פרויקט זה היה תמיכה חלקית על ידי אוניברסיטת ג'ונס הופקינס, משרד פרווסט דרך שער מתווה.

הערה: ה-DNA Metagenomic מטוהר מן האדמה (במחוז בולטימור, מרילנד) באמצעות בידוד גנומית של קרקע זמינים מסחרית קיט (ראה טבלה של חומרים). שימוש ספקטרופוטומטרים UV (ראה טבלה של חומרים), ה-DNA גנומי מטוהרים צריך להיות יחס (ננומטר) 260/280 &#62; 1.8 ו- 260/230 יחס בין 2.0-2.2 להבטיח כי המדגם הינו ללא מזהמים. כמות ה-DNA גנומי הדרושות NS נע בין 200 ng כדי 2 µg.
1. שיטת הכנה מהירה ספריה (פרוטוקול קצר)
הערה: הוא זה פרוטוקול קצר. ראה טבלה של חומרים עבור ערכת רצף מהיר.
<ol>
	<li>ב- mL 0.2 צינור דק עם קירות (ראה טבלה של חומרים) להוסיף 200 ng של משקל מולקולרי גבוה ה-DNA הגמר נפח של 7.5 µL של מים מזוקקים.</li>
	<li>להוסיף 2.5 µL של פיצול מיקס (FM) ערכת הכנה מהירה לספריה, לערבב בעדינות על-ידי היפוך. הדופק צנטריפוגה ספין למטה (1,000 x g עבור 5 s).</li>
	<li>הכנס את הדגימה thermocycler (ראה טבלה של חומרים) עבור סיבוב אחד ב 30 ° C עבור 1 דקות ולאחריה 75 ° C עבור מינימלית 1 להסיר לצנטריפוגה צינור ודופק על תוצאה לדגימה.</li>
	<li>הוסף µL 1 של מתאם מהירה ו- 0.2 µL של בלאנט/ת א ליגאז מיקס מאסטר ולאחר מכן לאחסן בספריה מותאמת, קשור בקרח. הערה: אם באמצעות פרוטוקול קצר והמשך לשלב 8</li>
</ol>
2. מצדו רצף פרוטוקול (פרוטוקול ארוך): Metagenomic DNA פיצול
הערה: ראה טבלה של חומרים עבור ערכת רצף מצדו.
<ol>
	<li>למהול 1 µg של דנ א גנומי מטוהרים נפח סופי של 46 µL במים יונים.</li>
	<li>העברת הדגימה כדי פיצול ה-DNA צינור (ראה טבלה של חומרים), צנטריפוגה עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר ב 8000 g x באמצעות microcentrifuge (ראה טבלה של חומרים) כדי לייצר שברי גנומית ~ 8 kb. ודא כי כל הנוזל עבר לתוך הצינור אוסף.</li>
	<li>היפוך הצינור פיצול, לחזור צנטריפוגה ולאחר צנטריפוגה עבור 1 דקות לאסוף את הדנ א הגנומי מפוצלים אל החדר התחתון.</li>
	<li>להעביר את ה-DNA גנומי מפוצלים צינור 1.5 מ ל איגוד נמוך-DNA סטרילי, ולנתח חלק על ג'ל agarose אחוזים נמוכים (0.6%) כדי לאשר פיצול כדי &#62; 30 kb.</li>
</ol>
3. מפוצלים הדנ א סוף-אופן ההכנה
<ol>
	<li>באמצעות 800 ng של דנ א גנומי מפוצלים ב 45 µL של מים יונים, להוסיף תגובה סוף-פרפ ' µL 7 ' מאגר (ראה טבלה של חומרים), 3 µL אנזימים מיקס (ראה טבלה של חומרים), ו- 5 µL של נוקלאז ללא מים.</li>
	<li>מיקס על ידי צנטריפוגה היפוך ודופק (1,000 x g עבור 5 s).</li>
	<li>להעביר מדגם צינור דק עם קירות 0.2 מ"ל, דגירה דוגמת עבור 5 דקות ב- 20 ° C, ואחריו דגירה-65 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה הדופק להביא תוכן לתחתית הצינור.</li>
	<li>העברה מדגם צינור 1.5 מ ל נמוכה-DNA איגוד microcentrifuge.</li>
	<li>להכין beads מגנטי (ראה טבלה של חומרים). להוסיף 60 µL של חרוזים resuspended התגובה הכנה סוף שלב 3.5, לערבב על-ידי pipetting.</li>
	<li>דגירה על מערבל מסובב ב 100 סל"ד (ראה טבלה של חומרים) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דופק centrifuge המדגם הצניפה החרוזים, ולאחר מכן למקם את הדגימה ליד מגנט.</li>
	<li>פיפטה ברגע החרוזים הם דבקו המגנט, תגובת שיקוע, להשליך.</li>
	<li>הסר הצינור החרוזים מגנט ושטוף עם 200 µL של אתנול 70% שזה עתה הוכנו על ידי בעדינות pipetting שיהיה המדגם.</li>
	<li>צנטריפוגה הדופק הצניפה החרוזים ולחזור המגנט.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע וזורקים. חזור על השלב כביסה שוב באמצעות µL 200 של 70% אתנול.</li>
	<li>דופק centrifuge ברכבת התחתית, לחזור המגנט ולהסיר כל בכביסה אתנול 70%.</li>
	<li>עם המכסה צינור microcentrifuge פתוחה, לאפשר את החרוזים מהאוויר להתייבש במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להסיר את הצינורית של מגנט, להשעות את צניפה ב µL 31 סטרילי, נטולת נוקלאז מים. תקופת דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להחזיר את הצינור המגנט עד כל החרוזים יש מגורען, eluate ברור.</li>
	<li>להעביר את eluate צינור microcentrifuge 1.5 mL. שימוש µL 1 מדגם, לכמת את הדנ א. נכין קצה באמצעות ספקטרופוטומטרים UV ב-260 nm (ראה טבלה של חומרים). הערה: אחוז ההחלמה צריך להיות ~ 70% (700 ng) של ריכוז ההתחלתי של µg 1 של הדנ א.</li>
</ol>
4. מתאם, בנוסף הקשר שברי DNA גנומי מוכנה סוף
<ol>
	<li>לערבב את כל ליגאז בלאנט/ת צינורות מיקס מאסטר על ידי היפוך ולאחר מכן דופק צנטריפוגה כדי להביא תוכן התחתון.</li>
	<li>באמצעות 30 µL של DNA מוכנה סוף, להוסיף 20 µL של מתאם שילוב, µL 50 של בלאנט/ת א מצדו מיקס מאסטר.</li>
	<li>לערבב על-ידי היפוך, הדופק צנטריפוגה, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
</ol>
5. מגנטי Bלראש הכנה
<ol>
	<li>מערבולת החרוזים, ואז העברת µL 50 של חרוזים על תנאי כדי microfuge 1.5 mL צינור.</li>
	<li>מניחים את הצינורית על המגנט על גלולה החרוזים עד eluate.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע וזורקים.</li>
	<li>להוסיף 100 µL חרוז איגוד מאגר (ראה טבלה של חומרים עבור ערכת חרוז) החרוזים, מערבולת כדי resuspend את החרוזים, גלולה החרוזים על המגנט, להסיר את תגובת שיקוע ולמחוק. חזור על השטיפה עם 100 µL מחייב המאגר.</li>
	<li>להוסיף 100 µL חרוז איגוד המאגר החרוזים שטף. מערבולת כדי resuspend את החרוזים.</li>
</ol>
6. ספריית טיהור
<ol>
	<li>שימוש micropipette P200, להוסיף µL 40 של חרוזים מהשלב הקודם גנומית הותאם/קשור לדנ א. מערבבים את הדגימה בקפידה על-ידי pipetting.</li>
	<li>דגירה המדגם על מערבל מסובב ב 100 סל"ד למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>שים המדגם על המגנט ולאפשר את החרוזים להתיישב. פיפטה הנחה תגובת שיקוע וזורקים.</li>
	<li>Resuspend את החרוזים ב 140 µL חרוז איגוד מאגר על-ידי pipetting. מקם את הדגימות המגנט, למחוק את תגובת שיקוע ולאחר לשטוף שוב עם עוד 140 µL חרוז איגוד מאגר.</li>
	<li>דופק centrifuge ברכבת התחתית, במקום את הצינורית על המגנט עבור 2 דק. להסיר את המאגר איגוד חרוז נותרת בגדר.</li>
</ol>
7. • תנאי של ספריה של חרוזי מגנט
<ol>
	<li>Resuspend את החרוזים מגנטי ב 15 µL • תנאי מאגר על-ידי pipetting. דגירה המדגם 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מקום ברכבת התחתית נגד המגנט הצניפה החרוזים.</li></ol>כאשר הפתרון מנקה, להסיר את µL 15 eluate, העברת צינור microfuge 1.5 mL, ולמקם את הדגימה על קרח.
	<li>לכמת הספרייה באמצעות ספקטרופוטומטרים UV. הערה: אחוז ההחלמה צריך להיות ~ 25% (250 ng) של ריכוז ההתחלתי של µg 1 של הדנ א.</li>

8. החל פקד בניהול/איכות
<ol>
	<li>להסיר את התא זרימה אריזה ולצרף את התא זרימה הרצפים נייד, בזמן אמת (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>לצרף את הרצפים (sequencer) למחשב באמצעות כבל USB ולהתחיל את התוכנה רצף (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>לחץ על "התחבר" התקן דרך התוכנה רצף, בחר "NC_Platform_QC.py" ולאחר לחץ על "התחל".</li>
	<li>בקרת איכות (QC) אורכת כ 6-7 דקות כדי להשלים; חפשו 'ים של ירוק' (שטחים גדולים של פלט) על הנתונים QC כדי לאשר כי ישנם מספיק נקבוביות פעילה (&#62; 800) עבור רצפי DNA.</li>
</ol>
9. מתחיל רצף ריצה
<ol>
	<li>פתח את התוכנית רצף; תיבת דו-שיח תופיע. בתיבה מזהה לדוגמה, שם את הדגימה.</li>
	<li>לחץ על התיבה "זרימה Cell ID" והזן את הקוד נמצא על-גבי המדבקה על גג התא זרימה.</li>
	<li>פותחים את המכסה תא זרימה והחלק ואז את המכסה מדגם ימינה (בכיוון השעון) כך שגלוי הנמל הדגימה. ברגע היציאה פתוח, בדוק בועה קטנה. הסר microliters כמה המאגר כולל את הבועה.</li>
	<li>בדוק כדי לוודא כי יש מאגר על פני מערך חיישן. להפוך את המאגר לקרקע על ידי ערבוב 480 µL של הפעלת מאגר עם תערובת דלק (RBF-1, ראה את הטבלה של חומרים) (יש להקפיד לערבב ביסודיות הראשון) עם מים ללא נוקלאז µL 520.</li>
	<li>להוסיף µL 800 המאגר לקרקע הנמל לקרקע. בזהירות הרימו את המכסה "" כדי להפוך אותו לנגיש.</li>
	<li>לאחר 5 דקות, להוסיף µL 200 נוספים של מאגר לקרקע הנמל לקרקע.</li>
</ol>
10. טעינת הספריה
<ol>
	<li>לפני הכנת המקום בספריה של ריאגנטים הבאים על הקרח: RBF-1 (מתוך ערכת רצף), הותאם ו קשורה ספריה, ספריה טעינת חרוזים (LLB; הערכה רצף).</li>
	<li>כדי שפופרת צנטרפוגה 0.2 מ"ל, להוסיף µL 25.5 של RBF ו 12 µL של מים נטולי נוקלאז לשמור בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מערבבים את תואר ראשון במשפטים מאת pipetting שיהיה. להוסיף µL 26.5 של LLB הצינור 0.2 µL. מערבבים את ריאגנטים מאת pipetting שיהיה. הערה: LLB נוטה הסדר מחוץ התערובת.</li>
	<li>להוסיף µL 11 של הספריה מותאם, קשור הצינור 0.2 µL. לערבב על-ידי היפוך ו ספין על ידי צנטריפוגה דופק.</li>
	<li>הוסף µL 75 מדגם מהשלב 9.4 ליציאת ה-"" dropwise. ודא כי כל טיפה זורם לתוך הנמל לפני הוספת הבא.</li>
	<li>בזהירות להחליף את הדגימה המכסה כך bung מזין את היציאה, ולהחליף את המכסה התקן.</li>
</ol>
11. הפעלת קובץ Script פרוטוקול תוכנה רצף
<ol>
	<li>פתח את התפריט הנפתח תחת "בחר תוכנית" ובחר "רצף של 48 שעות."</li>
	<li>לחץ על "לבצע" כפתור כדי להפעיל את קובץ ה-script.</li>
	<li>בדקו את התוצאות של Mux לסרוק דיווח בזרם ההודעות עבור מספר הנקבוביות פעיל ב MUX לסרוק. הערה: מספר זה עשוי להיות שונה מספר הנקבוביות ב- QC לרוץ, הבדל גדול עשוי להצביע על בעיה.<ol>
		<li>אם יש ירידה משמעותית של הנקבוביות פעיל רץ QC, להפעיל מחדש את התוכנה, אם עדיין יש הבדל משמעותי, לאתחל מחדש את המחשב.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>בדוק טמפרטורת הקירור היא 34 מעלות צלזיוס כפי שדווח על ידי סקריפט תוכנה רצף. הערה: אם הטמפרטורה היא לא ב 34 ° C ואז לא יהיו מספיק נקבוביות פעיל לריצה.</li>
	<li>בדוק ההיסטוגרמה באורכים קריאה כדי לקבוע אם המרחק רצף הצפוי ומתאימה הנבחנים.</li>
	<li>סגור את הסוכן בשולחן העבודה באמצעות 'סגור x.' להפסיק תוכנת עריכה ברצף על ידי סוגר את אינטרנט GUI. לנתק את המכשיר מהמחשב.</li>
</ol>
12. ניתוח של ריצה ותוצאות
הערה: במהלך רצף ההפעלה, הנתונים ניתן לנטר שימוש בתוכנית "תצוגה ח באמצעות הסוכן של שולחן העבודה. במהלך או לאחר ההפעלה הושלמה, קבצים זמינים ב FAST5 קובץ בפורמט ה ← נתונים קורא ← להעביר תיקיה (ברירת המחדל). אם תיקיה זו פתוחה כאשר רצף פעילה, המחשב עשוי להקפיא.
<ol>
	<li>כדי להציג ולטפל רצפים, להוריד "HDFViewer".</li>
	<li>כדי להציג את הקבצים רצף, ישירות פתוח HDF הצופה ← פתוח נתונים בתיקיה ← בחר שכל הקבצים סוגי ← בחר c: כונן (ברירת מחדל) ← בבחירת נתונים ← בחר קריאות ← בחר לעבור.</li>
	<li>בחר את הקובץ FASTQ בתפריט הנפתח השמאלי; קבצים יפתח, ניתן לשמור בפורמט FASTQ. הערה: לצורך הניסוי התלמיד, רצפים של נוקלאוטידים 350 או יותר נבחרו לצורך ניתוח נוסף. פלט הטלפונים הבסיס מאפשר למשתמש למיין רצף פעולות הקריאה בהתאם לגודל. FASTQ קבצים ניתן לנתח באמצעות פיצוץ (NCBI) או תוכניות אחרות ביואינפורמטיקה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance.">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).</li><li>Greninger, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+metagenomics+identification+of+viral+pathogens+in+clinical+samples+by+real-time+nanopore+sequencing+analysis.">Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis.</a> Genome Med. 7, 99 (2015).</li><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+draft+sequencing+and+real-time+nanopore+sequencing+in+a+hospital+outbreak+of+Salmonella.">Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella.</a> Genome Biology. 16, 114 (2015).</li><li>Ashton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinION+nanopore+sequencing+identifies+the+position+and+structure+of+a+bacterial+antibiotic+resistance+island.">MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island.</a> Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).</li><li>Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+bacterial+genome+assembled+de+novo.+using+only+nanopore+sequencing+data.">A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data.</a> Nat Method. 12, 733-735 (2015).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+Sequencing+as+a+Rapidly+Deployable+Outbreak+Tool.">Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool.</a> Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).</li><li>Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification.">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li><li>Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+for+Microbial+Identification+and+Characterization.">Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization.</a> J. Vis. Exp. (78), e50405 (2013).</li><li>Rothberg, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+semi-conductor+device+that+enabling+non-optical+genome+sequencing.">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li><li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zero-mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations.">Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li><li>Eid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules.">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li><li>Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleotide+discrimination+in+immobilized+DNA+oligonucleotides+with+a+biological+nanopore.">Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore.</a> PNAS. 106, 7702-7707 (2009).</li><li>Shendure, J., Hanlee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+DNA+sequencing.">Next generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Metagenomics+of+Soil.">The Metagenomics of Soil.</a> Nat Rev Microbiol. 3, 470-478 (2005).</li></ol>

המחברים יש אין גילויים.

שיטות רצף הדור הבא רבות נוצרו כל אחד תלוי רצף על ידי סינתזה אבל הפלטפורמות זיהוי לזיהוי נוקלאוטידים שונים. NS, התוספת האחרונה לשוק, משתמש בשיטה שונה לחלוטין, אשר אינה דורשת תגובה רצף או תווית נוקלאוטידים. שיטה זו מנצלת תשלום דיפרנציאלי של נוקלאוטידים כבר incorporated כפי שהם עוברים הנקבובית מחושמלת. הזיהוי של כל נוקלאוטיד מתרחשת על ידי אפנון של הזרם החשמלי על ידי היסודות השונים כפי שהם עוברים nanopore. מערכת מרובבת זו מאפשר למשתמש רצף קטעים רבים בכל פעם. על ידי קביעת רצף שני גדילי ה-dna, גדל באופן משמעותי הדיוק של הרצף, התוכנה רצף, אשר ניתן לטעון על גבי מחשב נייד, מעבד את האותות, מספק את המידע רצף מסוגל לנתח.
ב- pyrosequencing, רצף לפי שיטת סינתזה (SBS), זיהוי של בסיס ספציפי שולבו התבנית תלוי וזמינותו לוציפראז הדור של אותות chemiluminescent8. ב רצף מוליכים למחצה יון, יון מימן שפורסמו, אשר מפחית את רמת החומציות מזוהה על ידי חיישן יון9. מולקולה בודדת רצף בזמן אמת תלויה אפס במצב גל מדריך (ZMW)10, אשר מאירה לגילוי מולקולה נמכרות מתויג נוקלאוטיד incorporated. SBS משתמש בשיטה ייחודית כדי להגביר את המטרה DNA כך אשכולות הרצפים הייחודיים הם שנוצר13. זיהוי של נוקלאוטיד הוסיף מושגת כאשר זריחה של נוקלאוטיד מתויג נרשם. NS מאידך גיסא יש יתרון ייחודי על פני שיטות אחרות בכך שזה דורש משאבים טכניים מוגבל, נייד, מייצרת קריאות רצף ארוך, דורש אין הגברה DNA מוקדמת, יכול להיות מופעל עם עלות מופחתת בהשוואה לשיטות אחרות. התלמידים שלנו למצוא פרוטוקול הכנה ספריה חדשה, מהירה פשוטה, נוטה שיעור מעבדה 3 שעות. בחלק מן הנושאים נתקלנו היו בועות בתא זרימה אשר היו קשה להסיר, זה נדרש כוח משמעותי המחשב (טראבייט אחד של אחסון), הפלט הנוכחי של הנתונים בקובץ FAST5, רצף זרימה התא יש חיי מדף מוגבלים לפני זה מתדרדר. בנוסף, חסרונות אחרים של פרוטוקול רצף מצדו NS (פרוטוקול ארוך) הוא כי זה דורש מספר צעדים הכנה ספריה, דורש התמחות בטכניקות ביולוגיה מולקולרית, יוצר נאמנות רצף מופחתת בהשוואה לחלק רצף מתודולוגיות3. אולם, ההתקדמות האחרונה עם ערכת הכנה מהירה ספריה חדשה דורשת רק 10 דקות הכנה ספריה, הוכיח שיעור שגיאה רצף מופחת. השיטה החדשה של הכנת ספריה לא התקשה מאוד לשימוש בכיתה במעבדה.
ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול, בפרט QC של התא זרימה. זה כולל ביצוע של QC הראשונית תוך חמישה ימים של קבלת של התא זרימה ושימוש בהם בתוך 8 שבועות. למרות השתמשנו תאים זרימה שהיו מעבר 8 שבועות, הקטינה באופן משמעותי מספר הנקבוביות פתוח/פעיל. חשוב כי ניסויים מתוכננים כדי להתאים ציר זמן שבו שימוש מרבי של תאי זרימה מושגת. יש להשתמש בפרוטוקול ניקוי ואנו תאי זרימה עם הצלחה לעשות בה שימוש חוזר.
חוקרים את metagenomics של אדמת מייצגים מאגר גנטי עצום של גיוון מיקרוביאלי. כך למשל, גרם אחד של אדמת מוערך מכילים בין 107 -9 10 תאים prokaryotic14. יתר על כן, אדמת אורגניזמים הם המקור העיקרי של מוצרים טבעיים חדשניים, אנזימים אנטיביוטיקה. לפיכך, ניתוח רצף הדנ א metagenomics אדמה מייצגת כלי הדרכה חשוב לסטודנטים בכל רמה של חינוך. של הטכנולוגיה NS להקל של שימוש ולהפוך בעלות נמוכה זו מערכת כלי הוראה יעילה מאוד. סטודנטים יכולים רצף דגימות סביבתי ולאחר עם סיומו של הרצף להשתמש בכלים לביואינפורמטיקה זמין כדי לזהות ולאפיין רצפי חיידקים, metagenomics הבדיקה דוגמאות. באמצעות הטכנולוגיה NS, סטודנטים יש התנסות אמיתית, יש עד עכשיו היה מתוך להגיע לשימוש בקורסים מעבדה בשל מומחיות טכנית מתקדמת עלויות גבוהות ריאגנט, ציוד ותחזוקה של פלטפורמות אחרות רצף. לאחרונה, אחד הסטודנטים שלנו (הריסון ג', תקשורת אישית) דיווחו על השימוש בטכנולוגיה זו בפרוייקט ניטור סביבתי של החווה קרקעות. אנו מצפים כי יהיו הרבה יותר יישומים לטכנולוגיה הזו במרחב החינוך.

המטרה של הליך זה הוא להדגים את השלבים הדרושים עבור הכנה של ספריית ה-DNA סביבתיים רצף, ניצול של nanopore זרימה תא רצף התקן, וכדי לבצע אנליזה של רצפי דנ א שנוצר באמצעות מערכת תוכנה, המרכז הלאומי לביוטכנולוגיה מידע (NCBI) ושפור לזהות מינים מיקרוביאלית בקרקע. כיום, רוב פלטפורמות רצפי DNA דורשות השקעה גדולה ב מכשור מורכב, שאינו ריאלי בסביבות המסכן משאבים או ביישומים שדה והדרכה טכנית. פלטפורמת רצף (NS) nanopore מבטלת נושאים אלה עם העלות האפקטיבית, פשוט להשתמש ספריית הכנת פרוטוקול, ואת מכשיר נייד רצף ולנתח מגוון רחב של סוגים שונים של חומצות גרעין1,3. לנו יש שולבו פלטפורמת NS בכמה כיתות המעבדה לתלמידי תואר שני.
Nanopore טכנולוגיה עבור רצפי מולקולות הוכיחה יישומים רחב במדעי החיים, כולל זיהוי של פתוגנים בקטריאליים וויראליים1,2,6, המגוון הביולוגי סביבתיים מחקרים, ניטור בטיחות מזון, אנליזה גנומית3,5, ואפיון של חיידקים עמידות לאנטיביוטיקה4. NS היא שיטה מהירה ומדויקת על רצף חומצות גרעין המבוסס על העיקרון של "לנטישה רצף" על ידי גילוי הפרעות חשמל על ידי בסיסים נוקלאוטיד בודד כאשר יחיד DNA נטוש עוברת דרך nanopore מוכנס לתוך חשמלית ממברנות פולימר סינתטי. השלבים הכרוכים בהכנת DNA NS כוללות פיצול הגנום, ותיקון קצה 3' דה-עוקב של שברי גנומית, מתאם, הקשר חישול ל- DNA, טיהור ספריית DNA ולאחר טעינת הספריה לתוך המכשיר הסלולרי זרימה nanopore. פיצול של הגנום ~ 8 kb מידות מושגת על ידי צריך שתוציאו µg 1-2 של ה-DNA גנומי דרך צינור פיצול גרם-צינור. הקצוות המפוצלים גנומית מכן תוקן, זנב עם dA פוליפוני באמצעות ערכת זמינים מסחרית. רצפים במתאם יחיד נטושים, אשר תואמים עם החלבון מנוע nanopore, מתווספים לקצוות דנ א אשר משמשים כדי להנחות את רצף ה-DNA דרך nanopore (איור 1). רצפי הקשר נדרשים עבור טיהור DNA, לוקליזציה מולקולות DNA קרום הנקבובית. הסיכה נוצר על ידי נבדק מתאם סיכת ראש בקצה אחד של הספרייה זנב dA. המבנים מכבנה בקצוות ה-DNA מאפשר קריאה הגדילים antisense על תבונה כמו ה-DNA עובר nanopore (איור 2). בספרייה גנומית מוכן ואז מטוהרים מן התגובה באמצעות חרוזים streptavidin באמצעות שדה מגנטי, ואחריה טעינה הדגימה לתוך התא זרימת nanopore לניתוח.
ברצף הדנ א שקובעת איכות, קריאות רצף המקובלות לניתוח. ואז נתונים מספר כלים ביואינפורמטיקה לזהות חיידקים. הרצף "מתורגמים" לתוך FASTQ של תבנית FAST5. בפורמט FASTQ, רצפי ואז ניתן להשתמש בניתוח הפיצוץ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:625px;" width="626">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thermal Cycler</td>
			<td style="width:124px;">LifeECO</td>
			<td style="width:119px;">BTC42096</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Covaris g-TUBE</td>
			<td style="width:124px;">Covaris</td>
			<td align="right" style="width:119px;">520079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">NEBNext End Repair Module</td>
			<td style="width:124px;">New England BioLab</td>
			<td style="width:119px;">E7546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z666505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NEB Blunt/TA Ligase Master Mix</td>
			<td style="width:124px;">New England BioLab</td>
			<td style="width:119px;">MO367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MyOne C1 Strepavidin Beads</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf microcentrifuge</td>
			<td style="width:124px;">Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Model 5420</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop UV spectrophotometer</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td>Model 2000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Belly Dancer Orbital Shaker</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z768499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Power Soil DNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:124px;">MO BIO</td>
			<td style="width:119px;">12888-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ligation Sequencing Kit 2D</td>
			<td style="width:124px;">Oxford Nanopore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SQK-LSK208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA</td>
			<td style="width:124px;">Oxford Nanopore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SQK-RAD002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix)</td>
			<td style="width:124px;">New England BioLab</td>
			<td style="width:119px;">MO367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AmPure XP Magnetic Beads</td>
			<td style="width:124px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basic Starter Pack&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Oxford Nanopore&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Includes MinION&#160; Sequencing Device and Flow Cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinKNOW software</td>
			<td style="width:124px;">Oxford Nanopore&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA</td>
			<td style="width:124px;">Oxford Nanopore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SQK-RAD002</td>
			<td style="width:167px;">Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanopore dna sequencing for metagenomic soil analysis

מאמר זה מתאר את השלבים להקמת ספרייה דנ א אדמה, הכנה, השימוש התא זרימה nanopore, וניתוח של רצפי דנ א מזוהה באמצעות תוכנת מחשב. רצפי Nanopore DNA היא טכניקה גמיש המאפשר רצף הגנום מיקרוביאלי מהירה לזהות מינים בקטריאליים וויראליים, כדי לאפיין את זני חיידקים, וכדי לזהות מוטציות גנטיות המקנים עמידות לאנטיביוטיקה. היתרונות של nanopore רצף (NS) עבור מדעי החיים כוללים שלו מורכבות נמוכה, עלות מופחתת, ורצף מהיר בזמן אמת של דנ א גנומי מטוהרים, PCR amplicons, דגימות cDNA או RNA. NS הוא דוגמה "רצף strand" הכוללת רצף ה-DNA על ידי המנחה מולקולה בודדת DNA נטושים דרך nanopore זה מוכנס לתוך קרום פולימר סינתטי. הקרום יש זרם חשמלי להחילה אז בסיסי בודדות עוברים דרך nanopore הזרם החשמלי מופרת בדרגות על ידי היסודות נוקלאוטיד ארבע. הזיהוי של כל נוקלאוטיד מתרחשת על ידי גילוי של אפנון האופיינית של הזרם החשמלי על ידי היסודות השונים כפי שהם עוברים nanopore. מערכת NS מורכב כף יד, USB מופעל התקן נייד, תא זרימה חד פעמיות המכיל מגוון nanopore. המכשיר הנייד מחובר מחשב נייד סטנדרטי קורא ומתעדת את רצף ה-DNA באמצעות תוכנת מחשב.

הטכנולוגיה nanopore ועיצוב ניסיוני מספק שיטה מהירה וזולה עבור תלמידים על רצף אדמה דנ א. הפעל נציג עבר את הפרמטרים בקרת איכות עם יותר מ-800 נקבוביות זמין עבור רצף. הפעל כתוצאה מ 125,000 קריאות זמינה למחקר באורך רצף החציוני של 5.38 kb. רצפים מקבלים ניקוד האיכות, רק אלה רצפים עם ציונים מקובל מכן נותחו. כמו הפלט של הרצף התגובה הוא בתבנית FAST5, שאינה מקובלת על-ידי תוכניות כגון הפיצוץ (NCBI), רצפי נתפסו במציג HDF אשר ממירה את רצפי לתבנית FASTQ, אשר תואם לניתוח הפיצוץ. בעתיד חזרות של התוכנה, הנתונים יהיה זמין כתבנית FASTQ, ומבטלת את הצורך עבור הצופה HDF. לראות משלים המספרים 1, 2 ו- 3-
חמישים רצף נוקלאוטידים מעל 350 אורך נידונו ניתוח לפי BLASTN (נוקלאוטידים נגד נוקלאוטיד מסד הנתונים) או BLASTX (מתורגם חומצת אמינו לרצף נוקלאוטידים) (NCBI) כדי לזהות אורגניזמים במדגם קרקע. בהתחשב בתקופה אילוצים של המחלקה, כי המוקד של הקורס הוא על שיטות מעבדה, לא ביואינפורמטיקה, יש לנו את התלמידים לנתח את רצפי בתוך הפרמטרים האלה. מחלקות ביואינפורמטיקה שלנו יכול להשתמש בנתונים לפיתוח של כלי ניתוח צינור. רמה זו של ביואינפורמטיקה ניתוח אינו מכוסה בכיתה מבוסס מעבדה. טבלה 1 היא רשימה של האורגניזמים שזוהו עם הערכים e של פחות מ-4 e-04. באופן כללי, ערכי e-פחות מ- 4 e-04 מצביעים על דמיון חזק בין הרצף בהתאמה לרצף הקלט (שאילתת). האורגניזמים המזוהה על-ידי BLASTN (נגד מסד הנתונים לא יתיר (ע נ)) מתוך מגוון רחב של מינים, זמינים גנומית נוסף וניתוחים חלבון. דוגמה זו של האדמה, אשר באו גן במחוז בולטימור, MD היה מעולם לא נוסה, כך היו נתונים קודמים כדי לקבוע מה יהיה האורגניזמים בקרקע. BLASTN ניתוח (נגד מסד הנתונים nr) ניתוח גם ציין היו רצפי עם אין התאמה במסד הנתונים של נאט ו. כדי לקבוע אם אלו באמת הרומן רצפים, נדרש מחקר נוסף. ניתוח של מספר רצפי מאת BLASTX גילה חלבונים שונים של אורגניזמים אינו מיוצג בניתוח BLASTN. בטבלה 2 פירוט מספר חלבונים אפשרי כולל endopeptidases ו- ATPases כמו חלבונים. שימוש בספריה זו של רצפים, תלמידים יש ההזדמנות להשתמש בכלים לביואינפורמטיקה מתוחכמים יותר לבצע ניתוח נוסף, אם בבימויו של המדריך.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig1.jpg"> 
איור 1 : הכנה ספרייה גנומית. פעולות עבור הכנה של ספריית דנ א גנומי רצף באמצעות טכנולוגיית nanopore. איור זה השתנה עם ההרשאות הדרושות. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55979/55979fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig2.jpg"> 
איור 2 . סכמטי של רצפי DNA באמצעות nanopore. DNA עובר דרך קרום nanopore בזיהוי הדור ובסיס האות החשמלי. איור זה השתנה עם ההרשאות הדרושות. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55979/55979fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>אורגניזם</td>
			<td>ערך e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomyces sp.</td>
			<td>3.00E-06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocardoides sp.</td>
			<td>5.00E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>גורדוניה sp.</td>
			<td>5.00E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyphomicrobium nitrativorens</td>
			<td>1.00E-139</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>נובלה Starkeya</td>
			<td>1.00E-31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyphomicrobium denitrificans</td>
			<td>1.00E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibomicrobium sp.</td>
			<td>5.00E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas sp.</td>
			<td>2.00E-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מרינוס Rhodothemus</td>
			<td>1.00E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turneiella parva</td>
			<td>2.00E-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>0.00E + 00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sp מקבעי חנקן ופטריות.</td>
			<td>3.00E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemmatirosa kalamazoonesis</td>
			<td>1.00E-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burkholderia sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomonas sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellumonas sp.</td>
			<td>6.00E-11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: נבחר את התוצאות של ניתוח BLASTN. אדמה רצפי DNA metagenomics נתון BLASTN דמיון חיפוש במסד הנתונים של נוקלאוטיד יתירים NCBI. המידע המדווח להיות e-ערכי של 4x e-4 או פחות.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>חלבון</td>
			<td>אורגניזם</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>חלבון היפותטי</td>
			<td>חיידק Acidobacter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyltransferase תלויים סאם</td>
			<td>ה denitrificans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPase</td>
			<td>Jannaschia sp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endopeptidase</td>
			<td>שיגלה sonnei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>פירוק חלבונים</td>
			<td>E. coli</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
בטבלה 2: נבחר את התוצאות של ניתוח BLASTX. אדמה רצפי DNA metagenomics נתון BLASTX חיפוש דמיון נגד המאגר חלבון לא יתיר NCBI.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig1.jpg"> 
משלימה איור 1: התוצאה היא פלטפורמה QC. התוצאות של פלטפורמת QC מוצגים. בפינה הימנית העליונה הן התוצאות של QC של הנקבוביות פעיל. כל רביע של התא זרימה נבחנה על הנקבוביות פעיל. הדף הראשי הוא דינמי ומשתנה כמו כל רביע נבדק. בהפעלה זו, אותרו 1,414 נקבוביות יחיד.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55979/55979supfig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig2.jpg"> 
משלימה איור 2: FAST5 המרת קבצים לקבצים FASTQ. מצד ימין, הנה הפלט של נתונים מ הפעל רצף. כל שורה מייצגת מרצף בודדים. הצד השמאלי של האיור מציג את רצף המסומן מצד ימין, הצופה HDF הממירה את הרצף בקובץ FASTQ אשר יכול לשמש לצורך ניתוח נוסף. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55979/55979supfig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig3.jpg"> 
משלימה איור 3: דוגמה של FASTQ רצף במציג HDF. רצף זה (קריאה 803) הוא בקובץ FASTQ אשר ממירה את נתוני FAST5 נוקלאוטידים. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55979/55979supfig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis at JoVE.com

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

Nanopore טכנולוגיה עבור רצפי מולקולות יש אפליקציות רחב במדעי החיים, כולל זיהוי של פתוגנים, ניטור בטיחות מזון, אנליזה גנומית, ניטור סביבתי metagenomic אפיון בקטריאלי עמידות לאנטיביוטיקה. במאמר זה, הוכח נוהל metagenomic אדמה רצפי DNA לצורך זיהוי מינים בטכנולוגיה רצף nanopore.

Nanopore רצפי DNA לניתוח Metagenomic אדמה

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

nanopore-dna-sequencing-for-metagenomic-soil-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

30.2K Views.  Johns Hopkins University. Nanopore טכנולוגיה עבור רצפי מולקולות יש אפליקציות רחב במדעי החיים, כולל זיהוי של פתוגנים, ניטור בטיחות מזון, אנליזה גנומית, ניטור סביבתי metagenomic אפיון בקטריאלי עמידות לאנטיביוטיקה. במאמר זה, הוכח נוהל metagenomic אדמה רצפי DNA לצורך זיהוי מינים בטכנולוגיה רצף nanopore.

Video: Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes and soil organic matter formation to small-scale stable-isotope biomarker probing. Coupling multiple stable isotopes such as 13C with 15N, 18O or&#160;2H has the potential to reveal even more information about complex stoichiometric relationships during biogeochemical transformations. Isotope labeled plant material has been used in various studies of litter decomposition and soil organic matter formation1-4. From these and other studies, however, it has become apparent that structural components of plant material behave differently than metabolic components (i.e. leachable low molecular weight compounds) in terms of microbial utilization and long-term carbon storage5-7. The ability to study structural and metabolic components separately provides a powerful new tool for advancing the forefront of ecosystem biogeochemical studies. Here we describe a method for producing 13C and 15N labeled plant material that is either uniformly labeled throughout the plant or differentially labeled in structural and metabolic plant components.
Here, we present the construction and operation of a continuous 13C and 15N labeling chamber that can be modified to meet various research needs. Uniformly labeled plant material is produced by continuous labeling from seedling to harvest, while differential labeling is achieved by removing the growing plants from the chamber weeks prior to harvest. Representative results from growing Andropogon gerardii Kaw demonstrate the system&#39;s ability to efficiently label plant material at the targeted levels. Through this method we have produced plant material with a 4.4 atom%13C and 6.7 atom%15N uniform plant label, or material that is differentially labeled by up to 1.29 atom%13C and 0.56 atom%15N in its metabolic and structural components (hot water extractable and hot water residual components, respectively). Challenges lie in maintaining proper temperature, humidity, CO2 concentration,&#160;and light levels in an airtight 13C-CO2 atmosphere for successful plant production. This chamber description represents a useful research tool to effectively produce uniformly or differentially multi-isotope labeled plant material for use in experiments on ecosystem biogeochemical cycling.

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

This method explains how to build and operate a continuous 13C and 15N isotope labeling chamber for uniform or differential plant tissue labeling. Representative results from metabolic and structural labeling of Andropogon gerardii are discussed.

עיצוב והפעלה של רציף<sup&gt; 13</sup&gt; C ו<sup&gt; 15</sup&gt; N תיוג הלשכה לאחיד או דיפרנציאלי, מטבולית ומבנית, צמח איזוטופ תיוג

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes ...

Experimental Protocol for Manipulating Plant-induced Soil Heterogeneity

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as plant-soil feedbacks (PSF) have large effects on plant performance, and create environmental heterogeneity that depends on the community composition. Understanding the importance of PSF for plant community assembly necessitates understanding of the role of heterogeneity in PSF, in addition to mean PSF effects. Here, we describe a protocol for manipulating plant-induced soil heterogeneity. Two example experiments are presented: (1) a field experiment with a 6-patch grid of soils to measure plant population responses and (2) a greenhouse experiment with 2-patch soils to measure individual plant responses. Soils can be collected from the zone of root influence (soils from the rhizosphere and directly adjacent to the rhizosphere) of plants in the field from conspecific and heterospecific plant species. Replicate collections are used to avoid pseudoreplicating soil samples. These soils are then placed into separate patches for heterogeneous treatments or mixed for a homogenized treatment. Care should be taken to ensure that heterogeneous and homogenized treatments experience the same degree of soil disturbance. Plants can then be placed in these soil treatments to determine the effect of plant-induced soil heterogeneity on plant performance. We demonstrate that plant-induced heterogeneity results in different outcomes than predicted by traditional coexistence models, perhaps because of the dynamic nature of these feedbacks. Theory that incorporates environmental heterogeneity influenced by the assembling community and additional empirical work is needed to determine when heterogeneity intrinsic to the assembling community will result in different assembly outcomes compared with heterogeneity extrinsic to the community composition.

Understanding the role of environmental heterogeneity in species coexistence has typically focused on types of heterogeneity that are extrinsic to the community&#8217;s species composition. We provide novel detailed methods for creating soil heterogeneity treatments using soils subject to plant-soil feedback conditioning, or heterogeneity intrinsic to the community composition.

פרוטוקול ניסוי להטרוגניות קרקע מושרה צמח מניפולציה

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as ...

Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles to be performed in parallel. The purpose of the method presented here is to obtain a highly accurate and reliable analysis of the endotoxin and DNA content of bio-aerosols extracted from filters. The extraction of high molecular weight organic molecules, such as lipopolysaccharides, from sampled filters involves shaking the sample in a pyrogen-free water-based medium. The subsequent analysis is based on an enzymatic reaction that can be detected using a turbidimetric measurement. As a result of the high organic content on the sampled filters, the extraction of DNA from the samples is performed using a commercial DNA extraction kit that was originally designed for soils and modified to improve the DNA yield. The detection and quantification of specific microbial species using quantitative polymerase chain reaction (q-PCR) analysis are described and compared with other available methods.

Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.

Air-שנדגמו ניתוח סינון עבור אנדוטוקסינים ותוכן DNA

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles ...

A Protocol for Collecting and Constructing Soil Core Lysimeters

Leaching of nutrients from land applied fertilizers and manure used in agriculture can lead to accelerated eutrophication of surface water. Because the landscape has complex and varied soil morphology, an accompanying disparity in flow paths for leachate through the soil macropore and matrix structure is present. The rate of flow through these paths is further affected by antecedent soil moisture. Lysimeters are used to quantify flow rate, volume of water and concentration of nutrients leaching downward through soils. While many lysimeter designs exist, accurately determining the volume of water and mass balance of nutrients is best accomplished with bounded lysimeters that leave the natural soil structure intact. 
Here we present a detailed method for the extraction and construction of soil core lysimeters equipped with soil moisture sensors at 5 cm and 25 cm depths. Lysimeters from four different Coastal Plain soils (Bojac, Evesboro, Quindocqua and Sassafras) were collected on the Delmarva Peninsula and moved to an indoor climate controlled facility. Soils were irrigated once weekly with the equivalent of 2 cm of rainfall to draw down soil nitrate-N concentrations. At the end of the draw down period, poultry litter was applied (162 kg TN ha-1) and leaching was resumed for an additional five weeks. Total recovery of applied irrigation water varied from 71% to 85%. Nitrate-N concentration varied over the course of the study from an average of 27.1 mg L-1 before litter application to 40.3 mg L-1 following litter application. While greatest flux of nutrients was measured in soils dominated by coarse sand (Sassafras) the greatest immediate flux occurred from the finest textured soil with pronounced macropore development (Quindocqua).

A detailed method for extraction and assembly of intact soil core lysimeters and their use for study of leachate and associated loss of nutrients from surface applied poultry litter is demonstrated.

פרוטוקול Lysimeters Core קרקע איסוף הבנייה

Leaching of nutrients from land applied fertilizers and manure used in agriculture can lead to accelerated eutrophication of surface water. Because the ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a series of incubators. A temperature gradient is passively established across the surface of the table between the heated and cooled ends and is lost quickly at distances above the surface. Since temperature is only controlled on the table surface, experiments are restricted to shallow containers, such as Petri dishes, placed on the table. Welding continuous aluminum vertical strips or gussets perpendicular to the surface of a table enables temperature control in depth via convective heat flow. Soil in the channels between gussets was maintained across a gradient of temperatures allowing a greater diversity of experimentation. The gusseted design was evaluated by germinating oat, lettuce, tomato, and melon seeds. Soil temperatures were monitored using individual, battery-powered dataloggers positioned across the table. LED lights installed in the lids or along the sides of the gradient table create a controlled temperature chamber where seedlings can be grown over a range of temperatures. The gusseted design enabled accurate determination of optimum temperatures for fastest germination rate and the highest percentage germination for each species. Germination information from gradient table experiments can help predict seed germination and seedling growth under the adverse soil conditions often encountered during field crop production. Temperature effects on seed germination, seedling growth, and soil ecology can be tested under controlled conditions in a laboratory using a gusseted thermogradient table.

Traditional thermogradient tables create a range of temperatures across the surface. Welding gussets perpendicular to the surface of a thermogradient table will control temperature in depth increasing possible research applications.

לוח א gusseted Thermogradient לשלוט טמפרטורות קרקע להערכת גדילת צמחי ניטור תהליכי אדמה

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Protocols for Quantifying Transferable Pesticide Residues in Turfgrass Systems

Plant canopies in established turfgrass systems can intercept an appreciable amount of sprayed pesticides, which can be transferred through various routes onto humans. For this reason, transferable pesticide residue experiments are required for registration and re-registration by the United States Environmental Protection Agency (USEPA). Although such experiments are required, limited specificity is required pertaining to experimental approach. Experimental approaches used to assess pesticide transfer to humans including hand wiping with cotton gloves, modified California roller (moving a roller of known mass over cotton cloth) and soccer ball roll (ball wrapped with sorbent strip) over three treated turfgrass species (creeping bentgrass, hybrid bermudagrass and tall fescue maintained at 0.4, 5 and 9 cm, respectively) are presented. The modified California roller is the most extensively utilized approach to date, and is best suited for use at low mowing heights due to its reproducibility and large sampling area. The soccer ball roll is a less aggressive transfer approach; however, it mimics a very common occurrence in the most popular international sport, and has many implications for nondietary pesticide exposure from hand-to-mouth contact. Additionally, this approach may be adjusted for other athletic activities with limited modification. Hand wiping is the best approach to transfer pesticides at higher mowing heights, as roller-based approaches can lay blades over; however, it is more subjective due to more variable sampling pressure. Utility of these methods across turfgrass species is presented, and additional considerations to conduct transferable pesticide residue research in turfgrass systems are discussed.

Transferable pesticide residue experiments in turfgrass systems are integral components of human risk exposure assessments. Experimental approaches to measure transferable residues should be adjusted to the human interaction of interest and turfgrass system dynamics. Three transferable pesticide residue protocols are presented and the suitability across three turfgrass systems is discussed.

פרוטוקולים לכימות שאריות חומר הדברה להעברת מערכות Turfgrass

Plant canopies in established turfgrass systems can intercept an appreciable amount of sprayed pesticides, which can be transferred through various routes ...

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial communities, a relatively precise but effort-intensive technique to assay microbial community composition is phospholipid fatty acid (PLFA) analysis. PLFA was developed to analyze phospholipid biomarkers, which can be used as indicators of microbial biomass and the composition of broad functional groups of fungi and bacteria. It has commonly been used to compare soils under alternative plant communities, ecology, and management regimes. The PLFA method has been shown to be sensitive to detecting shifts in microbial community composition.
An alternative method, fatty acid methyl ester extraction and analysis (MIDI-FA) was developed for rapid extraction of total lipids, without separation of the phospholipid fraction, from pure cultures as a microbial identification technique. This method is rapid but is less suited for soil samples because it lacks an initial step separating soil particles and begins instead with a saponification reaction that likely produces artifacts from the background organic matter in the soil. 
This article describes a method that increases throughput while balancing effort and accuracy for extraction of lipids from the cell membranes of microorganisms for use in characterizing both total lipids and the relative abundance of indicator lipids to determine soil microbial community structure in studies with many samples. The method combines the accuracy achieved through PLFA profiling by extracting and concentrating soil lipids as a first step, and a reduction in effort by saponifying the organic material extracted and processing with the MIDI-FA method as a second step.

The article describes a method that increases throughput while balancing effort and accuracy for extraction of lipids from the cell membranes of microorganisms for use in characterizing both total lipids and the relative abundance of indicator lipids to determine soil microbial community structure in studies with many samples.

ליפיד הפקת וניתוח שיטה לאפיון קרקע חיידקים בניסויים עם דוגמאות רבות

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonate (CaCO3) profiles. The objective is to describe a simple conceptual model and detailed protocol for repeatable field and laboratory measurements of these quantities. Here, accurate elevation is measured using a ground-based differential global positioning system (GPS); other data acquisition methods could be applied to the same basic method. Soil samples are collected from prescribed depth intervals and analyzed in the lab using an efficient and precise modified pressure-calcimeter method for quantitative analysis of inorganic carbon concentration. Standard statistical methods are applied to point data, and representative results show significant correlations between changes in soil surface layer CaCO3 and changes in elevation consistent with the conceptual model; CaCO3 generally decreased in depositional areas and increased in erosional areas. Maps are derived from point measurements of elevation and soil CaCO3 to aid analyses. A map of erosional and depositional patterns at the study site, a rain-fed winter wheat field cropped in alternating wheat-fallow strips, shows the interacting effects of water and wind erosion affected by management and topography. Alternative sampling methods and depth intervals are discussed and recommended for future work relating soil erosion and deposition to soil CaCO3.

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonates. Repeatable methods for field and laboratory measurements of these quantities and data analysis methods are described here.

מדידה ומיפוי דפוסים של סחף אדמה ומשקעים הקשורים אדמה ריכוזים קרבונט תחת ניהול חקלאיים

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several limitations that have resulted in the exclusion of many species. Advances in the field over the last two decades have led occupational health researchers to turn to molecular-based approaches for identifying fungal hazards. These methods have resulted in the detection of many species within indoor and occupational environments that have not been detected using traditional methods. This protocol details an approach for determining fungal diversity within air samples through genomic DNA extraction, amplification, sequencing, and taxonomic identification of fungal internal transcribed spacer (ITS) regions. ITS sequencing results in the detection of many fungal species that are either not detected or difficult to identify to species level using culture or microscopy. While these methods do not provide quantitative measures of fungal burden, they offer a new approach to hazard identification and can be used to determine overall species richness and diversity within an occupational environment.

Determining the fungal diversity within an environment is a method utilized in occupational health studies to identify health hazards. This protocol describes DNA extraction from occupational air samples for amplification and sequencing of fungal ITS regions. This approach detects many fungal species that can be overlooked by traditional assessment methods.

אוסף והפקת האוויר תעסוקתית דוגמאות לניתוח של DNA פטרייתי

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

בידוד וניתוח של הקהילות מיקרוביאלית בקרקע, Rhizosphere ושורשים בניסויים עשב רב שנתי

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...