This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada and the Ontario Ministry of Research and Innovation.

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+translation+initiation+in+eukaryotes:+mechanisms+and+biological+targets.">Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets.</a> Cell. 136 (4), 731-745 (2009).</li><li>Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4+initiation+factors:+effectors+of+mRNA+recruitment+to+ribosomes+and+regulators+of+translation.">eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation.</a> Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).</li><li>Weingarten-Gabbay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genetics.+Systematic+discovery+of+cap-independent+translation+sequences+in+human+and+viral+genomes.">Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes.</a> Science. 351 (6270), (2016).</li><li>Andreev, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+glucose+deprivation+induces+widespread+alterations+in+mRNA+translation+within+20+minutes.">Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes.</a> Genome Biol. 16, 90 (2015).</li><li>Ho, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Reprogramming+of+Translation+Efficiencies+on+Oxygen+Stimulus.">Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus.</a> Cell Rep. 14 (6), 1293-1300 (2016).</li><li>Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+studies+uncover+the+diversity+of+modes+of+mRNA+recruitment+to+eukaryotic+ribosomes.">Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 49 (2), 164-177 (2014).</li><li>Ho, J. J., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cap+for+Every+Occasion:+Alternative+eIF4F+Complexes.">A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes.</a> Trends Biochem Sci. , (2016).</li><li>Lin, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHAS-I+as+a+link+between+mitogen-activated+protein+kinase+and+translation+initiation.">PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation.</a> Science. 266 (5185), 653-656 (1994).</li><li>Richter, J. D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cap-dependent+translation+by+eIF4E+inhibitory+proteins.">Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins.</a> Nature. 433 (7025), 477-480 (2005).</li><li>Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+interaction+of+the+mammalian+eIF4E-related+protein+4EHP+with+4E-BP1.">Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1.</a> FEBS Lett. 564 (1-2), 58-62 (2004).</li><li>Rom, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+4EHP,+a+novel+mammalian+eIF4E-related+cap-binding+protein.">Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein.</a> J Biol Chem. 273 (21), 13104-13109 (1998).</li><li>Uniacke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen-regulated+switch+in+the+protein+synthesis+machinery.">An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery.</a> Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).</li><li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+4EHP-GIGYF2+translational+repressor+complex+is+essential+for+mammalian+development.">A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development.</a> Mol Cell Biol. 32 (17), 3585-3593 (2012).</li><li>Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+messenger+RNA+cap-binding+protein+using+a+new+affinity+medium.">Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium.</a> Biochemistry. 23 (2), 177-181 (1984).</li><li>Kiriakidou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+mRNA+m7G+cap+binding-like+motif+within+human+Ago2+represses+translation.">An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation.</a> Cell. 129 (6), 1141-1151 (2007).</li><li>Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+induced+fit+recognition+of+an+m(7)GpppG+cap+analogue+by+the+human+nuclear+cap-binding+complex.">Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex.</a> EMBO J. 21 (20), 5548-5557 (2002).</li><li>Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+cap-binding+complex+and+RNA+export+factor+is+required+for+intronless+mRNA+export.">The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export.</a> J Biol Chem. 282 (21), 15645-15651 (2007).</li><li>Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+properties+and+dynamic+localization+of+an+alternative+isoform+of+the+cap-binding+complex+subunit+CBP20.">Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20.</a> Nucleus. 1 (5), 412-421 (2010).</li><li>Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+cap-binding+protein+from+Arabidopsis+thaliana.">Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10325-10330 (1998).</li><li>Ptushkina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+eIF4E+protein+in+Schizosaccharomyces+pombe+has+distinct+eIF4G-binding+properties.">A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties.</a> Nucleic Acids Res. 29 (22), 4561-4569 (2001).</li><li>Cho, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+paradigm+for+translational+control:+inhibition+via+5'-3'+mRNA+tethering+by+Bicoid+and+the+eIF4E+cognate+4EHP.">A new paradigm for translational control: inhibition via 5'-3' mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP.</a> Cell. 121 (3), 411-423 (2005).</li><li>Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+a+small+subset+of+Caenorhabditis+elegans+mRNAs+is+dependent+on+a+specific+eukaryotic+translation+initiation+factor+4E+isoform.">Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform.</a> Mol Cell Biol. 25 (1), 100-113 (2005).</li><li>Timpano, S., Uniacke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Cells+Cultured+Under+Physiological+Oxygen+Utilize+Two+Cap-binding+Proteins+to+Recruit+Distinct+mRNAs+for+Translation.">Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation.</a> J Biol Chem. , (2016).</li><li>Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+experience+with+118+brain+tissue+oxygen+partial+pressure+catheter+probes.">Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes.</a> Neurosurgery. 43 (5), 1082-1095 (1998).</li><li>Le, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+tumor+oxygenation+and+gene+expression+in+patients+with+early+stage+non-small+cell+lung+cancers.">An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers.</a> Clin Cancer Res. 12 (5), 1507-1514 (2006).</li><li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+desflurane+and+isoflurane+on+intestinal+tissue+oxygen+pressure+during+colorectal+surgery.">Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery.</a> Anaesthesia. 57 (2), 110-115 (2002).</li><li>Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tissue+partial+pressure+of+oxygen+and+carbon+dioxide+during+partial+hepatectomy.">Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy.</a> Br J Anaesth. 92 (5), 735-737 (2004).</li><li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renocortical+tissue+oxygen+pressure+measurements+in+patients+undergoing+living+donor+kidney+transplantation.">Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation.</a> Anesth Analg. 87 (2), 474-476 (1998).</li><li>Richardson, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+intracellular+oxygenation:+the+impact+of+ambient+oxygen+availability.">Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability.</a> J Physiol. 571 (Pt 2), 415-424 (2006).</li><li>Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+saturation+in+the+bone+marrow+of+healthy+volunteers.">Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers.</a> Blood. 99 (1), 394 (2002).</li><li>Gleadle, J., Ratcliffe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hypoxia. , (2001).</li><li>Gluckman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+reconstitution+in+a+patient+with+Fanconi's+anemia+by+means+of+umbilical-cord+blood+from+an+HLA-identical+sibling.">Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling.</a> N Engl J Med. 321 (17), 1174-1178 (1989).</li><li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensitivity+severely+limits+the+replicative+lifespan+of+murine+fibroblasts.">Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts.</a> Nat Cell Biol. 5 (8), 741-747 (2003).</li><li>Jewell, U. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+HIF-1alpha+in+response+to+hypoxia+is+instantaneous.">Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous.</a> FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).</li><li>Newby, D., Marks, L., Lyall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissolved+oxygen+concentration+in+culture+medium:+assumptions+and+pitfalls.">Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls.</a> Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+cap-dependent+translation+by+4E-binding+protein+1:+competition+with+p220+for+binding+to+eukaryotic+initiation+factor-4E.">Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E.</a> EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).</li><li>Pyronnet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+eukaryotic+translation+initiation+factor+4G+(eIF4G)+recruits+mnk1+to+phosphorylate+eIF4E.">Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E.</a> EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).</li><li>Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISG15+modification+of+the+eIF4E+cognate+4EHP+enhances+cap+structure-binding+activity+of+4EHP.">ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP.</a> Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+ternary+complex+(eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules.">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li><li>Gu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+structure,+mechanism,+and+regulation+of+scavenger+mRNA+decapping+activity.">Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity.</a> Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).</li><li>Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+resins+containing+enzymatically+resistant+mRNA+cap+analogs--a+new+tool+for+the+analysis+of+cap-binding+proteins.">Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins.</a> RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).</li><li>Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mammalian+eIF4E-family+members.">Characterization of mammalian eIF4E-family members.</a> Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

הניתוח של חלבוני קושרי כובע בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיסיולוגיים יכול לאפשר זיהוי של גורמי ייזום תרגום רומן מוסדר חמצן. הזיקה של הגורמים הללו עבור המכסה &#39;5 של mRNA או חלבונים הקשורים כובע אחרים ניתן למדוד את עוצמת הקשר שלהם אל מ 7 GTP צמודים חרוזי Agarose. אזהרה אחת של טכניקה זו היא כי הוא מודד את הפוטנציאל מחייב כובע של חלבונים-ימסו פוסט, אבל זה מבוצע בתנאים שאינם denaturing המקיימים אינטראקציות חלבון-חלבון ופוסט translational שינויים (PTMs). אינטראקציות חלבון-חלבון כמה לתווך את הכריכה של המשפחה eIF4E את הכובע &#39;5. 4E-BP נקשר ומדכא eIF4E ידי חסימת האינטראקציה שלה עם eIF4G ומניעת גיוס של 43s מראש חניכה 38 מורכבים. מתחם eIF4E / 4E-BP נשאר קשור 5 כובע mRNA &#39;, שמנע מראש כל חניכה מן התעתיק שעליו, והוא יכוללשמש כסמן עיכוב eIF4E בעמודות זיקה GTP מ 7. לעומת זאת, האינטראקציה של eIF4E עם eIF4G על עמודות מ 7 GTP יכול לשמש כסמן ייזום התרגום פעיל. PTMs הוא עוד שיטה להסדיר את הפעילות של גורמי ייזום תרגום. לדוגמה, זירחון של eIF4E ידי Mnk1 יכול להגדיל וזיקתה עבור mRNA &#39;5 מכסה 39. תכונת השינוי של החלבון המקודד על ידי 15 אינטרפרון מאולצת ג&#39;ין (ISG15) הוא PTM המגביר את פעילותם מחייב כובע של eIF4E2 בתגובה אינדוקציה אינטרפרון באמצעות זיהום הפתוגן 40. גן ISG15 מכיל מרכיב תגובה היפוקסיה ב האמרגן שלה טוען כי מערכת זו יכולה לווסת eIF4E2 חמצן נמוך. מעט מאוד ידוע על איך PTMs רשאית לשנות את הפעילות של חלבונים קושרי כובע במהלך תנאי חמצן רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. טכניקה זו ואחריו ניתוח ספקטרומטריית מסה יכול לחשוף מוסדר חמצן הרומן רלוונטי מבחינה פיזיולוגית PTMs הב לתווך הפעילות של גורמי ייזום תרגום. שיטה חלופית כדי לכיד עם אנלוגי כובע מ 7 GTP תהיה immunoprecipitate חלבון ידוע מחייב כובע כגון eIF4E או eIF4G ולבצע ספקטרומטריית מסה לזהות חלבונים קשורים. הגבלה של אסטרטגיה זו היא כי חלבוני קושרי כובע לעתים קרובות יש תפקידים הסלולר חלופיים כגון בתוך לחץ גרגירי 41 או בתרגום כובע-עצמאי 1,4. לכן, ניצול מ 7 אנלוגים GTP כובע היא הטובה ביותר, השיטה האמינה ביותר לבודד חלבוני קושרי כובע, במיוחד כאשר חוקרים חלבוני כובע הקשורים רומן. הגבלה של ניצול אנלוגי כובע GTP מ 7 היא שחלק חלבונים קושרי כובע כמו נבלות decapping אנזים DcpS לא רק אינטראקציה עם כובע mRNA מ 7 GTP, אלא גם לחייב את הבסיס השני לכריכה 42. יתר על כן, אנזימים decapping בכלל, כגון מורכבות Dcp1 / Dcp2, יכול hydrolyze GTP מ 7 וביעילות להפחית קיבולת שרף. לכן, כמה חלבונים קושרי כובע עלולים ללכת לאיבוד בניתוח זה. כדי לעקוף אזהרות אלה, תחליפי כובע mRNA עמידים enzymatically יכולים להיות מנוצלים. שני אנלוגים כובע הלא hydrolyzable, mononucleotide מ 7 GpCH2pp או dinucleotide מ 7 GpCH2ppA הוכחו ללכוד DcpS, Dcp1, ו Dcp2 43. אנלוגים כובע mRNA אלה אינם זמינים מסחריים, אבל חייבים להיות מסונתזים כימיים דה נובו. מגבלה נוספת של פרוטוקול זה היא שרק כובע מחייב חלבונים או חלבונים אינטראקציה עם חלבונים קושרי כובע באמצעות &quot;piggybacking&quot; יהיה בשבי. בעוד ייזום תרגום תלוי כובע הוא הסוג העיקרי של ייזום, מנגנונים שאינו קשור כובע הם נפוצים במיוחד במהלך תנאי לחץ תא 1. עם זאת, בהקשר של טכניקה זו המגמות המסתמנות בתחום ייזום התרגום 6-8,24, בזיהוי גורמי מתח המושרה רומן participate בייזום כובע תלוי הוא אזור מבטיח של מחקר. גורם נוסף שיש לשקול בפרוטוקול זה הוא חמצן בתקשורת. Culturing תאים במדיום נוזלי מספק מחסום בין התאים והאווירה. הוכח כי תקשורת נוזלית עשויה להימשך עד 24 שעות כדי לאזן עם רכב הגז האטמוספרי 36. לכן, התאים חייבים להיות מתורבת למשך 24 שעות בזמינות החמצן הרצויה לפני התפרקות או בתקשורת ניתן מראש מותנה אם incubations קצר נדרשים. אוויר טרום כרוך בשמירה על תקשורת תחנת העבודה היפוקסיה במשך שעה 24 לפחות בקבוק תרבות סטרילית המאפשרת חילוף גזים. כל פתרון מחומצן הציג את התאים בתוך תחנת עבודת היפוקסיה יכול לשנות מסלולי איתות הסלולר במהירות כגון ייזום התרגום תלוי כובע הנבחנת בפרוטוקול זה. בשל הרגישות של מסלולי חישת חמצן בתאים, כל פתרון שיביאאינטראקציה עם תאים לפני תמוגה כגון PBS טריפסין-EDTA חייב גם להיות מראש הותנתה hr 24 לפחות. מאגרי תמוגה לשטוף שלאחר תמוגה חייבים לשמש קרים ולכן אינם מראש המתלים לביצוע העבודה היפוקסיה 37 מעלות צלזיוס. בעוד כמה שינויים תלויי חמצן לחלבונים יכולים להיות-ימסו פוסט פעיל, המאגרים הקרים נדרשים לצמצם פעילות אנזימטית ו &quot;דשדוש&quot; של קומפלקסי חלבונים-חלבון או חלבון-RNA שעלולה להוביל חפצים. שינוי כדי בפרוטוקול זה כדי להגדיל את ההחמרה עשוי להיות תנאי מוקדם תמוגה מאגרים לשטוף שלאחר תמוגה למשך 24 שעות ולאחר מכן לדגור אותם על קרח בתוך התחנה העבודה לפני השימוש. מדיה מאגרים לא צריכה להיות כל זמן העבודה היפוקסיה במשך יותר משלושה ימים, כי פתרונות אלו יוכלו להתרכז בשל התאדות מים. עבור מחקרים לטווח ארוך (&gt; 3 ימים), הסכום הראשוני של תאי זרע חייב להישקל בזהירות. ככל שהתאים לחלק את שטח הפנים של המנה הופך צפוף,מדגיש אחר כגון החמצת תקשורת עלול להשפיע על פעילותם של חלבוני קושרי כובע. ביום האחרון של הניסוי, התאים צריכים להיות confluency של 80-90%. ישנם ארבעה שלבים קריטיים בתוך פרוטוקול זה: שמירה על תאי תחנת העבודה היפוקסיה עד תמס, כמות תאים המשמשות, שטיפת החרוזים, ואת שליטת GTP הלא מפוגל. 1) ישנן מספר שיטות כדי לשמור על תאי חמצן נמוך. רוב אלה כוללים תאים קטנים שיכול להכיל מנות תרבית תאים בלבד, אבל כל תמוגה מניפולציה או תא חייבת להתבצע מחוץ לתאים באוויר הסביבה. רכיבים של מכונות חישה-חמצן כגון הגורמים מושרה היפוקסיה מופעלים או מומת בתוך דקה או שתיים 35. לכן, כאמור, lysing התאים עבודה היפוקסיה היא קריטית כדי להבטיח את הפעילות של חלבונים קושרי כובע קשורה זמינות החמצן בהתאמה. 2) מספר תאיםהציע בפרוטוקול זה (שתי מנות 150 מ&quot;מ) הוא נאות מ 7 GTP interactors חזק כמו המשפחה או חברי eIF4E של eIF4F המורכב (eIF4A ו eIF4G). עוד תאים, לפחות חמש 150 מ&quot;מ צלחות, עשויות להידרש לזהות חלבונים עם אינטראקציות חולפות או כי רק מקשר עם הכובע מ 7 GTP mRNA באמצעות eIF4F. 3) שטיפת החרוזים לאחר דוגר אותם עם lysate התא יכולה להתבצע באופן מחמיר ופחות מחמיר. הפרוטוקול המובא כאן מציע אפשרות מחמירים שם חיץ תמוגה משמש לשטוף את החרוזים חמש פעמים. אם חלבונים עם אינטראקציות חלשות Cap-חלבונים מחייבים הם בעלי העניין, אפשר לבצע שטיפות פחות ולנצל מלוחים טריס שנאגר במקום חיץ תמוגה. 4) אמנם חשוב טרום לנקות את lysate התא עם agarose unconjugated להסיר חלבונים שאינם במיוחד אינטראקציה עם חרוז, כמה חלבונים קושרי כובע לא יכול להבדיל בין מבנה כובע mRNA נכון, GTP מפוגל (מ &#39;GTP 7), ו GTP הלא מפוגל. חלבון אחד כזה הוא eIF4E homologue eIF4E3 44. משחרר את החרוזים עם GTP יהיה לסלק את כל חלבון כי גם מכיר GTP הלא מפוגל, אשר יכול להיות עניין. הרלוונטיות הביולוגיות של חלבונים שמזהים הן GTP מ 7 ו GTP טרם הובהרו באופן מלא. זו מודגשת על ידי כמה פרסומים מעורבים eIF4E3 (שהוא חלבון כובע מחייב בתום לב עם תחום כובע מחייב שימור) ביחס החלבונים eIF4E ו eIF4E2, אשר מכירים מ 7 GTP מ GTP הלא מפוגל. טכניקה זו, כפי שהוצגו, ניתן לבצע כגישה ממוקדת לזהות interactors GTP מ 7 של עניין או כגישה רחבה על ידי ניתוח eluate GTP מ 7 באמצעות ספקטרומטריית מסה. כמה טכניקות אחרות לעקוב אחרי חשיפת physioxic (פרוטוקול 4) לנתח פעילות מחייב כובע כגון חלוקת subcellular, immunofluorescence, שיתוף immunoprecipitation,nd ניתוח polysome. שליטת Translational מתגלה תורם שווה ביטוי גנים כמו שעתוק. שימוש בטכניקה זו כדי לחקור את הפעילות ורכב מתחמי חייב כובע שישפוך אור על אופן שבו ייזום תרגום תלוי כובע מוסדר בתגובת חמצן נמוך.

שליטה Translational מתגלה צעד חשוב לא פחות לרגולציה תעתיק בביטוי הגנים, במיוחד בתקופות של מתח הסלולר 1. מוקד שליטת תרגום הוא צעד שער הגבלת חניכה שבו הצעדים הראשונים של סינתזת חלבון לערב הכריכה של 4E גורם ייזום איקריוטיים (eIF4E) אל 7-methylguanosine (מ 7 GTP) 5 &#39;כובע של mRNAs 2 . eIF4E הוא חלק ממכלול trimeric בשם eIF4F הכולל eIF4A, גידול helicase RNA, eIF4G, חלבון פיגומים הנדרש לגיוס של גורמי תרגום אחרים ואת 40S הריבוזום 3. בתנאים פיסיולוגיים נורמלים, רוב mRNAs המכריע מתורגם באמצעות מנגנון כובע תלוי, אבל תחת תקופות של מתח הסלולר כ 10% של mRNAs האנושי מכילים 5 &#39;UTRs עלולה לאפשר תרגום עצמאי-כובע טכס חניכת 1,4. תרגום שווה תלויה כבר היסטורי נרדףמפוקפק עם eIF4F, לעומת זאת, וריאציות ספציפי לחץ של eIF4F הפכו נושאי טרנדים 5-8. מדגיש תאיים שונה לגרום לפעילות eIF4E צורך להדחיק באמצעות היעד היונק של rapamycin מורכבי 1 (mTORC1). קינאז זה הופך לקוי תחת לחץ, וכתוצאה מכך את הפעילות המוגברת של אחד היעדים שלה, 4E-חלבון מחייב (4E-BP). ללא פוספורילציה 4E-BP נקשר eIF4E וחוסם את יכולתה לקיים אינטראקציה עם eIF4G גורם לדיכוי של תרגום תלוי כובע 9,10. נקודה מעניינת היא homolog של eIF4E בשם eIF4E2 (או 4EHP) יש זיקה הרבה יותר נמוך עבור 4E-BP 11, אולי שמאפשר לו לחמוק הדחקה בתיווך מתח. ואכן, בתחילה לאפיין מדכא של התרגום בשל היעדר האינטראקציה עם eIF4G 12, eIF4E2 יוזם את התרגום של מאות mRNAs המכילים אלמנטים בתגובה היפוקסיה רנ&quot;א 3 שלהם &#39;UTR במהלך מתח היפוקסי 6,13. אני הפעלה זושעות מושגת באמצעות אינטראקציות עם eIF4G3, RNA חלבון מחייב מוטיב 4, והגורם היפוקסיה מושרה (HIF) 2α להוות מורכבים eIF4F חוסר חמצן, או eIF4F H 6,13. כתוצאה מדכאת בתנאים רגילים, eIF4E2 נקשר עם GIGYF2 ו ZNF598 14. מתחמים אלה היו, בין שאר, שזוהו באמצעות שרפי זיקת GTP מ 7 Agarose צמודים. השיטה הקלאסית זה 15 הוא תקן בתחום התרגום והוא הטוב ביותר הנפוץ טכניקה לבודד מתחמי מחייב כובע לנתץ ו במבחנה מחייב מבחני 16-19. כמו מכונות תרגום תלוי כובע מתגלה גמישות להתאמה עם חלקים בין-שינוי 6-8,13, שיטה זו היא כלי רב עצמה כדי לזהות חלבוני כובע מחייב רומן במהירות מעורב תגובת הלחץ. יתר על כן, וריאציות eIF4F עשויות להיות השלכות רחבות כמערכות מודל מספר איקריוטיים להופיע להשתמש homolog eIF4E2 לתגובות מתח כזהכמו א thaliana 20, ס Pombe 21, ד melanogaster 22, ו- C. elegans 23. הראיות עולה כי שינויים eIF4F לא יכול להיות מוגבל למצבי לחץ, אבל להיות מעורבים בפיזיולוגיה נורמלי 24. אספקת חמצן לרקמות (בקצוות נימי) או בתוך רקמות (נמדד באמצעות microelectrodes) נע בין 2-6% במוח 25, 3-12% בתוך הריאות 26, 3.5-6% במעי 27, 4% ב הכבד 28, 7-12% בכליה 29, 4% בשריר 30, ו 6-7% ב מח עצם 31. תאי המיטוכונדריה מכילים פחות מ -1.3% חמצן 32. ערכים אלה הם הרבה יותר קרובים היפוקסיה מאשר באוויר הסביבה שבה תאים בתרבית באופן שגרתי. הדבר מצביע על כך מה בעבר נחשבו כמו תהליכים תאיים ספציפי היפוקסיה עשויים להיות רלוונטיים בסביבה פיזיולוגית. מעניין, eIF4F ו eIF4F H </sup&gt; להשתתף באופן פעיל בייזום התרגום של ברכות או כיתות נפרדות של mRNAs בכמה שורות תאים אנושיות שונות נחשפות לחמצן פיסיולוגי או &quot;physioxia&quot; 24. חמצן נמוך גם דוחפת להתפתחות תקינה של העובר 33 ותאי בדרך כלל יש שיעורי התפשטות גבוה, תוחלת החיים ארוכה יותר, פחות נזק בדנ&quot;א ותגובות הלחץ הכללי פחות physioxia 34. לכן, eIF4F H עשויה גורם מפתח בביטוי של גנים בוחרים בתנאים פיסיולוגיים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לתאי תרבות בתנאי חמצן פיסיולוגיים קבועים או במגוון משתנה דינמי כי סביר יותר נציג microenvironments רקמות. אחד היתרונות של שיטה זו הוא כי התאים lysed בתוך תחנת עבודה היפוקסיה. לא לעתים קרובות ברור כיצד מעבר מתרבות תא היפוקסי תמוגה התא מתבצע פרוטוקולים אחרים. תאים הם לעתים קרובות להסיר תחילה מן חממת היפוקסיה קטנה להיותקדמי תמוגה, אבל לחשיפה זו חמצן יכולה להשפיע הביוכימיים כתגובה הסלולר לחמצן היא מהירה (אחד או שתיים דקות) 35. חלבוני כובע מחייב מסוימים דורשים אינטראקציות עם בסיס שני או יכולים hydrolyze GTP מ 7, ולכן חלק interactors הכובע עלול לרדת לטמיון בתהליך הטיהור. Agarose-צמוד אנלוגים כובע עמיד enzymatically ניתן להחליף בפרוטוקול זה. היכרות עם הפעילות ורכב eIF4F H וריאציות אחרות של eIF4F באמצעות השיטה המתוארת כאן שתשפוך אור על מנגנוני ביטוי הגנים המורכבים שתאיים לנצל במהלך מצבים פיסיולוגיים או תגובות דחק.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="901">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:380px;">&#947;-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads</td>
			<td style="width:151px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:165px;">AC-1555</td>
			<td style="width:205px;">Agarose-linked m7GTP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>877222</td>
			<td>10-cm culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">150 mm culture dish</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>130183</td>
			<td>15-cm culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AEBSF Hydrochloride</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>A0356829</td>
			<td>AEBSF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose Beads</td>
			<td>Jena Bioscience&#160;</td>
			<td>AC-0015</td>
			<td>Agarose bead control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP112-25</td>
			<td>Component of SDS-PAGE loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>1210-00S</td>
			<td>Used to centrifuge small volumes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1495970C</td>
			<td>Used in culturing primary cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Defined trypsin inhibitor</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>R007100</td>
			<td>DTI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreital</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP172-25</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epithelial cell medium (complete kit)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>4101</td>
			<td>Includes serum and growth factor supplements)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>Component of SDS-PAGE loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mM Guanosine 5&#39;-triphosphate, 1 mL</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>272076-0251M</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCT116 colorectal carcinoma</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td>Human cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human renal proximal tubular epithelial cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-400-010</td>
			<td>HRPTEC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone DMEM/High Glucose</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td>Standard media for human cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Antibiotic component of DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">H35 HypOxystation</td>
			<td>Hypoxygen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Hypoxia workstation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Igepal CA-630</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2198596</td>
			<td>Detergent component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Monopotassium phosphate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-500</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Potassium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium fluoride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5299-100</td>
			<td>NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Disodium phosphate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5369-500</td>
			<td>Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Grade Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-500</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail (100 x)</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>58715</td>
			<td>Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Sodium Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56508</td>
			<td>Na3VO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>Component of buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>2500-067</td>
			<td>Trypsin used to detach adherent cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cap-binding proteins in human cells exposed to physiological oxygen conditions

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5' mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5' mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.

ניתוח יכולת Cap-מחייב תגובה חמצן של eIF4E ו eIF4E2 בבית מ 7 טור GTP זיקה איורים 1 ו -2 מייצגים כתמים המערבי של טיהור זיקה מ 7 GTP טיפוסי של שני חלבונים כובע מחייב מרכזי בתגובה לתנודות חמצן בשני שורות תאים אנושיים: תאי אפיתל צינורי הפרוקסימלי כליות אדם מן המעלה הראשונה (HRPTEC) ב קרצינומה F igure 1 ו הגס ( HCT116) באיור 2. תאים הם שמרו על זמינות חמצן המצוינת למשך 24 שעות על מנת להבטיח כי החמצן המומס בתקשורת נוזל equilibrated עם האוויר בתוך תחנת העבודה היפוקסיה. השביל קלט (IN) מייצג 10% של lysate התא כולו לפני מ 7 GTP צמודי חרוזים agarose מתווספים ללכוד חלבונים קושרי כובע. שביל קלט זו משמש כבסיס למדידת העשרהשל חלבון היעד הנפתח GTP מ 7. השביל GTP הוא eluate מן החרוזים מ 7 GTP שהיו elute עם 1 מ&quot;מ GTP. שלב זה מאפשר זיהוי של חלבונים כי גם להכיר GTP הלא מפוגל. החלבונים קושרי כובע eIF4E ו eIF4E2 להכיר מ 7 GTP במיוחד, אבל homolog שלהם eIF4E3 (לא מוצג כאן) גם נקשר GTP הלא מפוגל. היכולת של eIF4E ו eIF4E2 לחייב את מבנה כובע 5 &#39;mRNA (GTP מ 7) ניתן למדוד על ידי השוואת עוצמת הלהקות שלהם ביחס טור GTP מ 7 לעוצמת בנתיב הקלט (ברכה זמינה כלל). כימות זה יכול להתבצע על ידי מדידת עוצמת פיקסל של להקות החלבון במשך שלוש ביולוגי משכפל עם תוכנת ניתוח תמונה כגון ImageJ. תוצאות באות לידי ביטוי כאמצעי יחסי של יחידות צפיפות (RDU) ± שגיאת התקן של הממוצע. ערכים גלם לפני נורמליזציהמשני דגימות ניסוי ובקרה הושוו על ידי מבחן t דו-זנבי המזווג. P &lt;0.05 נחשב משמעותי מבחינה סטטיסטית. ניסוי נציג זה מראה כי יש שתי שורות תאי טווחים שונים של חמצן לשימוש eIF4E ו eIF4E2 שלהם. איור 1 מראה כי ב HRPTEC רק eIF4E נקשר חזק מ 7 GTP ב -8% O 2 (איור 1 א), כי הן eIF4E ו eIF4E2 קשורים משמעותית עם GTP מ 7 מ 3-5% O 2 (איור 1 ב - C), ושרק eIF4E2 נקשר מאוד GTP מ 7 ב 1% O 2 (איור 1D). באיור 2, בתאי HCT116, השימוש תלוי החמצן של חלבוני כובע מחייב אלה שונה: רק eIF4E נקשר באופן משמעותי מ 7 GTP ב 12% O 2 (איור 2 א), שני חלבוני קושרי הכובע להיקשר באופן משמעותי מ 7 GTP בטווח 5-8% O 2(איור 2 ב - C), ורק eIF4E2 נקשר באופן משמעותי GTP מ 7 ב 3% O 2 (איור 2 ד). עדר elution מעמודת GTP מ 7 עם GTP מראה כי eIF4E ו eIF4E2 הוא ספציפיים GTP מ 7 ואינו מכירי GTP הלא מפוגלת. הגרפים, מייצגים כימות של שלושה משכפל ביולוגי באמצעות ImageJ. תוצאות המחקר מראות כי שני חלבוני כובע מחייב גדולים, eIF4E ו eIF4E2, נבדלים ביכולת שלהן כדי לאגד את מבנה כובע mRNA מ 7 GTP בצורת חמצן תלוי. בהתבסס על הספרות קודמת כי שני חלבונים אלה ליזום את התרגום של כיתות ייחודיות של mRNAs המפנה בפעילות מחייב כובע יכול לגרום proteomes השונה שנוצר להסתגל לשינויים זמינים חמצן. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לאפיין גורמי ייזום תרגום רומן כי אינטראקציה עם 5 הכובע mRNA &#39;(או עם חלבונים קושרי כובע) באמצעות גישה כתם המערבי ממוקד או בגישה רחבה כגון ניתוח ספקטרומטריית מסה של eluate GTP מ 7. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55112/55112fig1.jpg" /> איור 1: eIF4E ו eIF4E2 פעילויות חופפות במהלך physioxia ב HRPTEC 3-5% O 2. מבחנים צלמו מ 7 GTP חרוז בתא אפיתל צינורי הפרוקסימלי אדם כליות (HRPTEC) lysates חשוף (א) 8%, (ב) 5%, (ג) 3% או (ד) 1% O 2 במשך 24 שעות. GTP, לשטוף GTP למדוד וספציפיות מ 7 GTP; מ 7 GTP, חלבונים מאוגדים חרוזים מ 7 GTP לאחר לשטוף GTP. כתמים מערביים נציג מוצגים ונתונים מלפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים כומתו על ידי ImageJ והביעו כיחידות צפיפות יחסיות (RDU) ביחס 10% קלט (IN) של lysate התא כולו. * P &lt;0.05 (מזווג שני זנב מבחן t) נחשב שינוי משמעותי כאשר משווים את העשרת eIF4E או eIF4E2 בשבריר הנכנס כובע (GTP מ 7) עם הצבא ההודי הלאומי. נתונים, ממוצע ± סטיית התקן של הממוצע (SEM) של שלושה ניסויים בלתי תלויים. מחקר זה פורסם במקור בכתב העת Journal of Biological Chemistry. Timpano, ס ו Uniacke, תאים אנושיים J. מתורבת תחת חמצן פיזיולוגיים לנצל שני חלבונים קושרי כובע לגייס mRNAs ברורים לתרגום. 2016; 291 (20): 10,772-82 24. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55112/55112fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55112/55112fig2.jpg" /> EIF4E איור 2. ופעילויות eIF4E2 חפיפה במהלך physioxia ב HCT116 מן 5-8% O 2. מבחני צלמו מ 7 GTP החרוזים lysates קרצינומה המעי הגס האנושי HCT116 חשופים (א) 12%, (ב) 8%, (ג) 5% או (ד) 3% O 2 במשך 24 שעות. GTP, לשטוף GTP למדוד וספציפיות מ 7 GTP; מ 7 GTP, חלבונים מאוגדים חרוזים מ 7 GTP לאחר לשטוף GTP. כתמים מערביים נציג מוצגים ונתונים מלפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים כומתו על ידי ImageJ והביעו כיחידות צפיפות יחסיות (RDU) ביחס 10 קלטי% (IN) של lysate תא כולו. * P &lt;0.05 (מזווג שני זנב מבחן t) נחשב שינוי משמעותי כאשר משווים את העשרת eIF4E או eIF4E2 בשבריר הנכנס כובע (GTP מ 7) עם הצבא ההודי הלאומי. נתונים, ממוצע ± סטיית התקן של הממוצע (SEM) של שלושה ניסויים בלתי תלויים. מחקר זה פורסם במקור בכתב העת Journal of Biological Chemistry. TIMPano, ס ו Uniacke, תאים אנושיים J. מתורבת תחת חמצן פיזיולוגיים לנצל שני חלבונים קושרי כובע לגייס mRNAs ברורים לתרגום. 2016; 291 (20): 10,772-82 24. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55112/55112fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions at JoVE.com

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

ניתוח של חלבונים קושרי שווי בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיזיולוגיים

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

analysis-cap-binding-proteins-human-cells-exposed-to-physiological

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

7.7K Views.  University of Guelph. Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

Video: Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

ניתוח Transfection siRNA ו Emsa על Cytotrophoblasts Villous אדם המבודד טרי

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

מבחני מזווג Conjugative עבור ניתוח רצף ספציפי של חלבוני העברה מעורבים קוניוגציה

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which specifically binds the pre-mRNA target and an effector domain. Previously, we have taken advantage of the unique RNA binding mode of the PUF domain in human Pumilio 1 to generate a programmable RNA binding scaffold, which was used to engineer various artificial RBPs to manipulate RNA metabolism. Here, a detailed protocol is described to construct Engineered Splicing Factors (ESFs) that are specifically designed to modulate the alternative splicing of target genes. The protocol includes how to design and construct a customized PUF scaffold for a specific RNA target, how to construct an ESF expression plasmid by fusing a designer PUF domain and an effector domain, and how to use ESFs to manipulate the splicing of target genes. In the representative results of this method, we have also described the common assays of ESF activities using splicing reporters, the application of ESF in cultured human cells, and the subsequent effect of splicing changes. By following the detailed protocols in this report, it is possible to design and generate ESFs for the regulation of different types of Alternative Splicing (AS), providing a new strategy to study splicing regulation and the function of different splicing isoforms. Moreover, by fusing different functional domains with a designed PUF domain, researchers can engineer artificial factors that target specific RNAs to manipulate various steps of RNA processing.

This report describes a bioengineering method to design and construct novel Artificial Splicing Factors (ASFs) that specifically modulate the splicing of target genes in mammalian cells. This method can be further expanded to engineer various artificial factors to manipulate other aspects of RNA metabolism.

הנדסה גורמים מלאכותיים כדי לתמרן באופן ספציפי שחבור אלטרנטיבי בתאים אנושיים

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

Immunostaining עבור שינויים DNA: ניתוח חישובית של תמונות קונפוקלי

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein interactions in yeast. It allows analysis of a target region of interest without the need for prior knowledge about likely proteins bound to the target region. This, in theory, allows HyCCAPP to be used to analyze any genomic region of interest, and it provides sufficient flexibility to work in different cell systems. This method is not meant to study binding sites of known transcription factors, a task better suited for Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-like methods. The strength of HyCCAPP lies in its ability to explore DNA regions for which there is limited or no knowledge about the proteins bound to it. It can also be a convenient method to avoid biases (present in ChIP-like methods) introduced by protein-based chromatin enrichment using antibodies. Potentially, HyCCAPP can be a powerful tool to uncover truly novel DNA-protein interactions. To date, the technology has been predominantly applied to yeast cells or to high copy repeat sequences in mammalian cells. In order to become the powerful tool we envision, HyCCAPP approaches need to be optimized to efficiently capture single-copy loci in mammalian cells. Here, we present our adaptation of the initial yeast HyCCAPP capture protocol to human cell lines, and show that single-copy chromatin regions can be efficiently isolated with this modified protocol.

This is a method to identify novel DNA-interacting proteins at specific target loci, relying on sequence-specific capture of crosslinked chromatin for subsequent proteomic analyses. No prior knowledge about potential binding proteins, nor cell modifications are required. Initially developed for yeast, the technology has now been adapted for mammalian cells.

עיבוד של הכלאה צלמו של חלבונים הקשורים כרומטין פרוטאומיקס בתרבית של תאים

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms remain elusive mainly due to the lack of a good in vivo model for studying BEST1 and its mutations under physiological conditions. BEST1 encodes an ion channel, namely BESTROPHIN1 (BEST1), which functions in retinal pigment epithelium (RPE); however, the extremely limited accessibility to native human RPE cells represents a major challenge for scientific research. This protocol describes how to generate human RPEs bearing BEST1 disease-causing mutations by induced differentiation from human pluripotent stem cells (hPSCs). As hPSCs are self-renewable, this approach allows researchers to have a steady source of hPSC-RPEs for various experimental analyses, such as immunoblotting, immunofluorescence, and patch clamp, and thus provides a very powerful disease-in-a-dish model for BEST1-associated retinal conditions. Notably, this strategy can be applied to study RPE (patho)physiology and other genes of interest natively expressed in RPE.

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Here we present a protocol to differentiate retinal pigment epithelium (RPE) cells from human pluripotent stem cells bearing patient-derived mutations. The mutant cell lines may be used for functional analyses including immunoblotting, immunofluorescence, and patch clamp. This disease-in-a-dish approach circumvents the difficulty of obtaining native human RPE cells.

בידול, תחזוקה, וניתוח תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית אנושי: מודל המחלה-ב--תבשיל BEST1 מוטציות

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to normal and pathological conditions. The goal of this protocol is to generate high-quality, large-scale transcriptome data of each endocrine cell type with the use of a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology. Such data can be utilized to build the gene expression profile of each endocrine cell type in normal or specific conditions. The process requires careful handling, accurate measurement, and rigorous quality control. In this protocol, we describe detailed steps for human pancreatic islets dissociation, sequencing, and data analysis. The representative results of about 20,000 human single islet cells demonstrate the successful application of the protocol.

Here, we present a protocol to generate high-quality, large-scale transcriptome data of single cells from isolated human pancreatic islets using a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology.

תא בודד RNA רצף וניתוח של איי הלבלב האנושי

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding sites for transcriptional regulators to modulate gene expression. Alterations of CREs have been implicated in various diseases including cancer. While promoters and enhancers have been the primary CREs for studying gene regulation, very little is known about the role of silencer, which is another type of CRE that mediates gene repression. Originally identified as an adaptive immunity system in prokaryotes, CRISPR/Cas9 has been exploited to be a powerful tool for eukaryotic genome editing. Here, we present the use of this technique to delete an intronic silencer in the human RUNX1 gene and investigate the impacts on gene expression in OCI-AML3 leukemic cells. Our approach relies on electroporation-mediated delivery of two preassembled Cas9/guide RNA (gRNA) ribonucleoprotein (RNP) complexes to create two double-strand breaks (DSBs) that flank the silencer. Deletions can be readily screened by fragment analysis. Expression analyses of different mRNAs transcribed from alternative promoters help evaluate promoter-dependent effects. This strategy can be used to study other CREs and is particularly suitable for hematopoietic cells, which are often difficult to transfect with plasmid-based methods. The use of a plasmid- and virus-free strategy allows simple and fast assessments of gene regulatory functions.

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Direct delivery of preassembled Cas9/guide RNA ribonucleoprotein complexes is a fast and efficient means for genome editing in hematopoietic cells. Here, we utilize this approach to delete a RUNX1 intronic silencer and examine the transcriptional responses in OCI-AML3 leukemic cells.

חקירת התפקיד הטרנססאני של משתיק הRUNX1 נית על ידי CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein בתאי לוקמיה מיאלואיד חריפה

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...