Yazarlar Japonya Bilim ve Teknoloji Ajansı Keşif Araştırma İleri Teknoloji (JST-ERATO), Yeni Enerji ve Endüstriyel Teknoloji Geliştirme Örgütü (Nedo) ve Çapraz bakanlık Stratejik İnovasyon Tanıtım Programı (SIP), Japonya&#39;dan fon kabul etmek istiyorum .

Peptit bazlı formülasyonların hazırlanması 1. <ol><li> Her peptit aşağıdaki gibi bir stok çözelti hazırlayın (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml veya 800 nM), Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml), BP100 (1 mg / ml) ve (BP100) 2 K 8 (70 uM). 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, her peptidin gerekli miktarda tartılır ve peptidi eritmek için otoklavlanmış ultra saf su ilave edilir. berrak bir çözelti elde edilene kadar tekrar tekrar pipetleme ile iyice karıştırın. </li><li> Yükseltmek ve plazmid DNA (pDNA), iki-şeritli DNA (dsDNA) ve standart moleküler metodolojilere göre, çift-şeritli RNA (dsRNA) temizler. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde, 1 mg / ml (pDNA ve dsDNA) ya da 400 nM (dsRNA) bir konsantrasyonda stok çözeltileri hazırlanır. </li><li> Sodyum karbonat çözeltisi (0.1 M, pH 9), 1 ml protein (örn., Alkol dehidrojenaz, ADH) tozu 1 mg çözülmesiyle, 7 uM konsantrasyonda protein stok çözelti hazırlayın. F proteininin etiketleStandart protokollere göre olan rodamin B (RhB) halinde luorescent probları hücrelere verilebilir protein, mikroskopik sağlamaktır. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, ilgili bileşenlerin bir araya getirin. <ol><li> Peptid-pDNA formülasyonlar sitoplazma hedefleme için, pDNA (1 mg / ml) 20 ul 6.4 ul (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Karışım 25 ° C&#39;de 15 dakika süreyle stabilize olmasına izin verin. 800 ul son hacim olması için çözeltinin bulunduğu otoklavlanmış ultra saf su 773,6 ul ekle. Nükleer anlatım (P35S-RLuc-tNOS&#39;u, Tablo 1) için tasarlanmış pDNA yapısını kullanın. </li><li> Peptid-pDNA formülasyonlar mitokondri hedefleme için, pDNA (1 mg / ml) 20 ul Cytcox- 6.6 ul (KH) 9 (1 mg / ml) ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Karışım 25 ° C&#39;de 15 dakika boyunca stabilize etmek ve daha sonra BP100 2.4 ul (1 mg / ml) ekleyin izin verin. Karışım, 25 ° C&#39;de 15 dakika dengelenmesine izin verin6; 15 dakika daha ° C. 800 ul son hacim olması için çözeltinin bulunduğu otoklavlanmış ultra saf su 771 ul ekle. Mitokondriyal ifade (: rluc, Tablo 1 pDONR-COX 2) için tasarlanmış pDNA yapısını kullanın. </li><li> Peptid-dsDNA formülasyonlar için, dsDNA (1 mg / ml) 8 ul 5.1 ul (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Karışım 25 ° C&#39;de 15 dakika süreyle stabilize olmasına izin verin. 800 ul son hacim olması için çözeltinin bulunduğu otoklavlanmış ultra saf su 786,9 ul ekle. </li><li> Peptid-dsRNA formülasyonlar için, dsRNA (400 nM) 50 ul 50 ul (KH) 9 -BP100 (800 nM) ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Karışım 25 ° C&#39;de 15 dakika süreyle stabilize olmasına izin verin. 800 ul son hacim olması için çözeltinin bulunduğu RNaz içermeyen su, 700 ul ekle. </li><li> Peptid-protein formülasyonları için, ADH 16 ul (7 uM) (BP100) 2 K 8 (70 mcM) 16 ul ekleyin ve karıştırıniyi pipetleme. Karışım 25 ° C&#39;de 15 dakika süreyle stabilize olmasına izin verin. 800 ul son hacim olması için çözeltinin bulunduğu otoklavlanmış ultra saf su 768 ul ekle. </li></ol></li><li> Formülasyonlar 25 ° C&#39;de 15 dakika süreyle stabilize olmasına izin verin. </li></ol> Peptit bazlı formülasyonların 2. Karakterizasyonu <ol><li> dinamik ışık saçılımı (DLS) analiz için bir küvete her solüsyonu (800 ul) aktarın. 173 ° &#39;lik bir geri yansıma deteksiyon açısı ile 25 ° C&#39; de, bir 633 nm He-Ne lazer kullanılarak bir zeta nanosizer ile oluşan komplekslerin hidrodinamik çapı ve poli dağılım endeksi belirlemek. </li><li> Aşağıdaki boyutu ölçümleri, 25 ° C&#39;de dielektrik sabiti, kırılma indisi ve suyun viskozitesine varsayılan parametreleri zeta potansiyel ölçümleri için katlanmış bir kılcal hücresine her çözeltisi (800 ul) aktarın. </li><li> (AFM atomik kuvvet mikroskopi ile DLS analizi için kullanılan kompleks çözeltisinin küçük bir hacmi, dikkat). Bir mika levha taze maruz bölünmüş yüzeye Mevduat karmaşık solüsyonu 10 ul ve kapalı plastik petri kuru gecede havalandırmak için mika bırakın. </li><li> Modunda 27,28 dokunarak 1.3 N / m arasında bir yay sabitine sahip bir silikon konsol kullanılarak 25 ° C &#39;de hava içinde komplekslerinin bir imgesi alınır. </li></ol> Bitki Yapraklarının 3. Sızma <ol><li> 3 haftalık toprak yetiştirilen bitkiler (Arabidopsis thaliana 24, Nicotiana benthamiana 24 veya kavak 26) kullanın. gen ekspresyonu ve protein teslim ölçümü için üç kopya olarak hizmet etmek üzere en az 3 yaprak transfekte. </li><li> Bir yaprak transfeksiyonu için karmaşık çözeltisi 100 ul ile 1 ml iğnesiz plastik şırınga yükleyin. yaprağın alt yüzeyi bir şırınganın ucu yerleştirin. </li><li> biraz yaprak karşı şırınga ucu bastırın ve i ile bir karşı baskı uygulayarak yavaş yavaş şırınga pistonu bastırınKarşı taraftan bir lateks eldivenli elin nDex parmağı. Başarılı infiltrasyon yaprak suda ıslatılmış alana yayılması olarak görülmektedir. kimlik kolaylığı için sızmış yaprakları etiketleyin. </li><li> peptid-pDNA (12 saat), peptid-dsDNA (12 saat), peptid-dsRNA ile infiltrasyon, aşağıdaki optimize sürelerde transfekte yaprak inkübe - aşağıdaki koşullar altında (9 48 sa) ve peptit-protein (6 saat) formülasyon: 16 saat ışık / N. benthamiana için 29 ° C&#39;de A thaliana, kavak, veya 24 saat sabit bir ışık için 22 ° C &#39;de 8 saat karanlık. </li></ol> Transfeksiyon etkinliğindeki 4. Değerlendirme <ol><li> Daha küçük bitkilerin tüm yaprak transfekte (örn., A. thaliana) veya daha büyük tesisler için infiltre bölgenin 1 cm2 bölümü tüketim (örn., N. benthamiana). </li><li> Renilla lusiferaz (Rluc) raportör vektörü kullanılarak transfeksiyon deneyleri için, transfectio belirlenmesin, verimi kantitatif bir Rluc Deney Kiti kullanılmıştır. <ol><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, her kesilmiş yaprak veya yaprak bölümü yerleştirin. tüp başına 1 x Rluc Deneyi Lizis Tamponu 100 ul ekle. Aynı şekilde, transfekte-olmayan kontrol yaprakları (üçlü) lizatları hazırlar. </li><li> Bir homojen hale havaneli kullanılarak yaprak öğütün ve 6, 25 ° C &#39;de elde edilen lizat inkübe - 10 saat süredir. </li><li> 1 dakika boyunca bir mikrosantrifüj içinde 12.470 x g&#39;de lizat santrifüjleyin. Aktarım 20, 96 çukurlu bir mikrolevhadaki iyi olarak temizlenir lisat ul ve üreticinin protokolüne uygun olarak bir BCA Protein Deney kiti kullanılarak toplam protein konsantrasyonu ölçümü için geri kalan hacmi kullanın. </li><li> kuyuya 1 x Rluc Deneyi Substrat (Rluc deney tamponu kullanılarak seyreltilmiş) 100 ul ilave edin ve yavaş pipetle karıştırılır. Bir çok modlu mikroplaka okuyucu içinde mikroplağı yerleştirin ve ölçümü başlatmak. </li><li> arka plan lüminesans çıkart (NO ortalaman-transfekte her deneysel numunenin luminescence itibaren) üç nüsha. protein (mg) miktarına Fotolüminesans oranı (nispi ışık birimleri, RLU) hesaplayın. </li></ol></li><li> Yeşil floresan proteini (GFP) raportör vektörü ya da floresan etiketli protein kullanılarak transfeksiyon deneyleri için (örn., ADH-RhB) bir odaklı lazer tarama mikroskobu kullanılarak floresan izleyin. <ol><li> gibi bir kesiti yaprak kullanılabilir iken, bütün yaprak (hava boşluklarının çıkışına yardım etmesi için) kenarlarını kesin. 10 ml şırınga pistonu çıkarın ve şırınga her eksize yaprak veya yaprak bölümüne yerleştirin. </li><li> pistonu değiştirin ve yaprak kırma olmadan şırınga altına hafifçe itin. yaklaşık yarısı dolana kadar şırınga içine su çizin. </li><li> yukarı şırınga gelin ve ucu ile şırınga havayı çıkarmak için piston itin. lea gelen havayı dışarı atmak için aşağı pistonu yavaşça şırınga ucu Kapak ve çekmef. yaprak saydam görünene kadar bu işlemi birkaç kez tekrarlayın. </li><li> Yapışkan bant ile bir mikroskop lamı yüzeyini kaplar. Bir bıçak kullanarak yaprak örneği barındıracak kadar büyük kaset üzerinde bir kare alana kesin ve bir örnek odasını oluşturmak için forseps ile bant kare parça soyulabilir. Bant slayt ve lamel arasındaki ayırıcı olarak görev yapacak. </li><li> yukarı bakacak şekilde alt yüzeyi ile odasında yaprağı yerleştirin ve su ile kalan kamara alanı doldurmak. Bir cam lamel ile bölme içinde yaprak Seal ve yapışkan bant ile lamel kenarlarında sabitleyin. </li><li> 40X objektif altında odaklı lazer tarama mikroskobu veya 63X suya daldırma objektif kullanarak yaprak örneği inceleyin. GFP ya RhB floresans, sırasıyla 488 nm ve 555 nm uyarılma dalga boyunda görselleştirilebilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Altman, A., Hasegawa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant biotechnology and agriculture: Prospects for the 21st century. , (2011).</li><li>Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+molecular+farming:+systems+and+products.">Plant molecular farming: systems and products.</a> Plant Cell Rep. 22, 711-720 (2004).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+plant+transformation:+the+biology+behind+the+&amp;#34;gene-jockeying&amp;#34;+tool.">Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the &amp;#34;gene-jockeying&amp;#34; tool.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).</li><li>Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-velocity+microprojectiles+for+delivering+nucleic+acids+into+living+cells.">High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells.</a> Nature. 327, 70-73 (1987).</li><li>Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+genes+transferred+into+monocot+and+dicot+plant+cells+by+electroporation.">Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 5824-5828 (1985).</li><li>Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., Schilperoort, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transformation+of+plant+protoplasts+with+Ti-plasmid+DNA.">In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA.</a> Nature. 296, 72-74 (1982).</li><li>Birch, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+transformation:+problems+and+strategies+for+practical+application.">Plant transformation: problems and strategies for practical application.</a> Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297-326 (1997).</li><li>Newell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+transformation+technology.+Developments+and+applications.">Plant transformation technology. Developments and applications.</a> Mol. Biotechnol. 16, 53-65 (2000).</li><li>Nielsen, K. M., Bones, A. M., Smalla, K., van Elsas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+gene+transfer+from+transgenic+plants+to+terrestrial+bacteria--a+rare+event?.">Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria--a rare event?.</a> FEMS Microbiol. Rev. 22, 79-103 (1998).</li><li>Chuah, J. A., Kaplan, D., Numata, K., Cai, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+25,+Engineering+peptide-based+carriers+for+drug+and+gene+delivery.">Chapter 25, Engineering peptide-based carriers for drug and gene delivery.</a> Engineering in Translational Medicine. , 667-689 (2014).</li><li>Nitta, S., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolymer-based+nanoparticles+for+drug/gene+delivery+and+tissue+engineering.">Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering.</a> Int. J. Mol. Sci. 14, 1629-1654 (2013).</li><li>Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(amino+acid)s/polypeptides+as+potential+functional+and+structural+materials.">Poly(amino acid)s/polypeptides as potential functional and structural materials.</a> Polym. J. 47, 537-545 (2015).</li><li>Numata, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+delivery+systems+of+bioactive+molecules.">Silk-based delivery systems of bioactive molecules.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1497-1508 (2010).</li><li>Numata, K., Subramanian, B., Currie, H. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+silk+protein-based+gene+delivery+systems.">Bioengineered silk protein-based gene delivery systems.</a> Biomaterials. 30, 5775-5784 (2009).</li><li>Chugh, A., Eudes, F., Shim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+nanocarrier+for+macromolecule+delivery+in+living+cells.">Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells.</a> IUBMB Life. 62, 183-193 (2010).</li><li>Eggenberger, K., Mink, C., Wadhwani, P., Ulrich, A. S., Nick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+peptide+Bp100+as+a+cell-penetrating+tool+for+the+chemical+engineering+of+actin+filaments+within+living+plant+cells.">Using the peptide Bp100 as a cell-penetrating tool for the chemical engineering of actin filaments within living plant cells.</a> ChemBioChem. 12, 132-137 (2011).</li><li>Numata, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+gene+carriers+with+cell+membrane+destabilizing+peptides.">Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides.</a> Biomacromolecules. 11, 3189-3195 (2010).</li><li>Numata, K., Hamasaki, J., Subramanian, B., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+mediated+by+recombinant+silk+proteins+containing+cationic+and+cell+binding+motifs.">Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs.</a> J. Control. Release. 146, 136-143 (2010).</li><li>Numata, K., Mieszawska-Czajkowska, A. J., Kvenvold, L. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+nanocomplexes+with+tumor-homing+peptides+for+tumor-specific+gene+delivery.">Silk-based nanocomplexes with tumor-homing peptides for tumor-specific gene delivery.</a> Macromol. Biosci. 12, 75-82 (2012).</li><li>Numata, K., Reagan, M. R., Goldstein, R. H., Rosenblatt, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider+silk-based+gene+carriers+for+tumor+cell-specific+delivery.">Spider silk-based gene carriers for tumor cell-specific delivery.</a> Bioconjugate Chem. 22, 1605-1610 (2011).</li><li>Chuah, J. A., Yoshizumi, T., Kodama, Y., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+introduction+into+the+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana+via+peptide-based+carriers.">Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers.</a> Sci. Rep. 5, 7751 (2015).</li><li>Numata, K., Yoshizumi, T., Kodama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+transformation+method.">Plant transformation method.</a> Patent. , (2015).</li><li>Ng, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+delivery+of+proteins+in+intact+plants+via+fusion+peptides.">Intracellular delivery of proteins in intact plants via fusion peptides.</a> PLoS ONE. 11, e0154081 (2016).</li><li>Lakshmanan, M., Kodama, Y., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+gene+delivery+into+plant+cells+using+designed+peptide+carriers.">Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers.</a> Biomacromolecules. 14, 10-16 (2012).</li><li>Lakshmanan, M., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Kodama, Y., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+introduction+into+intact+plants+using+peptide-DNA+complexes.">Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes.</a> Plant Biotechnol. 32, 39-45 (2015).</li><li>Numata, K., Ohtani, M., Yoshizumi, T., Demura, T., Kodama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+gene+silencing+in+plants+via+synthetic+dsRNA+and+carrier+peptide.">Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide.</a> Plant Biotechnol. J. 12, 1027-1034 (2014).</li><li>Numata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+degradation+processes+of+poly[(R)-3-hydroxybutyric+acid]+and+poly[(R)-3-hydroxybutyric+acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric+acid]+single+crystals+revealed+by+atomic+force+microscopy:+effects+of+molecular+weight+and+second-monomer+composition+on+erosion+rates.">Enzymatic degradation processes of poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric acid] single crystals revealed by atomic force microscopy: effects of molecular weight and second-monomer composition on erosion rates.</a> Biomacromolecules. 6, 2008-2016 (2005).</li><li>Numata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+biopolyester+depolymerase+on+silicon+wafer+and+poly[(R)-3-hydroxybutyric+acid]+single+crystal+revealed+by+real-time+AFM.">Adsorption of biopolyester depolymerase on silicon wafer and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] single crystal revealed by real-time AFM.</a> Macromol. Biosci. 6, 41-50 (2006).</li><li>Kawai, S., Nishizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+procedure+for+DNA+transfection+with+polycation+and+dimethyl+sulfoxide.">New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide.</a> Mol. Cell. Biol. 4, 1172-1174 (1984).</li><li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA.">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).</li><li>Luo, D., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+transfection+by+physical+concentration+of+DNA+at+the+cell+surface.">Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface.</a> Nat. Biotechnol. 18, 893-895 (2000).</li><li>Boynton, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+transformation+in+Chlamydomonas+with+high+velocity+microprojectiles.">Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles.</a> Science. 240, 1534-1538 (1988).</li><li>Sikdar, R. S., Serino, G., Chaudhuri, S., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+transformation.">Plastid transformation.</a> Arabidopsis thaliana Plant Cell Rep. 18, 20-24 (1998).</li><li>Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transformation+of+plastids+in+higher+plants.">Stable transformation of plastids in higher plants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 8526-8530 (1990).</li><li>Liu, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+of+plant+mutants+with+large+genomic+DNA+fragments+by+a+transformation-competent+artificial+chromosome+vector+accelerates+positional+cloning.">Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6535-6540 (1999).</li><li>Park, H. S., Lee, B. M., Salas, G. M., Srivatanakul, M., Smith, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shorter+T-DNA+or+additional+virulence+genes+improve+Agrobactrium-mediated+transformation.">Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation.</a> Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020 (2000).</li><li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation:+an+analysis+in+tomato.">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato.</a> Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).</li><li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+transformation+technology+development+for+commercial+event+generation.">Maize transformation technology development for commercial event generation.</a> Front. Plant Sci. 5, 379 (2014).</li><li>Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens+transfers+extremely+long+T-DNAs+by+a+unidirectional+mechanism.">Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism.</a> J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).</li><li>Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L., Bajaj, Y. P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+wheat+(Triticum+spp.).">Transgenic wheat (Triticum spp.).</a> Transgenic Crops I. , 14-36 (2000).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

ampirik tespit edilmiştir protokolü içinde kritik adımlar ele alınmıştır. Şırınga infiltrasyonu ile, peptit bazlı formülasyonlar stoma yoluyla bitki yaprak içinde hava boşluklarına yerleştirilir. Bitkiler yeterli su ve hafif süre boyunca ortam stomatal deliğin yani. Elverişli olan koşullar altında zaman çözeltinin maksimum alımını sağlamak için, süzme işleminin yapılması gerekir. (Mitokondrial hedefli DNA nakli için) iki peptitten oluşan bir kombinasyon içeren formülasyonlar için transfeksiyon komplekslerinin hazırlanması açısından, ile, her bir bileşenin ilavesi için dizi önemli ve ters olmamalıdır. prosedüre birçok makul değişiklikler vardır. Bitki hücrelerinin infiltrasyonu için başka bir seçenek de dahil olmak üzere bütün bitkileri ve / veya kısmi dokulara karmaşık solüsyonun verilmesini mümkün vakum infiltrasyonu kullanımı,apikal meristemler. Bu alternatif prosedür için, fidan transfeksiyon çözeltisine batırılmış ve vakum tarafından oluşturulan basınca göre, peptid-kargo kompleksleri stoma yoluyla ve bitki hücrelerinde (Yoshizumi, T., yayınlanmamış veri) içine zorlanır. Hayvan hücreleri üzerinde yapılan çalışmalara göre geçici gen ekspresyonu, yüksek DNA konsantrasyonları 29-31 arttığı gösterilmiştir. DNA peptid oranı komplekslerinin biyofiziksel özellikleri (boyut, yüzey yükü) etki not transfeksiyon verimini etkilemektedir (Şekil 4), önemlidir; Bu nedenle, en iyi oranı da artan bir DNA konsantrasyonu muhafaza edilmesi gerekmektedir. Bir gen / protein teslim maddesi olarak peptidler kullanılarak ana avantajlarından biri olan sekansı, istenen işlevi yerine getirmek için ayarlanması için uygun olmasıdır. Örneğin, bir taşıyıcı peptidin mitokondriyal hedefleme alanı Bu damızlık tarifY, bu organellere lokalizasyonu için kloroplast ya peroksisomal-hedefleme sekansları ile ikame edilmiş olabilir. Kloroplast transformasyonu biyolistik 32-34 kullanarak çeşitli bitkilerde mümkün olsa da, Agrobacterium veya biyolistik yöntemi de çekirdeğin (Tablo 2) yanı sıra, mitokondri ya da diğer organellere genleri getirebilir. Agrobacterium merkezli yöntem (Tablo 2) farklı olarak peptit bazlı transfeksiyon için bir bükülmez konakçı aralığına sınırlamaları vardır. Şu ana kadar, A. thaliana, N. benthamiana, kavak transfeksiyonu için formülasyonlar (Tablo 1) optimize edilmiştir, ancak yöntem, aynı zamanda, Nicotiana tabacum için de uygulanabilir, Domates çeşit mikro-Tom, pirinç (Hazırlık deneylerinde göre), ve diğer mono-ve çift filizli bitkiler. peptidler kullanıldığında Şimdiye kadar, transgen büyüklüğü bilinen herhangi bir sınırlama yokturS transfeksiyonu vektörler. Bunun aksine, büyük DNA moleküllerinin Agrobakterium aracılı yöntemler 35,36 dönüşüm verimliliği ve 37-39 bildirilmiştir yaklaşık 200 kb&#39;lik transgenler için üst bir sınır azaltmak için tespit edilmiştir. Biyolistik kullanımı ile, diğer taraftan, büyük DNA fragmanları bitki 38 içine hazırlama veya doğum sırasında kesilmiş olabilir. Bir üst sınırı kadar biyolistik transformasyonu için tespit edilmiştir, ancak, vücut kısıtlar daha az 150 kb 40 transfer edilebilir DNA boyutunu sınırlamak için tespit edilmiştir. Yukarıda ele alındığı Agrobacterium ya mikroprojektil bombardımanı, ya kullanılarak mevcut yaklaşımların karşılaştırıldığında gen transferi için peptit bazlı sistem kullanılarak büyük yararları, Tablo 2&#39;de özetlenmiştir. bu haliyle birkaç sınırlamalar bu yöntem için var. Birincisi, böyle bir mit olarak belirli organellere, için PDNA teslim hedefolmasına rağmen bu ochondria, DNA bağlama, hücreye nüfuz eden ve organel-geçiş dizilerinin basit bir kombinasyonu ile mümkün olduğu kanıtlanmıştır. Transgen ekspresyonu, sadece hücre içinde mitokondri küçük bir popülasyonda, konfokal mikroskobu ile tespit edilebilir. Hücre / organel zar boyunca daha komplekslerin translokasyon arttırmak ve (ii) söz hedef organel ayrışmasını ve taşıyıcı peptidden pDNA transferini geliştirmek: (i) Bu nedenle, başka modifikasyonlar için gereklidir. İkinci olarak, bu DNA verme sistemi ile, ekzojen raportör genlerin geçici ifade başarıyla hücrelerin sitosolik ve mitokondriyal bölmesinde elde edilmiştir. bitki nükleer / organel genomunda katılan genlerin istikrarlı birleşme ve ifade nedeniyle uygun seçim stratejilerinin olmaması, ancak, henüz kurulmuş değil. kabul etmekle birlikte iyileştirme ya da daha fazla d alanlar olduğunuevelopment, burada açıklanan peptit türevi strateji çeşitli bitki türleri içine çeşitli yüklerin teslimatı için yolunu açmıştır basit ve çok yönlü bir tekniktir kalır.

Plant genetic engineering is conventionally used for transferring beneficial traits to plants. In recent years, this technology has been applied to convert plants into bio-factories for the production of pharmaceutically important and commercially valuable proteins, many of which cannot be chemically synthesized and are very costly to produce using animal or microbial systems1. By the introduction of new genes, the plant's own metabolism can be manipulated for the production of various biopharmaceuticals like antibodies, metabolic enzymes, hormones, antigens or vaccine2.
Established gene transfer technologies for plants are the Agrobacterium-mediated delivery3, bombardment with DNA-coated microprojectiles (biolistics)4, and electroporation5 or polyethylene glycol6 treatment of protoplasts. Techniques requiring protoplasts are generally avoided because they are time-consuming, cumbersome and yield inconsistent results7. As a result, virtually all plant modification work at present utilizes either Agrobacterium or microprojectiles for gene transfer. The Agrobacterium method is more extensively used but not applicable to many economically important plant species. Meanwhile, microprojectile bombardment is more versatile due to a broad range of susceptible plants but requires specialized equipment and often causes severe tissue damage. Furthermore, these methods involve either a random (biolistics) or complex (Agrobacterium) delivery mechanism and have variable transformation rates8. Hence, a novel plant transformation technology that is simple yet effective, and applicable to different plant types is required.
Currently, plants are subjected to genetic modification primarily by the delivery of exogenous DNA encoding a desired trait, rather than by direct delivery of a target protein. The higher stability of DNA over proteins is a prime advantage; nevertheless, potential problems associated with DNA delivery include the random insertion of exogenous DNA into the plant genome and unintended transmission of antibiotic resistance genes to pathogenic bacteria via horizontal gene transfer9. For genome-editing purposes, the ability to edit plant genomes without introducing foreign DNA into cells may circumvent regulatory concerns related to genetically modified plants. Thus, an alternative DNA-free strategy for the modification of plants by direct delivery of protein will be able to cater to these needs.
Here we introduce a peptide-based system, originally developed for human gene therapy10-14, for the targeted delivery of exogenous genes or proteins in intact plants. Peptides are able to protect DNA from nuclease degradation and can mediate gene transfer across cell as well as organellar membranes15-17. They also have diverse and tunable properties besides being non-cytotoxic18-20. More importantly, with the use of peptides, genes can be precisely targeted to intracellular organelles such as the mitochondria21 or plastids (chloroplasts)22 for expression-a task not achievable by biolistic or Agrobacterium-mediated transformation. Depending on the cargo type, this new plant modification technology can be exploited to deliver proteins23 and either express (plasmid21,24 or double-stranded DNA25) or down-regulate (double-stranded RNA26) specific genes within the plant, throughout its cytosolic space24-26 or within a specific organellar compartment21. The designed carrier peptides consist of a cationic domain in the form of either polylysine (K8) or polylysine-co-histidine (KH)9 for binding and/or condensation of negatively-charged cargoes, which is conjugated to cell penetrating (BP100 peptide) or mitochondria transit (Cytcox peptide) sequences.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2358">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:453px;">(KH)9-BP100 peptide</td>
			<td style="width:355px;">Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH- 
			KHKKLFKKILKYL</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:453px;">(BP100)2-K8 peptide</td>
			<td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td>Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- 
			KYLKKKKKKKK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BP100 peptide</td>
			<td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td>Sequence: KKLFKKILKYL</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Cytcox-(KH)9 peptide</td>
			<td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td>Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- 
			KHKHKHKHKHKH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS</td>
			<td style="width:355px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc</td>
			<td style="width:355px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS)</td>
			<td style="width:355px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GFP5 siRNA</td>
			<td style="width:355px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CHS siRNA</td>
			<td style="width:355px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">1 mL and 10 mL Plastic Syringes</td>
			<td>TERUMO Corporation</td>
			<td>SS-01T, SS-10ESZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">1.5 mL Microcentrifuge Tube</td>
			<td>AS ONE Corporation</td>
			<td>151212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">96-Well Flat-Bottom Plate</td>
			<td>Asahi Glass Co., Ltd.</td>
			<td>3860-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Adhesive Tape</td>
			<td>Sekisui Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>No. 835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Alcohol Dehydrogenase</td>
			<td style="width:355px;">Sigma-Aldrich Co., LLC.</td>
			<td style="width:315px;">A-7011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Atomic Force Microscope</td>
			<td>Seiko Instruments Inc.</td>
			<td>SPI3800, SPA 300HV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Atomic Force Microscope</td>
			<td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td>
			<td>AFM5300E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Cantilever</td>
			<td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td>
			<td>K-A102001593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Cork Borer</td>
			<td style="width:355px;">Sigma-Aldrich Co., LLC.</td>
			<td>Z165220</td>
			<td>For excision of leaves into 1-cm diameter disks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Coverslip</td>
			<td style="width:355px;">Matsunami Glass Ind., Ltd.</td>
			<td style="width:315px;">C02261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Cuvette</td>
			<td style="width:355px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:315px;">759116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Folded Capillary Cell</td>
			<td style="width:355px;">Malvern Instruments, Ltd.</td>
			<td style="width:315px;">DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Forceps</td>
			<td style="width:355px;">Shimizu Akira Inc.</td>
			<td style="width:315px;">Stainless pincet 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Homogenization Pestle</td>
			<td>Ieda Trading Corp.</td>
			<td style="width:315px;">9993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mica</td>
			<td>Nisshin EM Co., Ltd.</td>
			<td style="width:315px;">LC23Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:315px;">BKA46472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices Corporation</td>
			<td style="width:315px;">Spectra MAX M3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Microscope Slide</td>
			<td style="width:355px;">Matsunami Glass Ind., Ltd.</td>
			<td>S011120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Pipette</td>
			<td style="width:355px;">Eppendorf Research&#174; plus</td>
			<td>3120000909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Pipette Tips</td>
			<td>AS ONE Corporation</td>
			<td>2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Plastic Petri Dish</td>
			<td>AS ONE Corporation</td>
			<td>1-7484-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Renilla Luciferase Assay Kit</td>
			<td>Promega corporation</td>
			<td>E2810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Rhodamine B Isothiocyanate</td>
			<td style="width:355px;">Sigma-Aldrich Co., LLC.</td>
			<td style="width:315px;">283924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">RNase-Free Water</td>
			<td style="width:355px;">Qiagen</td>
			<td style="width:315px;">129112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Sodium Carbonate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>199-01585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Surgical Blade and Handle</td>
			<td>FEATHER Safety Razor Co., Ltd.</td>
			<td>Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Syringe Tip Cap</td>
			<td>Musashi Engineering Inc.</td>
			<td>NC-3E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Weighing Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>CPA225D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Zeta Potentiometer</td>
			<td>Malvern Instruments, Ltd.</td>
			<td>Zetasizer Nano-ZS</td>
			<td style="width:1235px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

peptide-derived method to transport genes and proteins across cellular and organellar barriers in plants

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.

nükleik asit ve protein yüklerin bir dizi başarılı iletim vektörleri olarak dizayn peptidler kullanılarak çeşitli bitkilerin içine katılmıştır. Katyonik peptitler ve negatif yüklü yük arasındaki elektrostatik etkileşimleri doğrudan bir iğnesiz enjektör (Şekil 1) kullanılarak yaprakları bitkiye nüfuz edilebilir transfeksiyon kompleksleri oluşumu ile sonuçlanmıştır. Bitki hücrelerinin transfeksiyonu için (deneysel olarak bu çalışmalarda 21,23-26 belirlenen) optimize edilmiş formülasyonlar teslim yük (pDNA, dsDNA, dsRNA ve protein) geniş her tür temsil Tablo 1 &#39;de listelenmiştir. 300 nm - bütün peptit bazlı formülasyonların ortalama çapı 150 yaklaşık aralığında idi. DLS analizine dayanarak, tüm formülasyonlar oluşan peptit kargo gruplar, tek bir boyut dağılımına sahip olduğunu gösterir, nispeten küçük boyut çoklu-dağılırlıklan gösterilir. morfolojileriPeptit ve pDNA (Şekil 2A) ya da protein (Şekil 2B) arasındaki kompleksler, mika, AFM ile görüntülenmiştir. Homojen küresel kompleksleri DLS ölçümlerinden elde edilen verilerle uyum içinde, hem peptid-pDNA ve peptid-protein kombinasyonları için gözlenmiştir. DsRNA&#39;nın bazlı kompleksler nötre yakın yüzey yüküne vardı kompleksleri (Tablo 1) zeta potansiyeli açısından, pDNA- ve dsDNA türevi kompleksleri, net negatif yüzey yükleri vardı. Peptid-protein kompleksleri, diğer taraftan, pozitif yüklü edildi. Peptid-PDNA ve model bitki sistemleri A. thaliana ya da N. benthamiana transfeksiyonunu aracılık peptit-dsDNA formülasyonların verimleri niteliksel yanı sıra kantitatif olarak değerlendirildi. RLuc gen deneyi Bu deney, pDNA için, bu nedenle, gen ekspresyon düzeylerinin ölçümü (Tablo 1) kullanılmıştır veRLuc genini kodlayan dsDNA ilgili taşıyıcı peptidler ile kompleks için kullanılmalıdır. Yaklaşık 1 X 10 5 tahmini RLU / Mg değeri, 12 saatlik bir inkübasyon döneminden sonra, (KH) 9 -BP100 / pDNA formülasyonu nükleer hedefli dağıtım ve pDNA ekspresyonu elde edilebilir kullanılması. PDNA, peptidler bir kombinasyonunun mitokondriyal hedefli dağıtım ve ekspresyon için, Cytcox- (KH) 9 ve BP100, kompleks oluşumu için gereklidir. 12 saat aynı inkübasyon süresi ile, ancak, transfeksiyon (yaklaşık olarak 1 x 10 3 RLU / mg), çok daha düşük bir seviyede elde edilmiştir. Bu arada, benzer kuluçka dönemi (12 saat) ve gen ifadesi seviyesi (yaklaşık 1 × 10 3 RLU / mg) da 9 -BP100 peptit (KH) kullanılarak formüle, dsDNA tabanlı kompleksleri için kaydedilen / gerekmiştir. Gen ifadesinin niteliksel değerlendirmeleri kompleksleri HAZIRLIK işlenmiş yaprakları direkt mikroskopik gözlem ile gerçekleştirilmiştired pDNA kullanarak veya dsDNA GFP raportör genini kodlayan. Hedeflenmemiş peptide pDNA kompleksleri ile transfekte edilen hücrelerde, GFP tanımı açıkça görülmektedir ve sitosol (Şekil 3A) lokalize olduğu görülmüş, karşılık gelen yeşil floresan yayılır. GFP floresan lokalizasyonu deseni belirgin farklılıklar mitokondriyal hedefli peptid-pDNA kompleksleri ile infiltre hücrelerde belirgindi. Burada, mitokondriyal leke ile colocalize noktalı yeşil floresan hücrelerin mitokondrial bölmeye (Şekil 3B), münhasıran, gen ekspresyonu özgünlüğünü teyit görülebiliyordu. peptid-protein formülasyonlan söz konusu olduğunda, bir florofor (RhB) protein yük (ADH) konjugasyonu hücre bölmesine verilen protein görselleştirme sağlayacaktır. 6 saat gibi kısa bir kuluçka dönemi içinde, ADH-RhB proteini (mavi) boyunca dağılmış olduğu bulunmuşturSitosol ve infiltre hücreler, hücre arası boşluk (Şekil 3C). Öte yandan, bir gen ifadesinin hızlı ve etkili bir aşağı-regülasyon peptid-dsRNA formülasyonlar kullanılarak, çeşitli bitkilerde gerçekleştirilebilir. İlk deneyde, A. thaliana yaprağı peptid-dsRNA ile infiltre edildi kuraklık koşullarında antosiyanin (kırmızı pigment) biyosentezi için sorumlu kalkon sentaz geni (CHS) susturmak için kompleksleri. A. thaliana görünümünde fark (b Şekil 3B) optimize edilmiş peptid-dsRNA formülasyonu kullanarak susturmak CHS değerlendirmek için kolay bir yol sağlanan ve kuraklık, normal (a Şekil 3D) (ok 1 sızmış bölgeyi gösterir) altında bırakır. İkinci deneyde, peptit dsRNA kompleksleri sarı floresan protein (YFP) eksprese eden transjenik A. thaliana yapraklarına süzüldü. YFP ekspresyonunda belirgin bir azalma epidermal hücreler 9 saat p görülebilirost transfeksiyon (Şekil 3E, F). Farklı bitki sistemi (kavak, 12 saat post-transfeksiyon) &#39;de düzenleyici gen ekspresyonu formülasyonun etkinliği de (Şekil 3G, lH) doğrulanmıştır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig1.jpg" /> Şekil 1: Yaşam Bitkiler içine nükleik asit ve protein Cargoes teslimi için Peptit tabanlı formülasyonlar. tasarlanmış taşıyıcı peptidler, hücre penetran veya organel geçiş dizileri konjuge polikatyon oluşmaktadır. Polikatyonlar hücrelerine içselleştirme aşağıdaki endozomal bölmesinden ve / veya negatif yüklü yüklerin yoğunlaşmasını yanı sıra kaçış bağlayıcı etkinleştirin. Belirli organellere hücrelere yük teslim ve daha sonra, sırasıyla, hücre nüfuz dizileri ve organel geçiş dizileri tarafından aracılık eder. successfu olabilir çeşitli yüklerinlly bitkiye verilen sığır serum albümini (BSA), alkol dehidrogenaz (ADH) ve sitrin (sarı floresan proteinin bir varyantı) gibi nükleik gibi pDNA, dsDNA ve dsRNA gibi asitler, örnek olarak alınan proteinler. Biyoaktif moleküllerin şırınga infiltrasyonu ile bitki yapraklarının sokulur elektrostatik etkileşimler yoluyla peptit konjugatları ile transfeksiyon kompleksler oluşturabildiği. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54972/54972fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig2.jpg" /> Şekil 2: peptit bazlı formülasyonların morfolojileri. (KH) N / P 0.5 de 9 -BP100 / pDNA formülasyonu (A) AFM genlik görüntü. (B) (BP100) molar Rati 2 K 8 / ADH formülasyonunun AFM yüksekliği görüntüsüo 10. yayınlanmış kaynaklardan 23,24 izni ile çoğaltılmıştır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54972/54972fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54972/54972fig3.jpg" /> Şekil 3: Optimize Peptit bazlı formülasyonlar kullanılarak Transfeksiyon Efficiencies Mikroskopik değerlendirilmesi. A. thaliana süngerimsi mezofil hücrelerinde gözlenmiştir (A) kloroplast otofloresans (kırmızı) açıkça ayırt Sitosolik GFP (yeşil), (KH) 9 -BP100 / pDNA formülasyonu (N sızmış yaprakları / P 0.5; 12 saat ). (B) GFP tanımı (yeşil), her bir peptidi için Cytcox- (KH) ile infiltre A. thaliana yaprağı 9 / BP100 / pDNA formülasyonu (N / P, 0.5 epidermal hücrelerinde mitokondri (kırmızı) saptandıe; 12 saat). GFP ile mitokondri genişlemiş görüntüleri aşırı sağ panelde gösterilir. A. thaliana süngerimsi mezofil hücrelerine ADH-RHB (mavi) (C) Teslim, 10 bir peptit / protein molar oranında (BP100) 2 K 8 aracılık ettiği 6 saat sonrası infiltrasyon görüntülenmiştir bırakır. Önce (D) A. thaliana yaprağı (a) ve (KH) 9 -BP100 / dsRNA formülasyonu (mol oranı 2; 48 saat) ile birlikte, (b) tedavi sonrası, antosiyanin biyosentez yolunun bastırılması ile sonuçlanmıştır. GFP5 dsRNA içeren benzer bir formülasyon negatif kontrol (C) ve kanadı içine infiltre edildi. oklar 2 ve 4 yaprak içinde olmayan sızmış alan işaret ederken oklar 1 ve 3 sızmış alanı belirtir. (E), A. thaliana sarı floresan protein (YFP) ve (F) infiltrasyon, aşağıdaki azalmış YFP floresan ifade bırakır<html> (KH) 9 -BP100 / dsRNA formülasyonu (molar oranı 2; 9 saat). (G) sarı floresan protein (YFP) ve (H) (KH) 9 -BP100 / dsRNA formülasyonu ile azalmış YFP floresan Aşağıdaki infiltrasyon ifade eden transjenik kavak yaprakları (mol oranı 2; 12 saat). Yayınlanmış kaynaklardan 21,23,24,26 izni ile çoğaltılmıştır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54972/54972fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54972/54972fig4.jpg" /> Şekil 4:-DNA Peptide-(N / P) Oran ve Kompleksleri Biyofizik Özellikleri Üzerine Etkisi Varyasyon. DNA oranı peptidi artan peptit bazlı formülasyonlar da Zeta potansiyeli değerleri geçiş sırasında negatiften pozitife boyutu azalır./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972table1.jpg" /> Tablo 1: Karakterizasyonu ve çeşitli peptid bazlı formülasyonlarının değerlendirilmesi. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54972/54972table1large.jpg" target="_blank">Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Tablo 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972table2.jpg" /> Tablo 2: Bozulmamış Bitkiler için Peptit tabanlı ve diğer Mevcut DNA Teslim Teknolojileri Karşılaştırılması. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54972/54972table2large.jpg" target="_blank">Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants at JoVE.com

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

Peptit kaynaklı Yöntem Bitkiler Genler ve Proteinler Hücresel karşısında ve Organel Engeller Transport

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

peptide-derived-method-to-transport-genes-proteins-across-cellular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

10.5K Görüntüleme.  RIKEN Center for Sustainable Resource Science. Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

Video: Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation of gene functions. Their therapeutic potential in the heart can also be determined. There are limited approaches for in vivo molecular intervention in the mouse heart. Recombinant adeno-associated virus (rAAV)-based genome engineering has been utilized as an essential tool for in vivo cardiac gene manipulation. The specific advantages of this technology include high efficiency, high specificity, low genomic integration rate, minimal immunogenicity, and minimal pathogenicity. Here, a detailed procedure to construct, package, and purify the rAAV9 vectors is described. Subcutaneous injection of rAAV9 into neonatal pups results in robust expression or efficient knockdown of the gene(s) of interest in the mouse heart, but not in the liver and other tissues. Using the cardiac-specific TnnT2 promoter, high expression of GFP gene in the heart was obtained. Additionally, target mRNA was inhibited in the heart when a rAAV9-U6-shRNA was utilized. Working knowledge of rAAV9 technology may be useful for cardiovascular investigations.

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

Fare Kalpler eksprese rAAV9 hazırlanması veya demonte Genler

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Genetik

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5' mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5' mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.

Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

Fizyolojik Oksijen Koşullarına Maruz İnsan hücrelerinde Cap-bağlayıcı proteinlerin analizi

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic fragments. Organellar genomes also exist in admixtures within a given cell or tissue type (heteroplasmy), and an abundance of subtypes may change throughout development or when under stress (sub-stoichiometric shifting). Next-generation sequencing (NGS) technologies are required to obtain deeper understanding of organellar genome structure and function. Traditional sequencing studies use several methods to obtain organellar DNA: (1) If a large amount of starting tissue is used, it is homogenized and subjected to differential centrifugation and/or gradient purification. (2) If a smaller amount of tissue is used (i.e., if seeds, material, or space is limited), the same process is performed as in (1), followed by whole-genome amplification to obtain sufficient DNA. (3) Bioinformatics analysis can be used to sequence the total genomic DNA and to parse out organellar reads. All these methods have inherent challenges and tradeoffs. In (1), it may be difficult to obtain such a large amount of starting tissue; in (2), whole-genome amplification could introduce a sequencing bias; and in (3), homology between nuclear and organellar genomes could interfere with assembly and analysis. In plants with large nuclear genomes, it is advantageous to enrich for organellar DNA to reduce sequencing costs and sequence complexity for bioinformatics analyses. Here, we compare a traditional differential centrifugation method with a fourth method, an adapted CpG-methyl pulldown approach, to separate the total genomic DNA into nuclear and organellar fractions. Both methods yield sufficient DNA for NGS, DNA that is highly enriched for organellar sequences, albeit at different ratios in mitochondria and chloroplasts. We present the optimization of these methods for wheat leaf tissue and discuss major advantages and disadvantages of each approach in the context of sample input, protocol ease, and downstream application.

The comparison and optimization of two plant organellar DNA enrichment methods are presented: traditional differential centrifugation and fractionation of the total gDNA based on methylation status. We assess the resulting DNA quantity and quality, demonstrate performance in short-read next-generation sequencing, and discuss the potential for use in long-read single-molecule sequencing.

Yeni nesil Sıralama için Uygun Bitki Organelleri DNA Zenginleştirme Yöntemlerinin Optimizasyonu ve Karşılaştırmalı Analizi

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can potentially increase risk of sudden unexpected death in epilepsy (SUDEP). Electroencephalography (EEG) and electrocardiography (ECG) are widely used clinical diagnostic tools to monitor for abnormal brain and cardiac rhythms in patients. Here, a technique to simultaneously record video, EEG, and ECG in mice to measure behavior, brain, and cardiac activities, respectively, is described. The technique described herein utilizes a tethered (i.e., wired) recording configuration in which the implanted electrode on the head of the mouse is hard-wired to the recording equipment. Compared to wireless telemetry recording systems, the tethered arrangement possesses several technical advantages such as a greater possible number of channels for recording EEG or other biopotentials; lower electrode costs; and greater frequency bandwidth (i.e., sampling rate) of recordings. The basics of this technique can also be easily modified to accommodate recording other biosignals, such as electromyography (EMG) or plethysmography for assessment of muscle and respiratory activity, respectively. In addition to describing how to perform the EEG-ECG recordings, we also detail methods to quantify the resulting data for seizures, EEG spectral power, cardiac function, and heart rate variability, which we demonstrate in an example experiment using a mouse with epilepsy due to Kcna1 gene deletion. Video-EEG-ECG monitoring in mouse models of epilepsy or other neurological disease provides a powerful tool to identify dysfunction at the level of the brain, heart, or brain-heart interactions.

Here, we present a protocol to record brain and heart bio signals in mice using simultaneous video, electroencephalography (EEG), and electrocardiography (ECG). We also describe methods to analyze the resulting EEG-ECG recordings for seizures, EEG spectral power, cardiac function, and heart rate variability.

Eş zamanlı Video-EEG-EKG Neurocardiac disfonksiyon epilepsi fare modelleri tanımlamak için izleme

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including cancers. These small regulatory RNAs mainly interact with the 3&#8217; untranslated regions (3&#8217; UTR) of their target messenger RNAs (mRNAs) ultimately resulting in the inhibition of decoding processes of mRNAs and the augmentation of target mRNA degradations. Based on the expression levels and intracellular functions, miRNAs are able to serve as regulatory factors of oncogenic and tumor-suppressive mRNAs. Identification of bona fide target genes of a miRNA among hundreds or even thousands of computationally predicted targets is a crucial step to discern the roles and basic molecular mechanisms of a miRNA of interest. Various miRNA target prediction programs are available to search possible miRNA-mRNA interactions. However, the most challenging question is how to validate direct target genes of a miRNA of interest. This protocol describes a reproducible strategy of key methods on how to identify miRNA targets related to the function of a miRNA. This protocol presents a practical guide on step-by-step procedures to uncover miRNA levels, functions, and related target mRNAs using the probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR), sulforhodamine B (SRB) assay following a miRNA mimic transfection, dose-response curve generation, and luciferase assay along with the cloning of 3&#8217; UTR of a gene, which is necessary for proper understanding of the roles of individual miRNAs.

This protocol uses a probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR), a sulforhodamine B (SRB) assay, 3&#8217; untranslated regions (3&#8217; UTR) cloning, and a luciferase assay to verify the target genes of a miRNA of interest and to understand the functions of miRNAs.

Tümör hücrelerinde MicroRNA seviyeleri, fonksiyonları ve Ilişkili hedef genler değerlendirmek için bir In vitro protokol

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational steps are used to regulate specific genes. Sequence-specific nucleic acid-binding proteins target specific sequences to control spatial or temporal gene expression. The binding sites in nucleic acids are typically characterized by mutational analysis. However, numerous proteins of interest have no known binding site for such characterization. Here we describe an approach to identify previously unknown binding sites for RNA-binding proteins. It involves iterative selection and amplification of sequences starting with a randomized sequence pool. Following several rounds of these steps-transcription, binding, and amplification-the enriched sequences are sequenced to identify a preferred binding site(s). Success of this approach is monitored using in vitro binding assays. Subsequently, in vitro and in vivo functional assays can be used to assess the biological relevance of the selected sequences. This approach allows identification and characterization of a previously unknown binding site(s) for any RNA-binding protein for which an assay to separate protein-bound and unbound RNAs exists.

Sequence specificity is critical for gene regulation. Regulatory proteins that recognize specific sequences are important for gene regulation. Defining functional binding sites for such proteins is a challenging biological problem. An iterative approach for identification of a binding site for an RNA-binding protein is described here and is applicable to all RNA-binding proteins.

Düzenleyici RNA Bağlayıcı Proteinler için Bağlayıcı Siteleri Belirlemek için Sıra Alanını Keşfetmek

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic screening using chemical mutagens is a useful strategy for mapping mutant phenotypes to genes among Drosophila and other model organisms that share conserved cellular pathways with humans. If the mutated gene of interest is not lethal in early developmental stages of flies, a climbing assay can be conducted to screen for phenotypic indicators of decreased brain functioning, such as low climbing rates. Subsequently, secondary histological analysis of brain tissue can be performed in order to verify the neuroprotective function of the gene by scoring neurodegeneration phenotypes. Gene mapping strategies include meiotic and deficiency mapping that rely on these same assays can be followed by DNA sequencing to identify possible nucleotide changes in the gene of interest.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

We present a protocol using a forward genetic approach to screen for mutants exhibiting neurodegeneration in Drosophila melanogaster. It incorporates a climbing assay, histology analysis, gene mapping and DNA sequencing to ultimately identify novel genes related to the process of neuroprotection.

In vivo Ileri genetik ekran Drosophila melanogaster yeni Nörokoruyucu genler tanımlamak için

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in regulating gene expression at the post-transcriptional level. Sequencing sRNA libraries by Next Generation Sequencing (NGS) methods has been widely employed to identify and analyze miRNA transcriptomes in the last decade, resulting in a rapid increase of miRNA discovery. However, two major challenges arise in plant miRNA annotation due to increasing depth of sequenced sRNA libraries as well as the size and complexity of plant genomes. First, many other types of sRNAs, in particular, short interfering RNAs (siRNAs) from sRNA libraries, are erroneously annotated as miRNAs by many computational tools. Second, it becomes an extremely time-consuming process for analyzing miRNA transcriptomes in plant species with large and complex genomes. To overcome these challenges, we recently upgraded miRDeep-P (a popular tool for miRNA transcriptome analyses) to miRDeep-P2 (miRDP2 for short) by employing a new filtering strategy, overhauling the scoring algorithm and incorporating newly updated plant miRNA annotation criteria. We tested miRDP2 against sequenced sRNA populations in five representative plants with increasing genomic complexity, including Arabidopsis, rice, tomato, maize and wheat. The results indicate that miRDP2 processed these tasks with very high efficiency. In addition, miRDP2 outperformed other prediction tools regarding sensitivity and accuracy. Taken together, our results demonstrate miRDP2 as a fast and accurate tool for analyzing plant miRNA transcriptomes, therefore a useful tool in helping the community better annotate miRNAs in plants.

A bioinformatics pipeline, namely miRDeep-P2 (miRDP2 for short), with updated plant miRNA criteria and an overhauled algorithm, could accurately and efficiently analyze microRNA transcriptomes in plants, especially for species with complex and large genomes.

Bitkilerdeki MikroRNA Transkripsiyonlarını Doğru ve Verimli Bir Şekilde Analiz Eden Bir Biyoinformatik Boru Hattı

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...