We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.

1. הכנת הזחלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבוע לפני הקלטת התנהגות, להגדיר צלב (מינימום של 25 בתולות ו -5 גברים). לשמור על כל הצלבים הצאצאים של 25 מעלות צלזיוס. הערה: הטמפרטורה של תנאי תרבות ניתן לשנות, אבל קו הזמן המתואר להלן היה צריך להיות מותאם חשבון לשינויים במהירות התפתחותית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 ימים לפני ההקלטה, דבר ראשון בבוקר, להציב הצלב לכלוב אוסף עם כובע אגר / מיץ טיפה (0.5-1 מ&quot;ל) של רסק שמרים במרכז הכובע אגר / מיץ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך כלוב אוסף, חורים לתוך עוז 6. פוליאתילן מרובע בקבוק תסיסנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך אגר / כמוסות מיץ, לערבב 18 גרם של אגר עם מיליליטר מי 600 בבקבוק חרוטים. בתוך סוכרוז הבקבוק לערבב 20 גרם נפרד עם מיץ תפוחים 200 מ&quot;ל. מיקרוגל עד מוצקים הם מומסים. מערבבים ומערבבים, המאפשרים לתערובת להתקרר עד 60 ° C. הוסף 20 מ&quot;ל 10% מתיל-p-hydroxybenzoate באתנול 95%, ומערבבים. הוסף ~ 7מ&quot;ל החצי התחתון של צלחת פטרי עגול 10 מ&quot;מ 35 x. אפשר / מיץ אגר לגבש עבור שעה 1 ב RT. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך להדביק שמרים, מוסיף בחלקים שווים על ידי שמרים ומים יבשים נפח. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדוק את בריאותם של אוספי זחל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקר, 4 ו -3 ימים לפני ההקלטה, להסיר את הכובע למקם כובע טרי על הכלוב. שנה את הכמוסות באותו הזמן בכל יום כדי להגיע אוסף 24 שעות של ביצי זחל שזה עתה בקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל כובע המוסר, לבחון את זה כדי לראות כמה ביצי הצלב היא נחת. צפו בין 500-2,000 ביצים. התאם את מספר המבוגרים, אם יש צורך בכך. הערה: כמה ביצים צריכות בוקעים רימות, ואת הזחלים שזה עתה בקעו יימצאו הרחק להדביק השמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גיל כל כובע למשך 24 שעות. לבחון מחדש את הכובע כדי לקבוע אם הזחלים הם בריאים. הערה: ביצים רוב צריך בקעו רימות, ואת הזחלים צריכים זחל לתוך ye<html> הדבק אס &#39;. סימנים של בריאות לקויה כוללים מספר רב של ביצים שלא נולדו, גופי זחל מתו הרחק להדביק שמרים, וזחלים עם כתמים כהים משמעותיים בבטן, מה שמעיד על תגובה חיסונית. אם הזחלים אינם בריאים, לשנות את הכלוב, להפוך כמוסים טריים / שמרי רסק, ולבדוק את הגנוטיפ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הכובעים הישנים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף זחלים להקלטות התנהגותי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשני היום 2 ו 1 לפני ההקלטה, להסיר את הכובע ולהחליף עם כובע טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל כל כובע סיר ולשמור על 25 מעלות צלזיוס. זה יהיה לייצר סדרה מבוימת של זחלים להקלטות התנהגותי. הזחלים מן-שזה עתה בקעו (posthatch hr 0-4) באמצעות instar השני (24-48 שעות posthatch) ניתן להשתמש בערוצים. שמור כמוסים להקלטות בימים עוקבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את כל הכמוסות לאחר 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, חזור על שלבי 1.4.1-1.4.3 עד 5 ד נוספים. אחרי זה פחות ביציות מופרות מיוצרים. </li></ol></li></ol>= &quot;Jove_title&quot;&gt; 2. הכנת ערוצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את PDMS ערוץ ליניארי (polydimethylsiloxane, אלסטומר סיליקון) הליהוק עובש (איור 1 א). PDMS תבניות יציקה זמין ממעבדת Heckscher לפי בקשה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את עובש הליהוק עם אלכוהול איזופרופיל. אוויר יבש, טיפה יבשה עם מגבוני מעבדה, או להשתמש ואוויר דחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התבנית הליהוק לתוך מכסה צלחת 10 ס&quot;מ פטרי או מיכל אחר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן ויוצק פתרון agarose. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון agarose 3% במים (3 גרם ב 100 מ&quot;ל) על ידי במיקרוגל עד להמסה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצננים 55 ° C, המאפשר בועות לעלות אל פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התערובת agarose לתוך צלחת פטרי שמכילה את עובש הליהוק כך העובש פשוט מכוסה. תן סט agarose עד הקרושה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את ערוצי agarose מתבנית הליהוק. חתוך את הקצוות של הדיסק agarose עם סכין גילוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הערוץים בצלחת 10 ס&quot;מ פטרי שקוע במים. הם יכולים להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים. </li></ol></li></ol> 3. העמסת זחל לתוך ערוץ להתנהגות שיא הערה: אם אחסון ערוצים ב 4 ° C, לאפשר ערוצים לבוא RT לפני השימוש להקלטה התנהגותי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סכין גילוח נקי לחתוך ערוץ אחד מאלה מוכנים בשלב 2 (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג מלקחיים להציב את מחורץ-בצד למעלה ערוץ על coverslip זכוכית (איור 2 ב). הגודל והעובי של coverslip תלוי בהיקף הספציפי המשמש הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים בסדר לבחור זחל מן הכובע אגר / המיץ מוכן בשלב 1 ומקום לתוך תעלת החתך (איור 2 ג). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תלחצו הזחל. תרימי אותו בעדינות עם קצה של שן מלקחיים. כמו כן ניתן לתפעל זחל עם מכחול עם נקודה בסדר. הערה: זה חשוב כמו זחלים הם מאוד sensitive לגעת. אם הם לא מטופלים בזהירות, תגובות nociceptive עלולות להשתלט התנהגותם במהלך השניות הראשונות של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הזחלים על ידי השריית אותם בקצרה במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהניח את הזחל על הערוץ לחתוך, השתמש קצה חוד המלקחיים כדי להקניט את הזחל בעדינות לתוך חורשת הערוץ. הערה: עבור מרבית יישומי הרוחב של הזחל ואת הרוחב של הערוץ צריך להתאים. רוחבו הממוצע של הזחלים בשלבים שונים של פיתוח כדלקמן: 0 hr posthatch - 140 מיקרומטר, 24 שעות posthatch - 180 מיקרומטר, 48 שעות posthatch - 320 מיקרומטר, 72 שעות posthatch - 500 מיקרומטר, 96 שעות posthatch - 750 מיקרומטר 8. ערוצים לבוא הרוחביים הבא: 100, 150, 200, 250, ו -300 מיקרומטר, וכל הערוצים 150 מיקרומטר עמוקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמשו בקצה שן מלקחיים או מכחול כדי להתאים את המיקום של הזחל בתוך הערוץ. זה יכול להיות מכוון בכל כיוון: גחוןעד, גחון למטה, גחון לצד אחד, בהתאם למבנה מה הוא להיות צלם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להעיף את הערוץ בעדינות על כך הזחל הוא עכשיו על הזכוכית המכסה. מקום אחד או שתי טיפות מים בקצות הערוץ כך שהוא מתמלא מים (2D איור). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם בעדינות את צידי התעלה כדי להסיר בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את הכיוון של הזחל. לשם כך, בעדינות דחיפה בערוץ אבל לא כוס הכיסוי לגלגל את הזחל. אם זה לא משנה את הכיוון, להסיר את מכסה הזכוכית ולשנות את מיקום זחל. הזחל הוא מוכן להיות צלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת הערוץ / coverslip על מיקרוסקופ הפוכה. אם הדמיה על מיקרוסקופ זקוף, פשוט להפוך את הערוץ / coverslip. </li></ol></li></ol> 4. מאפיין מדוד ענייני הקלטת התנהגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מבנה של עניין (למשל, זנב, CNS), למדוד תכונה של עניין (למשל, עוצמת הקרינה, מיקום) לאורך זמן. הערה: מבנים כגון הראש והזנב ניתן להוסיף הערות באופן ידני. לדוגמא, הראש ניתן לזהות כמכיל פי ווים כהים בצורת H, ואת הזנב ניתן לזהות כמכיל spiricles קנה נשימה האחורית. מאמר זה מתמקד חוט העצב. השתמש elav-GAL4 קו GAL4 העצבית לנהוג transgene כטב&quot;מ-MYR-GFP (elav&gt; GFP) 9,10 כדי fluorescently לתייג את מערכת העצבים המרכזית (CNS). מערכת העצבים המרכזית כוללת שתי האונות במוח הקדמי מחובר חוט העצב, אשר משתרע על האחורי (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את עוצמת פיקסל של חוט העצב (f (NC)) בכל נקודת זמן (t). להלן מתאר גישת ביאור ידנית, אך צעד זה יכול להיות אוטומטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפיג&#39;י (או תוכנה דומה) בתפריט &#39;לנתח&#39; להשתמש &quot;מדידות הגדר ...&quot; תיבת דו שיח לדווח הערך אפור מרושע slicעמדת דואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידני לצייר תיבה במרכז חוט העצב בפריים הראשון של הסרט (איור 3). צעד זה יכול גם להיות אוטומטי עם אלגוריתמי פילוח תמונה ורישום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפקודה &quot;מדוד&quot; בתפריט &#39;לנתח&#39; לדווח על עוצמת פיקסל הממוצע באזור עניין התאגרף. זה מייצר חלון &quot;תוצאות&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפריים הבא, באופן ידני למקם את התיבה בלי שינוי גודל על ידי שימוש במקשי החיצים. השתמש בפקודה &quot;מדוד&quot; שוב. התוצאות מתעדכנות יוצגו בחלון &quot;תוצאות&quot;. חזור על שלב זה עבור כל מסגרת של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את &quot;תוצאות&quot; באמצעות &quot;שמירה בשם ...&quot; הפקודה מתוך תפריט קובץ. התוצאות תיוצאנה כקובץ .xls. </li></ol></li></ol> 5. ניתוח המדידות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נרמל כל f (NC) ערך לערך בין 0 ל -1 (z (t) &lt;/ Em&gt;). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגיליון אלקטרוני (או תוכנה אחרת), לפתוח את קובץ Results.xls. קובץ זה יהיה שני עמודים מייצגים מספר מסגרת ועוצמת קרינה ממוצעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך עמודה חדשה ולהשתמש בנוסחה z (t) = f (NC [t]) -min (f [NC]) / מקס (f [NC]) -min (f [NC]) כדי ליצור ערך הקרינה מנורמל מתאים בכל נקודת זמן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את תקופת צעד עבור כל פסיעה בהקלטה. הערה: מחזור פסיעה הוא יחיד של תנועה בגוף כולו חוזרת עבור קדימה (הפוך) זוחל. לפי אמנה, ומתחיל לצעוד קדימה (ומסתיים) עם התנועה קדימה של הזנב, הראש, ואיברים פנימיים אחרים כגון במעיים או CNS 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידני לבדוק את ההקלטה התנהגותי ולהקליט את פעמי החניכה (i) של כל פסיעה (i (מחזור סטרייד [n])). הערה: בדוגמא הבאה, תנועה קדימהשל מערכת העצבים המרכזית כמו תחילתו של מחזור צעד שימש (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל פסיעה לחשב את התקופה: Δ t (מחזור סטרייד) = i (מחזור סטרייד [n + 1]) -i (מחזור סטרייד [n]). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב אחוז מחזור צעד שחלף עבור כל נקודת זמן של ההקלטה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן עמודה נוספת של קובץ הגיליון האלקטרוני מייצג הזמן שחלף מאז תחילת מחזור פסיעה (ג). זמן הגדר מאז התחלת לצעוד יתאפסו על תחילתו של כל פסיעה (ג (מחזור סטרייד [n]) = 0). התאם פעמים לאחר תחילת בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן עמודה נוספת של קובץ הגיליון האלקטרוני המייצג שחלף מחזור צעד אחוז (מחזור צעד%) מחלקי פעמים המתואם לפי תקופת צעד ולהתרבות על ידי 100 להמיר אחוז מחזור הפסיעה שעברה:. מחזור צעד% = (ג (מחזור סטרייד [n] )) / (Δ t (מחזור סטרייד) * 100). </li></ol></li></ol> 6. צור פולאר תאם מגרשים לייצג דינמיקה של מבנים של ריבית לאורך מחזור סריקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב MATLAB, השתמש דיאלוג &#39;יבוא הנתונים&#39; בכרטיסיית הבית כדי לייבא את Results.xls המעודכנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור מערך חדש &quot;תטא&quot; ערכי מחזור צעד המכיל אחוז (מחזור צעד%). ( &quot;תטא = var1&quot; איפה var1 מייצג מחזור צעד%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור מערך חדש &quot;רו&quot; מכיל ערכי קרינה מנורמלים (z (t)). ( &quot;רו = גרסה 2&quot; איפה גרסה 2 מייצג z (t)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפקודת &#39;polarplot&#39; לחרוש מזימות לתאם קוטביות עם מחזור צעד האחוזים כמו הזווית, ואת הקרינה כמו הרדיוס ( &quot;polarplot (תטא, Rho)&quot;). </li></ol>

<ol>
	<li>Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Drosophila+larval+crawling+at+the+level+of+organism,+segment,+and+somatic+body+wall+musculature.">Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature.</a> J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).</li><li>Marder, E., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+rhythmic+motor+pattern+generation.">Principles of rhythmic motor pattern generation.</a> Physiol rev. 76 (3), 687 (1996).</li><li>Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+control+of+swimming+behavior:+Comparison+of+vertebrate+and+invertebrate+model+systems.">Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems.</a> Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).</li><li>Ohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multilevel+multimodal+circuit+enhances+action+selection+in+Drosophila.">A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila.</a> Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).</li><li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Drosophila+motoneurons:+specification+and+morphology.">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).</li><li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-Skipped(+)+Interneurons+Are+Core+Components+of+a+Sensorimotor+Circuit+that+Maintains+Left-Right+Symmetric+Muscle+Contraction+Amplitude.">Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude.</a> Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).</li><li>Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+patterns+of+inter-and+intraspecific+variation+in+the+behaviour+of+Drosophila+larvae.">Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae.</a> Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).</li><li>Graf, S. A., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rover/Sitter+Drosophila+melanogaster+Larval+Foraging+Polymorphism+as+a+Function+of+Larval+Development,+Food-Patch+Quality,+and+Starvation.">Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation.</a> J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Rebay, I., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yan+Functions+as+a+General+Inhibitor+of+Differentiation+and+Is+Negatively+Regulated+by+Activation+of+the+Rasl+/+MAPK+Pathway.">Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway.</a> Cell. 81 (6), 857-866 (1995).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Tufte, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The visual display of quantitative information. , (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

מכשיר microfluidic נבנה כדי להפוך את ערוצי agarose ליניארי שיכול להכיל זחלים תסיסנית (איור 1). כאשר זחלים תסיסנית ממוקמים ערוצי agarose הליניאריות האלה הרפרטואר ההתנהגותי שלהם מוגבל זחילה, המאפשרת תצפית מפורטת של הדינמיקה של מבנים הזחל על פני מחזור הזחילה. הקלטה מוצלחת מתרחשת כאשר זחל לבצע שורה של צעדים קצובים (איור 3). אם זה לא קורה, לבדוק מכשולים כמו בועת אוויר בערוץ, ולבדוק את בריאותו של הזחל. אלמנט חשוב נוסף של הקלטה מוצלחת הוא כי הזחל מכוון בצורה אופטימלית לדמיין מבנים של עניין. אם הזחל הוא לא בכיוון הנכון, או אם הזחל זוחל מתוך התעלה, פשוט להסיר את coverslip ולעלות הזחל. מניסיוננו, ~ 20% של זחלים בתחילה רכובים קלטות התנהגותית מעולות תשואת withouהתאמת t. בעבר, מדידות נלקחו עמדת מבנים הזחל כגון קרס בפה, מעיים, ואת קטעי בטן במהלך סריקת התנהגות. כדי להמחיש את התנועה של מבנים אלה על פני מחזור צעד הזחילה, מגרש לתאם קוטב נוצרו. במאמר זה, את עוצמת הקרינה של חוט העצב נמדדה ומגרשים לתאם קוטב להשתמש כדי להמחיש את הדינמיקה של קרינה לאורך מחזור הצעד הזוחל (איור 4). ישנם מספר יתרונות המייצגים את הנתונים על מגרשים לתאם קוטב: זה מבטל מהירות זחילה כמשתנה, זה יכול לסכם נתונים מבעלי חיים רבים וצועד רב, וזה מאפשר הדמית שתי מגמות הכוללות וריאצית נתונים 11. יש לציין, אפשר למדוד את הדינמיקה של כל מבנה fluorescently שכותרתו עניין. באופן עקרוני, ניתוח זה הוא ישים מעקב כל סוג של שינויים דינמיים המתרחש במהלך מחזור זחילה. </p&gt; יש מגוון רחב של יישומים עבור השיטות המתוארות במאמר זה. בעבר, ערוצי agarose ליניארי שמשו להקליט התנהגות זחל על האורגניזם כולו, מגזר שרירים בודדים רמות 1. נתונים אלה מראים כי זחלים משתמשים במנגנון &quot;הקרבי-pistoning&quot; הוא קדימה הפוך זחילה, והם הניחו מנגנון תוקפת מניע גם קדימה לאחור בזחילה שייקבע 1. בעתיד, חוקרים יכולים להשתמש בערוצים ללמוד זחילת רקע גנטי שונה. בנוסף, זה צריך להיות אפשרי להשתמש בערוצים לנתח את הפעילות של נוירונים זחל באמצעות הדמית סידן במהלך סריקה. זה אמור להוביל להבנה של אשר עצב משגר בשלב בתנועות מסוימות של מחזור הזחילה. לבסוף, אין שום סיבה שערוצים חייבים לבצע את העיצוב ליניארי מוצג במאמר זה; באמצעות ערוצים עם ממדים שונים ספק לא יעזור לענות variety של שאלה לגבי תנועת זחל תסיסנית ושליטה מוטורית בכללותה.

המטרה הכללית של שיטה זו היא ללמוד זחילת זחל תסיסנית בפירוט. ניסויים על תנועה שחקו תפקיד חשוב בפיתוח ובדיקת תאוריות על שליטה מוטורית 2. באופן מסורתי תנועת נחקרת בעלי חיים ימיים (למשל, עלוקה, צמד, ראשן) 3. האופי החוזר והנשנה של תנועה אצל בעלי חיים אלה אפשר לחקר rhythmogenesis, לניתוח של אירועי biophysical נהיגת תנועה, ולצורך מעקב את דפוסי הירי העצביים שמלווים תנועה. שימוש זחלים תסיסנית ללימודים של תנועה מציג שילוב ייחודי של יתרונות על פני מערכות מודל אחרות: גנטיקה קלילה, פיתוח היטב מאופיין, גוף ברור אופטי ב instars הראשון והשני, וכן שחזור מיקרוסקופי אלקטרוני שידור מתמשכים של כל מערכת העצבים 4-6. עם זאת, זחל תסיסנית לוקותנועה על משטחים שטוחים פתוחים מעט מורכבת כולל הפסקות, מסתובבת, המתפתל זוחל 7. פרסום זה מציג שיטה להשתמש בערוצי agarose ליניארי להנחות התנהגות של תנועת זחל תסיסנית כך זחלים מבצעים מתמשכים, ישר, התנהגות סריקה קצבית. לימוד התנהגות זחל תסיסנית בערוצי agarose, במקום התנהגות על משטחים פתוחים שטוחים, יש מספר יתרונות. ראשית, הוא מאפשר לחוקרים לבחור זוחל התנהגות במיוחד מתנועות רבות שהן חלק מהרפרטואר ההתנהגותי הזחל. שנית, על ידי התאמת הרוחב של הערוץ אל מול גודל גוף הזחל, מהירות זחילה יכולה להיות מותאמת. שלישית, ערוצי לאפשר הזחל כדי שיוצג מן הגב, הגחון, או צד לרוחב תלוי איך הזחל טעון אוריינטציה בתוך הערוץ. רבגוניות זו באורינטצית זחל מאפשרת לכל מבנה העניין להיות גלוי ללא הרף במהלך סריקה. רביעי,ערוצים ניתנים לשימוש עם מגוון רחב של מיקרוסקופים ויעדים. לדוגמא, ניתן להשתמש בערוצים ליניארית הדמיה ברזולוציה נמוכה על stereoscopes שדה בהיר ו / או הדמיה ברזולוציה גבוהה על מיקרוסקופי confocal-דיסק מסתובב 1. החמישית, בשיטה זו ניתן להשתמש בשילוב עם optogenetic / מניפולציות עצביות thermogenetic בכל רקע גנטי. לבסוף, כי הן גוף הזחל (ב instars הראשון והשני) וערוצי agarose ברורים אופטי, ערוצים ניתן להשתמש כאשר לומדים את התנועות הדינמיות, או שינויים בעוצמת פלורסנט מבנים הזחל שכותרתו ידי בדיקות ניאון גנטית בקידוד. השיטה המתוארת היא מתאימה ללימודי קינמטיקה מפורטים של instar הראשון ושני התנהגות תסיסנית זחל. פרסום זה מנתח את השינויים הדינמיים עוצמת פלורסנט של מערכת העצבים המרכזית במהלך זחילה הזחל קדימה כדי להדגים את השימוש של ערוצים כמבשר neuהדמית סידן רונאל.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="643">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">6 oz square Drosophila bottle</td>
			<td style="width:101px;">Scimart</td>
			<td style="width:119px;">DR-103</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">agar</td>
			<td style="width:101px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">sucrose</td>
			<td style="width:101px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">apple juice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>not from concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Tegosept</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T2300</td>
			<td>methyl-p-hydroxybenzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">35 x 10 mm round petri dish</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td align="right">351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">baker&#39;s yeast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">PDMS casting mold</td>
			<td style="width:101px;">FlowJem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>can be requested from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A417-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">laboratory wipes</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">06-666-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">canned air</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">18-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:101px;">BioPioneer</td>
			<td style="width:119px;">GS82-1473-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">agarose</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-444-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">razor blade</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">forceps</td>
			<td style="width:101px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11241-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">22 x 40 cover glass, #1.5</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-365-605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Fiji (version 1.51d)</td>
			<td style="width:101px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Excel 2016</td>
			<td style="width:101px;">Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>www.microsoftstore.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">MATLAB R2016</td>
			<td style="width:101px;">Mathworks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.mathworks.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using linear agarose channels to study drosophila larval crawling behavior

זחילה הזחל תסיסנית מתגלה כמודל רב עוצמה כדי לחקור את השליטה העצבית של התנהגות הסנסורית. עם זאת, התנהגות סריקה זחל על משטחים שטוחים פתוחים היא מורכבת, כולל: נעצר, מסתובב, ואת המתפתל. מורכבות זו ברפרטואר של התנועה מעכבת ניתוח מפורט של האירועים המתרחשים במהלך מחזור צעד לזחול יחיד. כדי להתגבר על מכשול זה, ערוצי agarose ליניארי נעשו מגבילי התנהגות זחל ישר, מתמשך, זחילה קצבית. באופן עקרוני, כי ערוצי agarose ואת גוף זחל תסיסנית הם ברורים אופטי, התנועה של מבנים הזחל שכותרתו ידי בדיקות ניאון-מקודדים גנטיים ניתן לנטר ללא פגע, זחלים-לנוע בחופשיות. בעבר, הזחלים הונחו ערוצים ליניאריים וזחילה ברמת האורגניזם השלם, לפלח שריר נותחו 1. בעתיד, זחלי זחילה בתעלות יכולים לשמש הדמית סידן לפקח נוירופעילות סופית. יתר על כן, שיטות אלה יכולים לשמש עם זחלים של כל גנוטיפ ועם כל ערוץ מעוצב חוקר. כך הפרוטוקול המובא להלן הוא ישים נרחבת ללימודים באמצעות זחל תסיסנית כמודל להבין שליטה מוטורית.

מאמר זה מתאר שיטת מנחת התנהגות זחל תסיסנית באמצעות ערוצי agarose ו למדידת הדינמיקה של מבנים הזחל על פני מחזור זחילה. זחלי ערוצים ליניאריים לבצע התקפים מתמשכים של זחילה קצבית (איור 3). מכיוון שגם זחלים וערוצי ברורים אופטיים, ניתן להשתמש בערוצים עם זחלים להביע בדיקות ניאון מבוטאות בכל מבנה של עניין. הקלטנו הזחלים להביע GFP בכל נוירונים (elav-Gal4 / +; כטב&quot;מ-MYR-GFP / +) וליווה את השינויים הדינמיים עוצמת הקרינה ב חוט העצב על פני מחזור זחילה. אנו מראים כי CNS נע קדימה בערך באותו הזמן כמו ראש וזנב זחל (איור 4 א-ב). כגל של התכווצות שרירים עובר לאורך ציר הגוף, מערכת העצבים המרכזית נעה פנימה והחוצה של המטוס של המוקד גורמת הקרינה של חוט העצב לשנות (איור 4). כדי לכמת צ&#39;אן<html> GES בעוצמת הקרינה חוט העצב במשך כמה צעדים בחיות כמה ייצגנו את הנתונים על מגרש לתאם קוטבי (איור 4C). התוויית הנתונים על לתאם מגרשי קוטב מראה כי הדינמיקה של קרינת חוט עצב על פני מחזור הצעד כדלקמן דפוס לשחזור. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54892/54892fig1.jpg" /> איור 1: עיצוב של ערוצים ליניאריים מדריך התנהגות תסיסנית הזחל זחילה (א) העיצוב של המכשיר microfluidic המשמש לייצור ערוצי agarose ליניארי מוצג.. הרוחבי של ערוצים שבמכשיר זה נע בין 100-300 מיקרומטר במרווחים של 50 מיקרומטר. העומק הוא 150 מיקרומטר. (ב) הזחל תסיסנית הוא נטען לתוך ערוץ agarose. מבט הגבה מוצג עם קדמי (ראש) לימין. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר.4892 / 54892fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54892/54892fig2.jpg" /> איור 2:. תרשים סכמטי המתאר כיצד טען זחל לתוך ערוץ ראה סעיף פרוטוקול 3 לפרטים <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54892/54892fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54892/54892fig3.jpg" /> איור 3:. זחל תסיסנית שכותרתו fluorescently מניב ביצועים מתמשכים, אומנותי, ליניארי זחילה כאשר הניח לתוך ערוץ Agarose בצד השמאל, סכמטית של זחל להביע GFP בכל נוירונים (elav&gt; GFP) מוצג. תיבה מציגה את האזור שבו עוצמת קרינה של חוט העצב (מזוהה לפימורפולוגיה מוארכת) ניתן למדוד. בשעה הנכונה הוא דוגמא של זחל זוחל דרך ערוץ באחד מרווחים שניים. מבט הגבה מוצג עם עד קדמי. החצים מצביעים על התחלת לצעוד. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54892/54892fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54892/54892fig4.jpg" /> איור 4: דינמיקה של שינויי קרינת החוט עצב במהלך מחזור הסריקה מוצגת על פולאר תאם מגרשים (א) תרשים של בפסיעה אחת.. אחוזים מתייחסים אחוז מחזור הצעד הושלם. באמצעות תנועות כנס קדימה של הזנב, הראש, ואיברים פנימיים כגון CNS מסמן את תחילתו של צעד (או 0% מכלל מחזור פסיעה). ראוי לציין, כי מערכת העצבים המרכזית (לבן) נע קדימה ואחורה, כמו גם למעלה ולמטה. צד view מוצג עם הקדמי בצד ימין. (ב) רשם גלים מראים את תנועת הראש, הזנב, ואת מערכת העצבים המרכזית. ראוי לציין, כי עוצמת הקרינה של החוט העצב במהלך מחזור הצעד הוא דינמית. (ג) לתאם קוטב עלילה מציגה את השינויים הדינמיים עוצם קרינה מנורמלת של חוט העצב על פני מחזור הפסיעה. כל נקודה מייצגת עוצמת קרינה מנורמלת של זחל אחד בנקודת זמן אחת (n = 3 זחלים, 3 צעדים כל אחד). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54892/54892fig4large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior at JoVE.com

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

הזחל תסיסנית היא מערכת מודל רב עוצמה כדי לחקור את השליטה העצבית של התנהגות. פרסום זה מתאר את השימוש של ערוצי agarose ליניארי לעורר התקפים מתמשכים של זחילה ושיטות ליניארי לכמת את הדינמיקה של מבנים הזחל במהלך התנהגות זחילה חוזרת.

שימוש בערוצי Agarose לינארית ללמוד<em&gt; תסיסנית</em&gt; התנהגות זחל זחילה

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

using-linear-agarose-channels-to-study-drosophila-larval-crawling

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

7.3K Views.  University of Chicago.  הזחל תסיסנית היא מערכת מודל רב עוצמה כדי לחקור את השליטה העצבית של התנהגות. פרסום זה מתאר את השימוש של ערוצי agarose ליניארי לעורר התקפים מתמשכים של זחילה ושיטות ליניארי לכמת את הדינמיקה של מבנים הזחל במהלך התנהגות זחילה חוזרת. 

Video: Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Sensillum הקלטות סינגל חרקים תסיסנית melanogaster ו אנופלס gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

ויזואליזציה של עצבים המגזרי הזחל ב 3 Rd Instar תסיסנית הכנות הזחל

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

שיטות Assay תסיסנית התנהגות

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

נתיחה ואימונוהיסטוכימיה של זחל, גלמים ומבוגרים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רשתיות

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

יחיד לטוס Assay עבור התנהגות שיחור מזון ב<em&gt; דרוזופילה</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their worlds when trying to understand their behavior and ecology. Sensitivity to the ultraviolet spectrum (UV; 300 - 400 nm) is found across multiple genera of birds, fish, reptiles, amphibians, and even mammals. This protocol describes a technique for examining organisms for the presence of UV-reflecting structures and a method for testing whether these cues are used as social signals in the context of mate choice. A spectrophotometer is used to detect the presence of UV reflectance and variation in reflective intensity between individuals and sexes. An example of this technique is presented in which a dichotomous mate choice test exposes sexually receptive individuals to opposite sex individuals whose visual appearance can be manipulated by filters that either transmit full spectrum or block UV wavelengths. This system allowed for the determination that female, but not male, sailfin mollies (Poecilia latipinna) were using UV markings as part of their mating decisions. These types of studies serve to expand our knowledge of the range of organisms that utilize UV and provide insight into how UV plays a role in their lives.

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

This protocol outlines the use of spectrophotometry to detect ultraviolet-reflecting structures on organisms (in this example, the sailfin molly Poecilia latipinna) and describes dichotomous choice tests for fish that allow inferences to be made on the role of ultraviolet cues during mate selection.

מבחנים כדי זיהוי מבנים המשקף-UV ו לקבוע וחשיבותם העדפות Mate באמצעות מולי המפרש<em&gt; Poecilia latipinna</em

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

דרך פשוטה למדוד שינויים בהתנהגות שוחרת זכה שימוש<em&gt; תסיסנית</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...