			<td>S011120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Pipette</td>
			<td style="width:355px;">Eppendorf Research&#174; plus</td>
			<td>3120000909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Pipette Tips</td>
			<td>AS ONE Corporation</td>
			<td>2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Plastic Petri Dish</td>
			<td>AS ONE Corporation</td>
			<td>1-7484-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Renilla Luciferase Assay Kit</td>
			<td>Promega corporation</td>
			<td>E2810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Rhodamine B Isothiocyanate</td>
			<td style="width:355px;">Sigma-Aldrich Co., LLC.</td>
			<td style="width:315px;">283924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">RNase-Free Water</td>
			<td style="width:355px;">Qiagen</td>
			<td style="width:315px;">129112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Sodium Carbonate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>199-01585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Surgical Blade and Handle</td>
			<td>FEATHER Safety Razor Co., Ltd.</td>
			<td>Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Syringe Tip Cap</td>
			<td>Musashi Engineering Inc.</td>
			<td>NC-3E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Weighing Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>CPA225D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Zeta Potentiometer</td>
			<td>Malvern Instruments, Ltd.</td>
			<td>Zetasizer Nano-ZS</td>
			<td style="width:1235px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

peptide-derived method to transport genes and proteins across cellular and organellar barriers in plants

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.

מערך מטעני חומצה וחלבון גרעין הוכנס בהצלחה לתוך צמחים שונים באמצעות פפטידים תוכננו וקטורי משלוח. אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין פפטידים קטיוני ומטענים-טעונים שלילי הביאו להיווצרות של מתחמי transfection כי יכול להיות שחדר ישירות לתוך בעלים הצמח באמצעות מזרק מחטים (איור 1). ניסוחים אופטימליים (נקבע באופן אמפירי במחקרים אלה 21,23-26) עבור transfection של בתאי צמח מפורטים בטבלה 1, כאשר כל סוג של מגוון רחב של מטענים נמסר (pDNA, dsDNA, dsRNA וחלבון) מיוצגת. בקטרים ​​הממוצעים של כל הניסוחים מבוססים פפטיד היו בטווח המשוער של 150 - 300 ננומטר. בהתבסס על ניתוח DLS, כל הניסוחים מוצגים polydispersities גודל נמוך יחסית, המעיד כי אגרגטים פפטיד המטען נוצרו יש חלוקה בגודל אחידה. המורפולוגיות שלמתחמי בין פפטיד pDNA (איור 2 א) או חלבון (תרשים 2B), על מיקה, הם צילמו על ידי AFM. מתחמי כדוריים הומוגנית נצפו הן שילובים פפטיד-pDNA פפטיד-חלבון, בהסכמה עם נתונים ממדידות DLS. מבחינת הפוטנציאל זטא של מתחמים (טבלה 1), pDNA- ומכלולים הנגזרות dsDNA היו חיובי שטח נטו שלילי בעוד מתחמים מבוססים dsRNA היה מטען משטח ליד ניטראלי. מתחמי פפטיד-חלבון, ומצד שני, היו בעלי מטען חשמלי חיובי. הנצילות של pDNA פפטיד ניסוחים-dsDNA פפטיד בתיווך transfection של thaliana א או נ benthamiana כמערכות צמח המודל הוערכו כמותית וכן איכותית. את assay ביטוי גנים RLuc הועסק כימות של רמות ביטוי גנים (טבלה 1), ולכן, עבור pDNA בניסוי זה אוdsDNA קידוד הגן RLuc חייב לשמש complexation עם פפטידים המוביל בהתאמה. שימוש (KH) 9 ניסוח -BP100 / pDNA, משלוח גרעיני במיקוד וביטוי של pDNA יכול להיות מושג, לאחר תקופת דגירה של 12 שעות, עם ערך מ&quot;ג RLU / מוערך של כ 1 × 10 5. למסירה במיקוד המיטוכונדריה וביטוי של pDNA, שילוב של פפטידים, Cytcox- (KH) 9 ו BP100, נדרש ליצירת מורכבות. עם תקופת הדגירה באותו אופטימיזציה של 12 שעות, עם זאת, ברמה הרבה יותר נמוכה של transfection (כ 1 × 10 3 RLU / מ&quot;ג) הושגה. בינתיים, תקופת דגירה דומה (12 שעות) ורמת ביטוי גנים (כ 1 × 10 3 RLU / מ&quot;ג) נדרשו / מוקלטת עבור מתחמים מבוססים dsDNA, אף התגבשו באמצעות (KH) 9 -BP100 פפטיד. הערכות איכותיות של ביטוי גנים בוצעו על ידי תצפית מיקרוסקופית ישירה של עלים שטופלה prepar מתחמיםed באמצעות pDNA או dsDNA קידוד גן כתב GFP. בתאים transfected עם מתחמים הלא ממוקד פפטיד-pDNA, מפוזר פלואורסצנטי ירוק להתכתב עם הביטוי של GFP נצפה בבירור ונמצא למקם ב (איור 3 א) cytosol. הבדלים ברורים דפוס לוקליזציה של הקרינה GFP ניכרו תאים הסתננו עם מתחמי pDNA-פפטיד במיקוד המיטוכונדריה. הנה, פלואורסצנטי ירוק punctate כי colocalize עם הכתם המיטוכונדריה היה גלוי, המאשר את הספציפיות של ביטוי גנים באופן בלעדי בתא המיטוכונדריה של תאים (איור 3). במקרה של ניסוחים-חלבון פפטיד, נטייה של מטען החלבון (ADH) על fluorophore (RHB) תאפשר להדמיה של החלבון נשא בתא התאי. בתוך תקופת דגירה קצרה של 6 שעות, ADH-RHB חלבון (כחול) נמצא שיחולקו לאורךcytosol ו vacuole של תאים הסתננו (איור 3 ג). בינתיים, מהיר ויעיל למטה בקרת גנים יכול להיות מושלם בצמחים שונים באמצעות ניסוחים פפטיד-dsRNA. בניסוי הראשון, עלה thaliana א הסתנן עם פפטיד-dsRNA קומפלקסים להשתיק את גן synthase chalcone (CHS) האחראי אנתוציאנין (פיגמנט האדום) ביוסינתזה בתנאי בצורת. ההבדל במראה של thaliana א עלים תחת נורמלי (האיור 3D, א) ותנאי בצורת (איור 3D, ב) ספק אמצעי קל להעריך CHS השתקה באמצעות ניסוח פפטיד-dsRNA אופטימיזציה (חץ 1 מציין באזור הסתנן). בניסוי השני, מתחמי פפטיד-dsRNA הסתננו לתוך העלים של thaliana א המהונדס מבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP). הפחתה ניכרת ביטוי YFP ניתן היה לראות את התאים אפידרמיס 9 שעות pOST-transfection (איור 3E, F). האפקטיבי של הניסוח בביטוי גני ויסות למטה במערכת צמחים שונה (צפצפה, 12 שעות שלאחר transfection) גם אושר (האיור 3G, H). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig1.jpg" /> איור 1: פורמולציות מבוססים פפטיד עבור משלוח חומצות גרעין ומטעני חלבון לתוך חיים וצמחים. פפטידים המובילים שנועדו להכיל polycations מצומדות כדי חודר לתא או רצפי מעבר organellar. Polycations מאפשר מחייב ו / או התעבות של מטענים-טעונים שלילי כמו גם בריחה מתא endosomal הבא הפנמה לתאים. משלוח מטענים לתאים ובהמשך ל אברונים ספציפי מתווך על ידי רצפים חודרים לתא רצפי מעבר organellar, בהתאמה. מטענים שונים שיכולים להיות successfully נמסר לתוך הצמח כוללים חומצות גרעין כגון pDNA, dsDNA ו dsRNA, כמו גם חלבונים מודל כמו אלבומין בסרום שור (BSA), dehydrogenase אלכוהול (ADH) סיטרין (וריאנט של חלבון פלואורסצנטי צהוב). מולקולות ביו מסוגלים להקים מתחמי transfection עם conjugates פפטיד באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות, אשר מוכנסים עלי הצמח על ידי חדירת מזרק. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54972/54972fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig2.jpg" /> איור 2: מורפולוגיות של פורמולציות המבוססות פפטיד. (א) AFM משרעת תמונה של (KH) 9 ניסוח -BP100 / pDNA ב N / P 0.5. (ב) תמונה גובה AFM של (BP100) 2 K 8 / ADH ניסוח בבית רטי טוחנתo 10. לשכפל באישור ממקורות שפורסמו 23,24. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54972/54972fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig3.jpg" /> איור 3: הערכה מיקרוסקופית של יעילות transfection באמצעות פורמולציות פפטיד מבוססי אופטימליים. (א) ביטוי GFP Cytosolic (ירוק), להבדיל בין autofluorescence הכלורופלסט (אדום), נצפה בתאי mesophyll הספוגיים של thaliana א עלים הסתנן עם (KH) 9 ניסוח -BP100 / pDNA (N / P 0.5; 12 שעות ). (ב) ביטוי של GFP (ירוק) זוהה במיטוכונדריה (אדום) בתאי האפידרמיס של עלים א thaliana הסתננו עם Cytcox- (KH) 9 / BP100 / ניסוח pDNA (N / P 0.5 לכל peptidדואר; 12 שעות). תמונות מוגדלות של המיטוכונדריה עם ביטוי של GFP מוצגים בלוח הימין הקיצוני. משלוח (C) של ADH-RHB (כחול) לתוך התאים mesophyll הספוגית של thaliana א עלים בתיווך (BP100) 2 K 8 ביחס טוחנת פפטיד / חלבון של 10, דמיינו 6 שעות-חדירת הפוסט. (ד) עלה א thaliana לפני (א) ואחרי (ב) טיפול (KH) 9 -BP100 / ניסוח dsRNA (יחס טוחן 2; 48 שעות), אשר הביא דיכוי המסלול ביוסינתזה אנתוציאנין. ניסוח דומה המכיל GFP5 dsRNA הסתנן לתוך עלה כפי בקרה שלילית (ג). חצי 1 ו -3 מצביעים באזור הסתנן בעוד חצים 2 ו -4 עולים לאזור שאינו הסתנן בתוך העלה. (ה) א thaliana משאיר לבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) ו- (ו) את הקרינה YFP פחתה בעקבות חדירת עם<html> (קרן היסוד) 9 -BP100 / ניסוח dsRNA (יחס טוחנת 2; 9 שעות). (G) עליי צפצפה מהונדסת מבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) ו- (H) חדירה הבאים קרינת YFP פחתו עם (KH) 9 -BP100 / ניסוח dsRNA (יחס טוחן 2; 12 שעות). לשכפל באישור ממקורות שפורסמו 21,23,24,26. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54972/54972fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig4.jpg" /> איור 4: וריאציה פפטיד-ל-דנ&quot;א (N / P) יחס והשפעתם על מאפייני biophysical של מכלולים. עם הגדלת פפטיד יחס DNA, ניסוחים מבוססים פפטיד להקטין בגודלו בשעת מעבר הערכים זיטה-פוטנציאל שלהם משלילי לחיובי./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="שולחן 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972table1.jpg" /> טבלה 1: אפיון והערכה של פורמולציות פפטיד המבוסס השונה. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54972/54972table1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.</a> <img alt="טבלה 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972table2.jpg" /> טבלה 2: השוואה בין פפטיד מבוסס ואחרים טכנולוגיות משלוח DNA קיימים עבור צמחים שלמים. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54972/54972table2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants at JoVE.com

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

פפטיד הנגזרות שיטה לתחבורה גנים וחלבונים מעבר נייד מחסומי Organellar בצמחים

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

peptide-derived-method-to-transport-genes-proteins-across-cellular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

10.5K Views.  RIKEN Center for Sustainable Resource Science. Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

Video: Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation of gene functions. Their therapeutic potential in the heart can also be determined. There are limited approaches for in vivo molecular intervention in the mouse heart. Recombinant adeno-associated virus (rAAV)-based genome engineering has been utilized as an essential tool for in vivo cardiac gene manipulation. The specific advantages of this technology include high efficiency, high specificity, low genomic integration rate, minimal immunogenicity, and minimal pathogenicity. Here, a detailed procedure to construct, package, and purify the rAAV9 vectors is described. Subcutaneous injection of rAAV9 into neonatal pups results in robust expression or efficient knockdown of the gene(s) of interest in the mouse heart, but not in the liver and other tissues. Using the cardiac-specific TnnT2 promoter, high expression of GFP gene in the heart was obtained. Additionally, target mRNA was inhibited in the heart when a rAAV9-U6-shRNA was utilized. Working knowledge of rAAV9 technology may be useful for cardiovascular investigations.

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

גני הכנת rAAV9 כדי overexpress או מציאת עכבר לבבות

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5' mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5' mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.

Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

ניתוח של חלבונים קושרי שווי בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיזיולוגיים

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic fragments. Organellar genomes also exist in admixtures within a given cell or tissue type (heteroplasmy), and an abundance of subtypes may change throughout development or when under stress (sub-stoichiometric shifting). Next-generation sequencing (NGS) technologies are required to obtain deeper understanding of organellar genome structure and function. Traditional sequencing studies use several methods to obtain organellar DNA: (1) If a large amount of starting tissue is used, it is homogenized and subjected to differential centrifugation and/or gradient purification. (2) If a smaller amount of tissue is used (i.e., if seeds, material, or space is limited), the same process is performed as in (1), followed by whole-genome amplification to obtain sufficient DNA. (3) Bioinformatics analysis can be used to sequence the total genomic DNA and to parse out organellar reads. All these methods have inherent challenges and tradeoffs. In (1), it may be difficult to obtain such a large amount of starting tissue; in (2), whole-genome amplification could introduce a sequencing bias; and in (3), homology between nuclear and organellar genomes could interfere with assembly and analysis. In plants with large nuclear genomes, it is advantageous to enrich for organellar DNA to reduce sequencing costs and sequence complexity for bioinformatics analyses. Here, we compare a traditional differential centrifugation method with a fourth method, an adapted CpG-methyl pulldown approach, to separate the total genomic DNA into nuclear and organellar fractions. Both methods yield sufficient DNA for NGS, DNA that is highly enriched for organellar sequences, albeit at different ratios in mitochondria and chloroplasts. We present the optimization of these methods for wheat leaf tissue and discuss major advantages and disadvantages of each approach in the context of sample input, protocol ease, and downstream application.

The comparison and optimization of two plant organellar DNA enrichment methods are presented: traditional differential centrifugation and fractionation of the total gDNA based on methylation status. We assess the resulting DNA quantity and quality, demonstrate performance in short-read next-generation sequencing, and discuss the potential for use in long-read single-molecule sequencing.

מיטוב וניתוח השוואתי של הצמח DNA Organnelar העשרה שיטות מתאים עבור הדור הבא רצף

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can potentially increase risk of sudden unexpected death in epilepsy (SUDEP). Electroencephalography (EEG) and electrocardiography (ECG) are widely used clinical diagnostic tools to monitor for abnormal brain and cardiac rhythms in patients. Here, a technique to simultaneously record video, EEG, and ECG in mice to measure behavior, brain, and cardiac activities, respectively, is described. The technique described herein utilizes a tethered (i.e., wired) recording configuration in which the implanted electrode on the head of the mouse is hard-wired to the recording equipment. Compared to wireless telemetry recording systems, the tethered arrangement possesses several technical advantages such as a greater possible number of channels for recording EEG or other biopotentials; lower electrode costs; and greater frequency bandwidth (i.e., sampling rate) of recordings. The basics of this technique can also be easily modified to accommodate recording other biosignals, such as electromyography (EMG) or plethysmography for assessment of muscle and respiratory activity, respectively. In addition to describing how to perform the EEG-ECG recordings, we also detail methods to quantify the resulting data for seizures, EEG spectral power, cardiac function, and heart rate variability, which we demonstrate in an example experiment using a mouse with epilepsy due to Kcna1 gene deletion. Video-EEG-ECG monitoring in mouse models of epilepsy or other neurological disease provides a powerful tool to identify dysfunction at the level of the brain, heart, or brain-heart interactions.

Here, we present a protocol to record brain and heart bio signals in mice using simultaneous video, electroencephalography (EEG), and electrocardiography (ECG). We also describe methods to analyze the resulting EEG-ECG recordings for seizures, EEG spectral power, cardiac function, and heart rate variability.

סימולטני וידאו-EEG-אק ג ניטור כדי לזהות Neurocardiac בתפקוד במודלים של העכבר של אפילפסיה

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including cancers. These small regulatory RNAs mainly interact with the 3&#8217; untranslated regions (3&#8217; UTR) of their target messenger RNAs (mRNAs) ultimately resulting in the inhibition of decoding processes of mRNAs and the augmentation of target mRNA degradations. Based on the expression levels and intracellular functions, miRNAs are able to serve as regulatory factors of oncogenic and tumor-suppressive mRNAs. Identification of bona fide target genes of a miRNA among hundreds or even thousands of computationally predicted targets is a crucial step to discern the roles and basic molecular mechanisms of a miRNA of interest. Various miRNA target prediction programs are available to search possible miRNA-mRNA interactions. However, the most challenging question is how to validate direct target genes of a miRNA of interest. This protocol describes a reproducible strategy of key methods on how to identify miRNA targets related to the function of a miRNA. This protocol presents a practical guide on step-by-step procedures to uncover miRNA levels, functions, and related target mRNAs using the probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR), sulforhodamine B (SRB) assay following a miRNA mimic transfection, dose-response curve generation, and luciferase assay along with the cloning of 3&#8217; UTR of a gene, which is necessary for proper understanding of the roles of individual miRNAs.

This protocol uses a probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR), a sulforhodamine B (SRB) assay, 3&#8217; untranslated regions (3&#8217; UTR) cloning, and a luciferase assay to verify the target genes of a miRNA of interest and to understand the functions of miRNAs.

פרוטוקול מחוץ לגופית להערכת רמות מיקרוארנה, פונקציות, וגנים היעד הקשורים בתאי הגידול

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational steps are used to regulate specific genes. Sequence-specific nucleic acid-binding proteins target specific sequences to control spatial or temporal gene expression. The binding sites in nucleic acids are typically characterized by mutational analysis. However, numerous proteins of interest have no known binding site for such characterization. Here we describe an approach to identify previously unknown binding sites for RNA-binding proteins. It involves iterative selection and amplification of sequences starting with a randomized sequence pool. Following several rounds of these steps-transcription, binding, and amplification-the enriched sequences are sequenced to identify a preferred binding site(s). Success of this approach is monitored using in vitro binding assays. Subsequently, in vitro and in vivo functional assays can be used to assess the biological relevance of the selected sequences. This approach allows identification and characterization of a previously unknown binding site(s) for any RNA-binding protein for which an assay to separate protein-bound and unbound RNAs exists.

Sequence specificity is critical for gene regulation. Regulatory proteins that recognize specific sequences are important for gene regulation. Defining functional binding sites for such proteins is a challenging biological problem. An iterative approach for identification of a binding site for an RNA-binding protein is described here and is applicable to all RNA-binding proteins.

סיור במרחב הרצף כדי לזהות אתרי כריכה עבור חלבונים כריכת רנ א תקינה

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic screening using chemical mutagens is a useful strategy for mapping mutant phenotypes to genes among Drosophila and other model organisms that share conserved cellular pathways with humans. If the mutated gene of interest is not lethal in early developmental stages of flies, a climbing assay can be conducted to screen for phenotypic indicators of decreased brain functioning, such as low climbing rates. Subsequently, secondary histological analysis of brain tissue can be performed in order to verify the neuroprotective function of the gene by scoring neurodegeneration phenotypes. Gene mapping strategies include meiotic and deficiency mapping that rely on these same assays can be followed by DNA sequencing to identify possible nucleotide changes in the gene of interest.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

We present a protocol using a forward genetic approach to screen for mutants exhibiting neurodegeneration in Drosophila melanogaster. It incorporates a climbing assay, histology analysis, gene mapping and DNA sequencing to ultimately identify novel genes related to the process of neuroprotection.

ב Vivo Forward המסך הגנטי כדי לזהות גנים נוירוגינים הרומן ב Drosophila ילה melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in regulating gene expression at the post-transcriptional level. Sequencing sRNA libraries by Next Generation Sequencing (NGS) methods has been widely employed to identify and analyze miRNA transcriptomes in the last decade, resulting in a rapid increase of miRNA discovery. However, two major challenges arise in plant miRNA annotation due to increasing depth of sequenced sRNA libraries as well as the size and complexity of plant genomes. First, many other types of sRNAs, in particular, short interfering RNAs (siRNAs) from sRNA libraries, are erroneously annotated as miRNAs by many computational tools. Second, it becomes an extremely time-consuming process for analyzing miRNA transcriptomes in plant species with large and complex genomes. To overcome these challenges, we recently upgraded miRDeep-P (a popular tool for miRNA transcriptome analyses) to miRDeep-P2 (miRDP2 for short) by employing a new filtering strategy, overhauling the scoring algorithm and incorporating newly updated plant miRNA annotation criteria. We tested miRDP2 against sequenced sRNA populations in five representative plants with increasing genomic complexity, including Arabidopsis, rice, tomato, maize and wheat. The results indicate that miRDP2 processed these tasks with very high efficiency. In addition, miRDP2 outperformed other prediction tools regarding sensitivity and accuracy. Taken together, our results demonstrate miRDP2 as a fast and accurate tool for analyzing plant miRNA transcriptomes, therefore a useful tool in helping the community better annotate miRNAs in plants.

A bioinformatics pipeline, namely miRDeep-P2 (miRDP2 for short), with updated plant miRNA criteria and an overhauled algorithm, could accurately and efficiently analyze microRNA transcriptomes in plants, especially for species with complex and large genomes.

צינור ביואינפורמטיקה לנתח באופן מדויק ויעיל את המייקרואורפה בצמחים

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...