Name: metagenomic analysis of silage
Uploaded: 2017-01-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metagenomic Analysis of Silage at JoVE.com

Authors would like to thank Andrew Bird for the silage samples and Audrey Farbos of the Exeter Sequencing Service for her assistance in preparing DNA sequencing libraries. Exeter Sequencing Service and Computational core facilities at the University of Exeter. Medical Research Council Clinical Infrastructure award (MR/M008924/1). Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (WT097835MF), Wellcome Trust Multi User Equipment Award (WT101650MA) and BBSRC LOLA award (BB/K003240/1).

The authors have nothing to disclose.

في حين أن في تحليل SILICO يمكن أن تعطي فكرة ممتازة إلى المجتمعات الميكروبية التي تكون موجودة ضمن العينات البيئية، فمن الأهمية بمكان أن التصنيفات التصنيفية أظهرت أن يقوم بالتعاون مع الضوابط ذات الصلة والتي تم التوصل إلى عمق مناسب من تسلسل للقبض على كامل السكان الحالي 51. مع أي تحليل الحسابية، وهناك العديد من الطرق لتحقيق هدف مماثل. الأساليب التي استخدمناها في هذه الدراسة هي أمثلة على أساليب مناسبة وواضحة، والتي تم عرضها معا لتحقيق مجموعة من التحليلات على microbiome السيلاج. وهناك مجموعة متنوعة وعدد متزايد من الأدوات والتقنيات المعلوماتية الحيوية المتاحة لتحليل البيانات metagenomic، على سبيل المثال Phylosift 8 و MetaPhlAn2 52، وهذه يجب أن يتم تقييم مسبق للتحقيق لأهميتها بالنسبة للعينة ومسا تحليلuired 53. تقتصر أساليب التحليل Metagenomic من قواعد البيانات الخاصة متاحة للتصنيف، وعمق التسلسل ونوعية التسلسل. تم إجراء معالجة بيوينفورمتيك تظاهر هنا على، آلة تعمل بالطاقة العالية المحلية؛ ومع ذلك النظم القائمة على السحابة وتتوفر أيضا. هذه الخدمات المستندة إلى سحابة تسمح لاستئجار الطاقة الحسابية اللازمة دون الحاجة للاستثمار عالية التكلفة لمحطة العمل المحلية قوية مناسبة. ومن شأن التطبيق المحتمل لهذه الطريقة هو تقييم السيلاج قبل استخدامه في الزراعة لضمان عدم وجود البكتيريا الضارة المحتملة موجودة وبالتالي منعهم من دخول السلسلة الغذائية.

Metagenomics هو تحليل مباشر من الحمض النووي تنقيته من المجتمعات البيولوجية الموجودة في العينات البيئية 1، وكان يستخدم في الأصل للكشف عن البكتيريا unculturable الموجودة في الرواسب 2. وقد استخدم على نطاق واسع Metagenomics لعدد من التطبيقات، مثل تحديد microbiome الإنسان 3، تصنيف السكان الميكروبية داخل المحيط 4 وحتى لتحليل المجتمعات البكتيرية التي تضع على آلات القهوة 5. أدى إدخال تقنيات التسلسل الجيل القادم في أكبر الإنتاجية تسلسل والإخراج. ونتيجة لذلك، أصبح تسلسل الحمض النووي أكثر اقتصادا 6 وعمق تسلسل التي يمكن القيام بها قد زاد بشكل كبير، مما metagenomics لتصبح قوية وأداة تحليلية. دفعت التعزيزات &quot;الواجهة الأمامية&quot; في الجانب العملي، الجزيئي للتسلسل metagenomic نمو فيأدوات سيليكون والمعلوماتية الحيوية المتاحة لتصنيف التصنيفية 7-9، والشرح وظيفية 10،11 و 12،13 التمثيل المرئي للبيانات تسلسل الحمض النووي. تزايد عدد المتاحة، التسلسل أولية النواة وحقيقية النواة 14 الجينوم يسمح مزيد من الدقة في تصنيف المجتمعات الميكروبية، التي تتم دائما ضد &quot;في نهاية العام&quot; قاعدة بيانات مرجعية من الجينوم متسلسلة 15. ويمكن اعتماد نهجين رئيسيين لتحليل metagenomic. طريقة أكثر تقليدية هو تحليل الجينات 16S الريباسي الترميز المنطقة من جينوم بكتيري. يتم حفظها في 16S الريباسي للغاية بين الأنواع بدائيات النوى ولكن المعارض تسع مناطق فرط متغير (V1 - V9) التي يمكن استغلالها لتحديد الأنواع 16. إدخال التسلسل الطويل (≤ 300 نقطة أساس نهاية الاقتران) يسمح لتحليل تسلسل الحمض النووي التي تغطي منطقتين شديدة متغير، ولا سيماوV3 - المنطقة V4 17. التقدم في تقنيات التسلسل الأخرى، مثل أكسفورد ثقب النانو 18 و 19 PacBIO، لا يسمح كامل الجينات 16S الريباسي لتكون متسلسلة متاخم. بينما توفر 16S الحمض النووي المؤتلف المكتبات القائمة على نهج تستهدف تحديد الأنواع وتمكن من الكشف عن عدد المنخفضة نسخة الحمض النووي الذي يحدث طبيعيا في عينات النقاء والمكتبات بندقية التسلسل تسمح للكشف عن الأنواع التي قد تحتوي على مناطق الحمض النووي التي هي إما غير amplifiable من قبل 16S الريباسي تسلسل علامة التمهيدي المستخدمة، أو بسبب الخلافات بين تسلسل قالب وتسلسل تضخيم التمهيدي كبيرة جدا 20،21. وعلاوة على ذلك، على الرغم من بلمرة الحمض النووي لديها الدقة العالية تكرار الحمض النووي، وأخطاء قاعدة يمكن مع ذلك أن يحدث خلال PCR والتضخيم، وهذه الأخطاء أدرجت يمكن أن يؤدي إلى تصنيف غير صحيحة من مصدرها الأنواع 22. التحيز في التضخيم PCR من بعدها القالبيمكن أيضا أن تحدث uences. تسلسل الحمض النووي مع محتوى GC عالية يمكن أن يكون تحت الممثلة في تجمع amplicon النهائي 23 وبالمثل التعديلات قاعدة غير طبيعية، مثل غليكول الثايمين، يمكن وقف بلمرة الحمض النووي تسبب الفشل في التضخيم من الحمض النووي تسلسل 24. في المقابل، مكتبة الحمض النووي بندقية التسلسل هي مكتبة الحمض النووي التي تم إعدادها باستخدام كل من الحمض النووي المنقى الذي تم استخراجه من عينة ومجزأة في وقت لاحق إلى أطوال سلسلة أقصر الحمض النووي قبل التحضير لالتسلسل. وأكثر دقة مقارنة تصنيف التصنيفي للتسلسل الحمض النووي التي تم إنشاؤها بواسطة تسلسل طلقات نارية على 16S الريباسي amplicon التسلسل 25، على الرغم من أن التكلفة المالية المطلوبة للوصول إلى عمق التسلسل موثوق هو أعظم من ذلك من amplicon تسلسل 26. الفائدة الرئيسية من metagenomics بندقية التسلسل هو أن المناطق متسلسلة من مختلف العوامل الوراثية في العينة متاحة للتنقيب الجينات مرة واحدة أنها كانتتم تصنيف تصنيفيا 27. ويتم تحليل Metagenomic تسلسل البيانات من قبل مجموعة متزايدة من أدوات بيوينفورمتيك. هذه الأدوات هي قادرة على أداء مجموعة واسعة من التطبيقات، على سبيل المثال، تحليل ومراقبة جودة البيانات تسلسل الخام 28، وتداخل في نهاية يقترن يقرأ 29، دي نوفو تجميع تسلسل يقرأ لcontigs والسقالات 30،31، تصنيف التصنيف والتصور تسلسل يقرأ وتجميع سلاسل 7،12،32،33 والشرح وظيفية من متواليات تجميعها 34،35. السيلاج، التى ينتجها المزارعون في جميع أنحاء العالم من الحبوب المخمرة مثل الذرة (ذرة شامية)، ويستخدم في الغالب كعلف للماشية. يتم التعامل مع السيلاج مع س البكتيريا الملبنة. لمساعدة التخمير 36 ولكن حتى الآن، هناك معرفة محدودة السكان الميكروبية أخرى وجدت في السيلاج. على انزيمعملية ن يمكن أن يؤدي إلى الكائنات الدقيقة غير مرغوب فيها ويمكن أن تكون ضارة تصبح سائدة داخل السيلاج 37. بالإضافة إلى الخمائر والفطريات والبكتيريا قابلة للتكيف بشكل خاص على البيئة اللاهوائية في تخمير الأعلاف وأكثر في كثير من الأحيان ترتبط مع الأمراض في الماشية بدلا من تدهور السيلاج 38. بكتيريا حمض زبدي يمكن أن تضاف عن غير قصد من التربة لا تزال عند ملء الصوامع السيلاج وتكون قادرة على تحويل حمض اللبنيك، وهو منتج من الهضم اللاهوائي، لحامض زبدي، وبالتالي زيادة درجة الحموضة في السيلاج 39. هذه الزيادة في درجة الحموضة يمكن أن يؤدي إلى زيادة في البكتيريا التلف التي عادة ما تكون غير قادرة على مواصلة النمو في ظل السيلاج الأمثل ظروف التخمر 38. كلوستريديوم النيابة. ، الليسترية. وعصية النيابة. تثير القلق بشكل خاص، لا سيما في السيلاج كعلف للماشية الألبان، والجراثيم البكتيرية التي نجت من الاضالجهاز ointestinal 40 يمكن أن تدخل في السلسلة الغذائية، يؤدي إلى تلف المواد الغذائية و، في حالات نادرة، إلى الحيوان وفيات بشرية 37،39،41-44. وعلاوة على ذلك، في حين أنه من الصعب تقدير التأثير الاقتصادي المحدد من العلاج البيطري وفقدان الماشية الناجمة عن تلف السيلاج، فمن المحتمل أن تكون ضارة إلى مزرعة إذا كان تفشي تحدث. والافتراض بأن باستخدام نهج metagenomic يمكننا تصنيف السكان الميكروبية الموجودة في عينات الأعلاف وعلاوة على ذلك تحديد المجتمعات الميكروبية المرتبطة تلف السيلاج من شأنه، في المقابل، من المحتمل أن يكون لها تأثير ضار على الماشية، مما يتيح إجراءات تصحيحية ليكون اتخذت قبل السيلاج لاستخدامه كمصدر للغذاء.

<table><tbody><tr><td>FastDNA SPIN Kit for Soil</td><td>MP Bio</td><td>116560200</td><td>DNA Extraction</td></tr><tr><td>DNA FastPrep</td><td>MP Bio</td><td>116004500</td><td>DNA Extraction</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>DNA Purification</td></tr><tr><td>Elution Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19806</td><td>DNA Purification</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Library Preparation</td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>Library Preparation</td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>HS D100 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>HS D100 ScreenTape Reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>TapeStation Tips</td><td>Agilent</td><td>5067-5153</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>TapeStation Tubes</td><td>Agilent</td><td>401428 and 401425</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td>DNA Sequencing - provided by a sequencing service</td></tr><tr><td>High Power Analysis Workstation</td><td>Various</td><td></td><td>Local or cloud based, user preferred system</td></tr></tbody></table>

metagenomic analysis of silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

<html> قبل تجهيزها بيوينفورمتيك، تسلسل الخام يقرأ وقلص وأزيلت محولات باستخدام برنامج Trimmomatic 28. بعد خطوة وتقليم وتصفية، وعدد من يقرأ تم تخفيضها إلى 50٪ من تسلسل يقرأ (الجدول 1). وكان متوسط النقاط الأساسية PHRED&gt; 30 بعد مراقبة الجودة (الشكل 2). أزواج من تسلسل الحمض النووي الذي كان تم دمج مناطق متداخلة باستخدام برنامج فلاش 29 لتوليد يعد احد يقرأ، غير متداخلة يقرأ تم الاحتفاظ بها في ملف منفصل. يقرأ 45.47٪ (105343) جنبا إلى جنب بنجاح. بعد تداخل من يقرأ باستخدام FLASH من يقرأ، شظايا بمد الناتجة خضعت تصنيف التصنيفية البكتيرية باستخدام برنامج كراكن 7 وكانت تصور في وقت لاحق مع برنامج الكرونا (الشكل 3). . في غضون الصفحات = &quot;1&quot;&gt; تم العثور على معظم الأنواع البكتيرية الموجودة في metagenome السيلاج خلال 4 من الكائنات الحية في بدائيات النواة: افيرميكوتس (34٪)، شعاويات (28٪)، متقلبات (27٪) وعصوانيات (7٪) . يمكن أن ينظر إلى توزيع الطبقات موجودة داخل هذه الشعب في الشكل (4). كانت الأنواع الأكثر وفرة في metagenome الملبنة النيابة. (24٪، افيرميكوتس)، الوتدية النيابة. (8٪، شعاويات)، بروبيونيباكتيريوم النيابة. (3٪، شعاويات) وPrevotella النيابة. (3٪، عصوانيات). وقد لوحظت أيضا الأنواع الهامة لصحة الحيوان والمتورطين في المرض؛ كلوستريديوم النيابة. (1٪) عصية النيابة. (0.6٪)، الليسترية. ويتوقع أن تكون موجودة في عينة السيلاج (0.2٪). تم تنفيذ الشرح وظيفية على تجميعها يقرأ. تم تجميع metagenome باستخدام المجمع البستوني 30 باستخدام قطع وتصفيتهاإقران نهاية وأونبايريد يقرأ توليد 92284 السقالات. من أجل تحديد السليلوزات، وتوقع البروتينات باستخدام MG-راست وشرحها باستخدام قاعدة بيانات الانزيمات الكربوهيدرات النشطة (CAZy). من البروتينات توقع 97562، والمشروح 6357 كما انزيم المفترض الكربوهيدرات الفعالة في واحدة من الانزيمات الطبقات الخمس التي تشكل قاعدة بيانات CAZy (الشكل 5). وتصور النتائج بمثابة مخطط فين باستخدام برنامج InteractiVenn 50 تبين توزيع الشروح البروتين بما في ذلك تلك التي تحتوي على أكثر من CAZy الطبقة انزيم الشرح. من هؤلاء، كان من المتوقع أن يكون 3861 النشاط هيدرولاز الأنتراكينون والتي سيتواصل تميزت في المختبر للتأكد من وظيفة. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig1.jpg" /> الشكل 1: بيوينفورمتيك Metagenomics خط أنابيب لتحليل الأعلاف. كانت نهجين رئيسيينتستخدم للتحقيق في microbiome من السيلاج، تصنيف التصنيف والشرح وظيفية. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54936/54936fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig2.jpg" /> الشكل 2: تسلسل الجودة لكل قاعدة قبل وبعد التشذيب وإزالة محول. تسلسل جودة مؤامرة لكل قاعدة من FASTQC يبين متوسط ​​درجة PHRED عبر طول تسلسل يقرأ السيطرة قبل وبعد الجودة. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54936/54936fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig3.jpg" /> الشكل (3): التصنيفي Classificaنشوئها من البكتيرية Microbiome من السيلاج الصلبة. تصنيف تسلسل قلصت وتداخل يقرأ من تم تنفيذ FLASH باستخدام كراكن 7 و تصور في وقت لاحق مع الكرونا. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54936/54936fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig4.jpg" /> الشكل 4: توزيع الفئة التصنيفية للمن الكائنات الحية 4 الأكثر وفرة في البكتيرية Microbiome من السيلاج الصلبة. نسبة كل فئة من البكتيريا داخل من الكائنات الحية الأربعة الأكثر وفرة. افيرميكوتس: المطثيات (الحمراء)، والعصيات (الأزرق الداكن)؛ متقلبات: دلتا / إبسيلون (وردي)، ألفا (شاحب اللون الأزرق) وغاما (برتقالي) وبيتا (الفيروز)؛ عصوانيات: Flavobacteriia (الأزرق الداكن) وBacteroidia(أخضر باهت)؛ شعاويات: Coriobacteriia (الأرجواني الداكن) وغيرها من شعاويات (الأخضر الداكن). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54936/54936fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig5.jpg" /> الرقم 5: CAZy الشرح للبروتيوم توقع في صلب علف Microbiome. فين رسم بياني يوضح توزيع الطبقات انزيم خمسة من الشروح CAZy في بروتيوم توقع من microbiome السيلاج الصلبة. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54936/54936fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> يقرأ # الخام </td><td rowspan="2"> # المصفاة يقرأ (الاقتران) </td&gt; <td> يقرأ # المصفاة </td><td rowspan="2"> # تومض يقرأ </td></tr><tr><td> (الاقتران) </td><td> (المفردة) </td></tr><tr><td> 2374949 X2 </td><td> 231679 X2 </td><td> 1892534 </td><td> 105343 </td></tr></tbody></table> الجدول 1: يقرأ جدول ملخص التسلسل.

Watch this Scientific Journal Video about Metagenomic Analysis of Silage at JoVE.com

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

تحليل Metagenomic من السيلاج

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

18.1K Views.  University of Exeter. Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Video: Metagenomic Analysis of Silage

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered &#34;bee-safe,&#34; there is mounting evidence that fungicide residues in pollen are associated with bee declines (for both honey and bumble bee species). While the mechanisms remain relatively unknown, researchers have speculated that bee-microbe symbioses are involved. Microbes play a pivotal role in the preservation and/or processing of pollen, which serves as nutrition for larval bees. By altering the microbial community, it is likely that fungicides disrupt these microbe-mediated services, and thereby compromise bee health. This manuscript describes the protocols used to investigate the indirect mechanism(s) by which fungicides may be causing colony decline. Cage experiments exposing bees to fungicide-treated flowers have already provided the first evidence that fungicides cause profound colony losses in a native bumble bee (Bombus impatiens). Using field-relevant doses of fungicides, a series of experiments have been developed to provide a finer description of microbial community dynamics of fungicide-exposed pollen. Shifts in the structural composition of fungal and bacterial assemblages within the pollen microbiome are investigated by next-generation sequencing and metagenomic analysis. Experiments developed herein have been designed to provide a mechanistic understanding of how fungicides affect the microbiome of pollen-provisions. Ultimately, these findings should shed light on the indirect pathway through which fungicides may be causing colony declines.

Microbial consortia within bumble bee hives enrich and preserve pollen for bee larvae. Using next generation sequencing, along with laboratory and field-based experiments, this manuscript describes protocols used to test the hypothesis that fungicide residues alter the pollen microbiome, and colony demographics, ultimately leading to colony loss.

التجريبية ومواد وتقنيات حسابية إلقاء الضوء على الآليات "مبيدات الفطريات وسط النحل الصحية"

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Environment

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

استكشاف ميكروبيومي الجذر: استخراج البيانات المجتمع البكتيرية من التربة، ورهيزوسفيري، واندوسفيري الجذر

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA sequences identified using computer software. Nanopore DNA sequencing is a flexible technique that allows for rapid microbial genome sequencing to identify bacterial and viral species, to characterize bacterial strains, and to detect genetic mutations that confer resistance to antibiotics. The advantages of nanopore sequencing (NS) for life sciences include its low complexity, reduced cost, and rapid real-time sequencing of purified genomic DNA, PCR amplicons, cDNA samples, or RNA. NS is an example of "strand sequencing" which involves sequencing DNA by guiding a single stranded DNA molecule through a nanopore that is inserted into a synthetic polymer membrane. The membrane has an electrical current applied across it, so as the individual bases pass through the nanopore the electrical current is disrupted to varying degrees by the four nucleotide bases. The identification of each nucleotide occurs by detecting the characteristic modulation of the electrical current by the different bases as they pass through the nanopore. The NS system consists of a handheld, USB powered portable device and a disposable flow cell that contains a nanopore array. The portable device plugs into a standard laptop computer that reads and records the DNA sequence using computer software.

Nanopore technology for sequencing biomolecules has wide applications in the life sciences, including identification of pathogens, food safety monitoring, genomic analysis, metagenomic environmental monitoring, and characterization of bacterial antibiotic resistance. In this article, the procedure for metagenomic soil DNA sequencing for species identification using the nanopore sequencing technology is demonstrated.

نانوبوري تسلسل الحمض النووي لتحليل التربة الجينومية

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to characterize. However, to understand the thermodynamic and kinetic controls on greenhouse gas (carbon dioxide [CO2] and methane [CH4]) production resulting from the decomposition of NOM, a molecular-level characterization coupled with microbial proteome analyses is necessary. Further, climate and environmental changes are expected to perturb natural ecosystems, potentially upsetting complex interactions that influence both the supply of organic matter substrates and the microorganisms performing the transformations. A detailed molecular characterization of the organic matter, microbial proteomics, and the pathways and transformations by which organic matter is decomposed will be necessary to predict the direction and magnitude of the effects of environmental changes. This article describes a methodological throughput for comprehensive metabolite characterization in a single sample by direct injection Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTICR-MS), gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), and proteomics analysis. This approach results in a fully-paired dataset which improves statistical confidence for inferring pathways of organic matter decomposition, the resulting CO2 and CH4 production rates, and their responses to environmental perturbation. Herein we present results of applying this method to NOM samples collected from peatlands; however, the protocol is applicable to any NOM sample (e.g., peat, forested soils, marine sediments, etc.).

This protocol describes a single throughput for complementary analytical and omics techniques culminating in a fully-paired characterization of natural organic matter and microbial proteomics in different ecosystems. This approach permits robust comparisons for identifying metabolic pathways and transformations important for describing greenhouse gas production and predicting responses to environmental change.

واحد الإنتاجية التكميلية التقنيات التحليلية عالية الدقة لوصف خليط معقد من المواد العضوية الطبيعية

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

Evaluating the Impact of Hydraulic Fracturing on Streams using Microbial Molecular Signatures

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil and gas. This process revolutionized the U.S. energy industry, as it gives access to resources that were previously unobtainable and now produces two-thirds of the total natural gas in the United States. Although fracking has had a positive impact on the U.S. economy, several studies have highlighted its detrimental environmental effects. Of particular concern is the effect of fracking on headwater streams, which are especially important due to their disproportionately large impact on the health of the entire watershed. The bacteria within those streams can be used as indicators of stream health, as the bacteria present and their abundance in a disturbed stream would be expected to differ from those in an otherwise comparable but undisturbed stream. Therefore, this protocol aims to use the bacterial community to determine if streams have been impacted by fracking. To this end, sediment, and water samples, from streams near fracking (potentially impacted) and upstream or in a different watershed of fracking activity (unimpacted) must be collected. Those samples are then subjected to nucleic acid extraction, library preparation, and sequencing to investigate microbial community composition. Correlational analysis and machine learning models can subsequently be employed to identify which features are explanative of variation in the community, as well as identification of predictive biomarkers for fracking&#39;s impact. These methods can reveal a variety of differences in the microbial communities among headwater streams, based on the proximity to fracking, and serve as a foundation for future investigations on the environmental impact of fracking activities.

Here, we present a protocol to investigate the impacts of hydraulic fracturing on nearby streams by analyzing their water and sediment microbial communities.

تقييم تأثير التكسير الهيدروليكي على الجداول باستخدام التوقيعات الجزيئية الميكروبية

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil ...

Derivatization and Separation of Barley Flour Metabolites into Four Fractions

Metabolomic Analysis of Barley by Gas Chromatography/Mass Spectrometry

Climate change increases drought risk to agriculture and impacts both food nutrient content and overall food security. Metabolomics is one way to observe and quantify the impacts of drought on grain and other agricultural products. The identified metabolites may allow for the identification of the biochemical response that allows the plant to tolerate stressful environments. The methodology presented herein allowed for the total metabolomic analysis of barley flour using gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). 
Barley flour metabolite extracts were fractionated into four fractions based on polarity. To allow for analysis by GC/MS, metabolites were derivatized to increase volatility and metabolite separation: fatty acids esters were derivatized into fatty acid methyl esters; sugars were oximated into their straight chain form; and metabolites with hydroxyl groups were converted to their corresponding silyl ethers. The derivatized samples were injected into the GC/MS and the generated mass spectra were used for metabolite identification by comparing the generated spectra to the National Institute of Standards and Technology (NIST) Tandem Mass Spectra library. The method described here can also be used to examine the total metabolome for other plants, furthering our understanding of the biochemical responses of stressed plants.

A method for metabolomic analysis of barley is presented. The method entails fractionation and derivatization of metabolites and analysis thereof by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). Metabolomic analysis can be used to determine the effect of intercropping and drought stress on the grain.

Climate change increases drought risk to agriculture and impacts both food nutrient content and overall food security. Metabolomics is one way to observe ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Biology

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

تنقية انجاس: تسلسل Metagenomes وMetatranscriptomes من مجمع عينات المرتبط الحيوانية

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

هجين طريقة استخراج الحمض النووي للتقييم النوعي والكمي للمجتمعات البكتيرية من عينات الدواجن الإنتاج

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;

تحليل Metagenomic من السيلاج

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video