We thank the staff of the Second Core Lab, Department of Medical Research, National Taiwan University Hospital for their technical support.

כל הנהלים המיושמים במחקר זה עולה בקנה אחד עם האגודה לחקר משפט חזון עיניים עבור שימוש בבעלי חי עיניים וחזון המחקר אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש בבית החולים האוניברסיטאי הלאומיים בטייוואן. 1. ניתוק, הכנת התרבות ראשית ולאחר Immunostaining של השור CECs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת עיני שור טריות מטבחיים מקומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את העיניים בתוך 10% w / v פתרון povidone יוד במשך 3 דקות. לשטוף אותם עם תמיסת מלח פוספט שנאגר (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר את הכפתור הקרני עם אזמל ומספריים בתנאים סטריליים. מקלף את הממברנה של Descemet עם מלקחיים תחת מיקרוסקופ לנתח (לציין כי במחקר זה, בעיני השור היו enucleated ידי מטבחיים מקומי, ולכן הליך המחקר הראשון היה חיטוי בעיני preenucleated במעבדה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה של Descemet ב 1 מ&quot;ל של לנסותpsin על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אסוף את CECs שור על ידי צנטריפוגה ב 112 XG במשך 5 דקות. Resuspend תאי 1 מיליליטר של מדיום אפיתל הורמונלי השלים (שם) המכיל כמויות שווות של מדיום הנשר HEPES שנאגר השונה של Dulbecco והבינוני F12 של חם, בתוספת 5% בסרום שור עוברי, sulfoxide דימתיל 0.5%, 2 ng / ml של אפידרמיס אדם גורם הגדילה, 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של אינסולין, 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של transferrin, 5 ng / ml של סלניום, 1 nmol / L של רעלן הכולרה, 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של גנטמיצין, ו -1.25 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של B. amphotericin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים תאים (כ 1 x 10 5 תאים לכל עין) לתוך צלחת 6 ס&quot;מ. תרבות אותם שם. דגירת הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס אווירה של 5% CO 2 באוויר. שינוי התרבות בינוני כל 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים מגיעים למפגש, לשטוף אותם PBS דגירה אותם ב 1 מ&quot;ל של טריפסין על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. אסוף אותם על ידי צנטריפוגה ב 112 XG במשך 5 דקות. Re- להשעות את התא גלולה ב 1 מ&quot;ל של שם טוב. <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים ב hemocytometer. זרעים התאים בשקופיות כיסוי בצפיפות של 1 x 10 4 לכל היטב צלחת 24 גם, והתרבות התאים שם טוב. על חקירת השפעת EnMT-הדיכוי של marimastat, דגירת התאים שם טוב עם 10 מיקרומטר של marimastat הוסיפו לתוך מדיום התרבות, ולשנות את מדיום התרבות כל 3 ימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים בנקודת זמן מצוינת עם 250 μl של paraformaldehyde 4%, pH 7.4, למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. Permeabilize עם 250 μl של 0.5% Triton X-100 במשך 5 דקות. חסום עם אלבומין בסרום שור 10% למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התאים עם נוגדנים ראשוניים נגד-קטנין ביתא הפעיל (ABC), חילזון, חילזון הלילה ב 4 ° C.. הדילול של הנוגדנים העיקריים בשימוש הוא 1: 200. הנוגדנים הם מדולל diluent נוגדן מורכב של 10 מ&quot;מ PBS, 1% w / v אלבומין בסרום שור, ו 0.09% w / v אזיד הנתרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים פעמיים עם PBS במשך 15 דקות, דגירהמ &#39;עם נוגדנים משני מצומדות פלואוריד אלקסה (1: 100 ב diluent נוגדן) בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain בגרעין התא על ידי כיסוי התאים עם 2 מיקרוגרם / מיליליטר של 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole, לשטוף את התאים פעמים עם PBS במשך 15 דקות, ו הר איתם נגד דהיית פתרון גובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג תמונות immunofluorescent על אורכי גל עירור של 405 ו 488 ננומטר באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר עם 20X ההגדלה אובייקטיבי. </li></ol> 2. מודל עכברוש קרנית האנדותל Cryoinjury הזרקת Intracameral <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים 12 שבועות בן חולדות Sprague-Dawley זכר עם זריקה תוך שרירית של 2% xylazine (5.6 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו tiletamine בתוספת zolazepam (18 מ&quot;ג / ק&quot;ג). בעדינות לצבוט את העור של החיות כדי לאשר הרדמה תקינה בהעדר מתעוות עור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחדיר טיפה אחת של hydrochloride proparacaine 0.5% אל עינו הימנית של כל העכברים כדי למזער את הכאב העין ואת רפלקס מצמוץ. לְהַחדִירמשחת טטרציקלין לעין השמאל כדי למנוע יובש קרני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגניב בדיקת נירוסטה (קוטר = 3 מ&quot;מ) בחנקן נוזלי. החלת את חללית הנירוסטה אל הקרנית המרכזית של עין ימין למשך 30 שניות. לעתים קרובות להנחיל PBS על עינו הימנית במהלך ההליך כדי למנוע יובש קרני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחדיר 0.1% אטרופין סולפט גנטמיצין 0.3% מייד לאחר cryoinjury ופעם יומי כדי להקל על כאב עיני נובע התכווצות ריסים ולמנוע זיהום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההליך, לשמור על החולדות לחמם באמצעות מנורת חום, ולבחון החלים כל 15 דקות אחרי ההרדמה עד שהם להחזיר שליטה מוטורית. בנוסף, החל משח טטרציקלין לעין הזכות למנוע יובש קרני במהלך תקופת ההחלמה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על cryoinjury הקרנית במשך 3 ימים רצופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אספקת marimastat או bFGF לתוך החדר הקדמי של עיני החולדה, להרדים החולדות כפי שתואר לעיל. להחדיר טיפה אחתשל hydrochloride proparacaine 0.5% אל תוך עינו הימנית כדי למזער את כאב עין ואת רפלקס המצמוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשקות את פני השטח של העין עם PBS סטרילית. בצע ניקור הלשכה הקדמית תחת מיקרוסקופ ההפעלה על ידי החדרת מחט 30 G מצורף מזרק 1 מ&quot;ל על הקרנית ברור paralimbal במטוס מעל ובמקביל הקשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובבו את המחט שפוע למעלה, ומעט לדכא את הפצע בקרנית לנקז קצת הומור מימית ולהפחית את הלחץ התוך עיני. להזריק 0.02 מ&quot;ל של התרופה intracamerally. בעדינות לדחוס את דרכי מחט עם קצה כותנה בזמן נסיגת המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם את שלהוציא בנקודת זמן מצוינת מתחת למיקרוסקופ ההפעלה. </li></ol> 3. קצירי העכברוש קרני לחצן ו Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להרדים את החולדות, למקם אותם בתא המתת חסד להשרות 100% CO 2 בקצב מילוי של 10-30% מנפח התא לדקה. שמור עירוי CO 2 עבורדקה נוספת אחרי חוסר נשימת צבע עיניים דהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדור לעין עכברוש בבית לימבוס עם להב חד. חותך את הקרניות במספריים קרניים לאורך לימבוס. שטח את הקרניות בשקופית. ודא חתכים רדיאליים נוספים אם הקרניות להתכרבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את קרניות עם 250 μl של paraformaldehyde 4%, pH 7.4, למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. Permeabilize עם 250 μl של 0.5% Triton X-100 במשך 5 דקות, ולחסום עם אלבומין בסרום שור 10% למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה קרנית עם נוגדנים ראשוניים נגד ABC הלילה ב 4 ° C עם דילול של 1: 200 ב diluent נוגדן. שטפו את קרניות פעמיים עם PBS במשך 15 דקות, דגירה אותם עם נוגדנים משני (1: 100 ב diluent נוגדן) בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. Counterstain בגרעין התא על ידי כיסוי תאים עם 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הקרני בתמיסה נגד דהייה גוברת. אובטיין התמונות immunofluorescent באורכי גל עירור של 405 ו 561 ננומטר באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר ב 20X ההגדלה אובייקטיבי. </li></ol>

<ol>
	<li>Maurice, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+location+of+the+fluid+pump+in+the+cornea.">The location of the fluid pump in the cornea.</a> J Physiol. 221 (1), 43-54 (1972).</li><li>Joyce, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+capacity+of+the+corneal+endothelium.">Proliferative capacity of the corneal endothelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (3), 359-389 (2003).</li><li>Morishige, N., Sonoda, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bullous+keratopathy+as+a+progressive+disease:+evidence+from+clinical+and+laboratory+imaging+studies.">Bullous keratopathy as a progressive disease: evidence from clinical and laboratory imaging studies.</a> Cornea. 32, 77-83 (2013).</li><li>Bates, A. K., Cheng, H., Hiorns, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudophakic+bullous+keratopathy:+relationship+with+endothelial+cell+density+and+use+of+a+predictive+cell+loss+model.+A+preliminary+report.">Pseudophakic bullous keratopathy: relationship with endothelial cell density and use of a predictive cell loss model. A preliminary report.</a> Curr Eye Res. 5 (5), 363-366 (1986).</li><li>Wilson, S. E., Lloyd, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+and+its+receptor,+basic+fibroblast+growth+factor,+transforming+growth+factor+beta-1,+and+interleukin-1+alpha+messenger+RNA+production+in+human+corneal+endothelial+cells.">Epidermal growth factor and its receptor, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor beta-1, and interleukin-1 alpha messenger RNA production in human corneal endothelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 32 (10), 2747-2756 (1991).</li><li>Chen, K. H., Harris, D. L., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta2+in+aqueous+humor+suppresses+S-phase+entry+in+cultured+corneal+endothelial+cells.">TGF-beta2 in aqueous humor suppresses S-phase entry in cultured corneal endothelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 40 (11), 2513-2519 (1999).</li><li>Senoo, T., Obara, Y., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EDTA:+a+promoter+of+proliferation+in+human+corneal+endothelium.">EDTA: a promoter of proliferation in human corneal endothelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 2930-2935 (2000).</li><li>Yue, B. Y., Sugar, J., Gilboy, J. E., Elvart, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+human+corneal+endothelial+cells+in+culture.">Growth of human corneal endothelial cells in culture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (2), 248-253 (1989).</li><li>Peh, G. S., Beuerman, R. W., Colman, A., Tan, D. T., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+endothelial+cell+expansion+for+corneal+endothelium+transplantation:+an+overview.">Human corneal endothelial cell expansion for corneal endothelium transplantation: an overview.</a> Transplantation. 91 (8), 811-819 (2011).</li><li>Zhu, C., Rawe, I., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+protein+expression+in+human+corneal+endothelial+cells+cultured+from+young+and+older+donors.">Differential protein expression in human corneal endothelial cells cultured from young and older donors.</a> Mol Vis. 14, 1805-1814 (2008).</li><li>Ko, M. K., Kay, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+role+of+FGF-2+on+type+I+collagen+expression+during+endothelial+mesenchymal+transformation.">Regulatory role of FGF-2 on type I collagen expression during endothelial mesenchymal transformation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4495-4503 (2005).</li><li>Lee, H. T., Kay, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-2+induced+reorganization+and+disruption+of+actin+cytoskeleton+through+PI+3-kinase,+Rho,+and+Cdc42+in+corneal+endothelial+cells.">FGF-2 induced reorganization and disruption of actin cytoskeleton through PI 3-kinase, Rho, and Cdc42 in corneal endothelial cells.</a> Mol Vis. 9, 624-634 (2003).</li><li>Pipparelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+Inhibitor+Enhances+Adhesion+and+Wound+Healing+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells.">ROCK Inhibitor Enhances Adhesion and Wound Healing of Human Corneal Endothelial Cells.</a> PloS one. 8 (4), e62095 (2013).</li><li>Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Theriault, M., Proulx, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+process+of+corneal+endothelial+morphological+change+in+vitro.">Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1228-1237 (2015).</li><li>Jakobiec, F. A., Bhat, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrocorneal+membranes:+a+comparative+immunohistochemical+analysis+of+keratocytic,+endothelial,+and+epithelial+origins.">Retrocorneal membranes: a comparative immunohistochemical analysis of keratocytic, endothelial, and epithelial origins.</a> Am J Ophthalmol. 150 (2), 230-242 (2010).</li><li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+ZEB1+and+Snail1+in+excessive+production+of+extracellular+matrix+in+Fuchs+endothelial+corneal+dystrophy.">Involvement of ZEB1 and Snail1 in excessive production of extracellular matrix in Fuchs endothelial corneal dystrophy.</a> Lab Invest. 95 (11), 1291-1304 (2015).</li><li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+on+primate+corneal+endothelial+cell+survival+in+vitro+by+a+ROCK+inhibitor.">Enhancement on primate corneal endothelial cell survival in vitro by a ROCK inhibitor.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3680-3687 (2009).</li><li>Zhu, Y. T., Chen, H. C., Chen, S. Y., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+p120+catenin+unlocks+mitotic+block+of+contact-inhibited+human+corneal+endothelial+monolayers+without+disrupting+adherent+junctions.">Nuclear p120 catenin unlocks mitotic block of contact-inhibited human corneal endothelial monolayers without disrupting adherent junctions.</a> J Cell Sci. 125 (15), 3636-3648 (2012).</li><li>Ho, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Matrix+Metalloproteinase+Activity+Reverses+Corneal+Endothelial-Mesenchymal+Transition.">Inhibition of Matrix Metalloproteinase Activity Reverses Corneal Endothelial-Mesenchymal Transition.</a> Am J Pathol. 185 (8), 2158-2167 (2015).</li><li>Kay, E. D., Cheung, C. C., Jester, J. V., Nimni, M. E., Smith, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+collagen+and+fibronectin+synthesis+by+retrocorneal+fibrous+membrane.">Type I collagen and fibronectin synthesis by retrocorneal fibrous membrane.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 22 (2), 200-212 (1982).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+Signal+Regulates+Corneal+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition.">Notch Signal Regulates Corneal Endothelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Am J Pathol. 183 (3), 786-795 (2013).</li><li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+Inhibitor+Eye+Drop+Accelerates+Corneal+Endothelium+Wound+Healing.">The ROCK Inhibitor Eye Drop Accelerates Corneal Endothelium Wound Healing.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 2493-2502 (2013).</li><li>Mannermaa, E., Vellonen, K. S., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+transport+in+corneal+epithelium+and+blood-retina+barrier:+emerging+role+of+transporters+in+ocular+pharmacokinetics.">Drug transport in corneal epithelium and blood-retina barrier: emerging role of transporters in ocular pharmacokinetics.</a> Adv Drug Deliv Rev. 58 (11), 1136-1163 (2006).</li></ol>

The authors have no competing financial interests to declare.

CECs ידוע נטייתן לעבור EnMT במהלך התפשטות תאים. כדי לפתח אסטרטגיות דיכוי תהליך EnMT למטרות טיפוליות, הבנה מעמיקה של מנגנון EnMT הכרחית. תיארנו 2 דגמים לחקור EnMT, כלומר CEC שור במודל תרבות במבחנה דגם cryoinjury האנדותל עכברוש הקרנית. התוצאות שלנו הוכיחו את תהליך EnMT בשני המודלים. יתר על כן, השפעת מדכאי EnMT של marimastat שוחזרה בשני המודלים, דבר המצביע על כך 2 דגמים אלה לשתף אותו המנגנון. ועדת הבחירות המרכזית שור במודל תרבות במבחנה מציעה הקלות של מניפולציה. בנוסף, בהשוואת CEC האדם או הפרימטים במודלי תרבות במבחנה מועסקות מחקרים קודמים 17,18, עיני שור הם גדולים יותר, קלים יותר לרכוש, ולכן יש יותר CECs זמין. במחקר שלנו, רכשנו את עיני שור enucleated מ מטבחיים מקומי. בגלל fres<html> הטבע h של העיניים שור, את המספר המדויק של CECs שור שנקטפו נתון לשינויים, בערך בשעה 1 x 10 5 תאים לכל עין. לעומת זאת, מספר CECs אדם בתוך קרנית נורמלית הוא כ 3 x 10 5 לכל עין. המספר הזה נמוך ב קרניות כיתת מחקר ואפילו קטן ב חישוקי קרנית הנותרת לאחר השתלה. מניפולציות במהלך הליך הקצירה תהיינה לצמצם עוד יותר את מספר התאים המתקבלים. יתר על כן, CECs שור יכול להתרבות ועוברים EnMT ספונטני; ולכן, ועדת הבחירות המרכזית שור במודל תרבות במבחנה שימושית בחקירת מנגנון EnMT וסינון EnMT-דיכוי כימיקלים, כגון marimastat. למרות יש דאגה לגבי הבדלי מינים הקשורים, כגון יכולת השגשוג של CECs, התוצאות שלנו הראו כי מסלול איתות EnMT של שור CECs דומה לזה של CECs האדם, לרבות הפעלת Wnt / β-קטנין 18,19. אוהל &quot;&gt; במהלך הבידוד של שור CECs, קילוף הקרום של Descemet הוא קריטי. בחלק העיניים שור, הממברנה של Descemet עשויה להיות הדבקה חזקה עם stroma הקרני, מה שמוביל רקמת סטרומה מופרזת על הממברנה של קלופי Descemet. trypsinization נוספת עשויה להוביל שחרור keratocytes סטרומה כי להפוך פיברובלסטים קרני, אשר משפיע טוהר תא ולכן את תוצאות הניסוי. במחקר שלנו, אנו קלופים הממברנה של Descemet בזהירות תחת מיקרוסקופ. כדי להבטיח טוהר תא נוסף, אנחנו ראשוני תרבית התאים שנקטפו 6 צלחת סנטימטר עד מפגש תא. רק כאשר התאים היו משושה בכושר הייתה הם השתמשו בניסויים נוספים. כדי להמשיך לבסס את הממצאים של ועדת הבחירות המרכזית שור במודל תרבות במבחנה, השתמשנו במודל cryoinjury האנדותל העכברוש הקרני אמץ במחקרים קודמים 20,21. לאחר cryoinjury, את CECs העכברוש עבר EnMT במהלך רגנרציה, manifested ידי טרנסלוקציה הגרעין של β-קטנין פעיל, המציין כי הפעלת איתות Wnt / β-קטנין נשמרת בין מינים במהלך רגנרציה CEC. בנוסף, מודל זה שימושי בחקירת הפונקציה של CECs כי פונקצית CEC נמוכה מובילה בצקת בקרנית ברורה. בשילוב עם ציוד אחר, כגון biomicroscope אולטרסאונד, טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית מקטע קדמי, וכן במיקרוסקופ confocal, עובי הקרנית ניתן להעריך כמותית ובכך לשקף פונקציה CEC. כדי לעורר את ההתחדשות של CECs ולדכא EnMT לאחר ריפוי פצע, אנחנו מנוהלים זריקות intracameral של bFGF ואחריו הזרקת marimastat. הטיפול הפחית משמעותית את היקף בצקת בקרנית. מחקרים קודמים השתמשו יישום מקומי של-stimulating agents צמיחה CEC, כגון מעכבי ROCK, וסוכני EnMT-דיכוי, כגון 21,22 מעכב Notch. עם זאת, החדירה של תרופות לתוך CEC שכבהאה היא מוגבלת על ידי אפיתל הקרנית stroma, אשר עשוי להשפיע על יעילות הטיפול 23. בניגוד יישום מקומי, הזרקת intracameral מאפשרת גישה ישירה אל האנדותל הקרני על ידי החדרת תרופות ישירות לתוך החדר הקדמי. לכן, מגרה הצמיחה EnMT-דיכוי השפעת הכימיקלים ניתן להעריך unbiasedly הבא cryoinjury. במחקר שלנו, ביצענו ניקור הלשכה הקדמית כדי להוריד את הלחץ התוך עיני לפני הזריקה intracameral. ללא ניקור, גידול פתאומי בלחץ תוך עיני גורם לבצקת בקרנית או אפילו צניחה של הקשתית דרך מערכת המחט. בעדינות דחיסה בדרך במהלך עזרי נסיגת מחט איטום הפצע ומניעת זיהום תוך עיניים.

Corneal endothelial cells (CECs) play a vital role in maintaining corneal clarity and thus visual acuity by regulating the hydration status of the corneal stroma through active pumping1. Because of the limited proliferative potential of human CECs, the cell number decreases with age, and the repair of corneal endothelial wounds following injury is usually achieved through cell enlargement and migration, rather than cell mitosis2. When the CEC count decreases below a threshold of approximately 500 cells/mm2, the dehydration status of the corneal stroma cannot be maintained, leading to bullous keratopathy and vision impairment3,4.
The limited proliferative potential of human CECs has been attributed to several factors, including reduced expression of the epidermal growth factor and its receptor in aging cells5, antiproliferative TGF&#946;2 in the aqueous humor6, and contact inhibition2,7. Although some growth factors, such as basic fibroblast growth factor (bFGF), can increase proliferation in a cultured human corneal endothelium, the culture efficiency remains limited8,9. Furthermore, CECs may undergo a phenotypic change during ex vivo expansion, resembling epithelial-mesenchymal transition (EMT)10-13. Endothelial-mesenchymal transition (EnMT) is characterized by cell junction destabilization, apical-basal polarity loss, cytoskeletal rearrangement, alpha smooth muscle actin expression, and type I collagen secretion14. All of these characteristics may abrogate the normal function of CECs, hampering the use of ex vivo cultured CECs in tissue engineering. Moreover, EnMT has been associated with the pathogenesis of several corneal endothelial diseases, including Fuchs endothelial corneal dystrophy and retrocorneal membrane formation15,16. Therefore, understanding the mechanism of EnMT may aid in manipulating the EnMT process and facilitate the regeneration of CECs to enable competent function. 
In this study, we described a method for isolating bovine CECs from the corneal button. In the primary culture in vitro, the EnMT process, including a phenotypic change, the nuclear translocation of &#946;-catenin, and EMT regulators snail and slug, was observed. We further described a method for demonstrating EnMT in vivo by using a rat corneal endothelium cryoinjury model. Using these 2 models, we demonstrated that marimastat, a broad-spectrum matrix metalloproteinase (MMP) inhibitor, can suppress the EnMT process. The described protocols facilitate the detailed analysis of the EnMT mechanism and the development of strategies for manipulating the EnMT process for further clinical application.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1447">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">trypsin</td>
			<td style="width:269px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">12604-013</td>
			<td style="width:340px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium and Ham&#39;s F12 medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human epidermal growth factor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">insulin, transferrin, selenium&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cholera toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gentamicin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">amphotericin B</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15290-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>111219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">marimastat</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2699-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-active beta-catenin antibody</td>
			<td>Millpore</td>
			<td>05-665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-snail antibody</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc28199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-slug antibody</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc15391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>for staining of ABC of bovine CECs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11003</td>
			<td>for staining of ABC of rat corneal endothelium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>for staining of snail and slug of bovine CECs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">antibody diluent</td>
			<td>Genemed Biotechnologies</td>
			<td>10-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">laser scanning confocal microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>LSM510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">xylazine&#160;</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tiletamine plus zolazepam</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>N/A</td>
			<td>veterinary drug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">proparacaine hydrochloride ophthalmic solution</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>veterinary drug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1% atropine</td>
			<td>Wu-Fu Laboratories Co., Ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>clinical drug&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.3% gentamicin sulfate</td>
			<td>Sinphar Group</td>
			<td>N/A</td>
			<td>clinical drug&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">basic fibroblast growth factor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td>clinical drug&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo models to study corneal endothelial-mesenchymal transition

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema and diminished visual acuity. However, human CECs are prone to compromised proliferative potential. Furthermore, stimulation of cell growth is often complicated by gradual endothelial-mesenchymal transition (EnMT). Therefore, understanding the mechanism of EnMT is necessary for facilitating the regeneration of CECs with competent function. In this study, we prepared a primary culture of bovine CECs by peeling the CECs with Descemet's membrane from the corneal button and demonstrated that bovine CECs exhibited the EnMT process, including phenotypic change, nuclear translocation of &#946;-catenin, and EMT regulators snail and slug, in the in vitro culture. Furthermore, we used a rat corneal endothelium cryoinjury model to demonstrate the EnMT process in vivo. Collectively, the in vitro primary culture of bovine CECs and in vivo rat corneal endothelium cryoinjury models offers useful platforms for investigating the mechanism of EnMT.

לאחר בידוד של CECs שור, התאים היו בתרבית במבחנה. איור 1 מציג את התמונות בניגוד שלב של CECs שור. צורת המשושה של התאים בנקודת המפגש ציינה כי התאים לא היו מזוהמים על ידי פיברובלסטים סטרומה הקרניים במהלך בידוד תא. איור 2 מתארים את immunostaining כי בוצע באמצעות נוגדנים נגד ABC, חילזון, חילזון בנקודת זמן מצוינת. מלבד שינויים פנוטיפי בתרבות במבחנה, טרנסלוקציה גרעין מקבילה של רגולטורי ABC ו- EMT נצפתה. איור 3 ממחיש את השפעת marimastat, מעכב MMP ספקטרום רחב, על תהליך EnMT של CECs שור במבחנה התרבותית. איור 4 כולל התצלומים שלהוציא של חולדות לאחר cryoinjury ואחריו הזרקה intracameral. איור 5 מראה את immunostaining של r<html> ב כפתור קרני כי בוצע באמצעות נוגדנים נגד ABC לאחר cryoinjury ואחריו הזרקת intracameral. טרנסלוקציה הגרעין של ABC נצפתה בקבוצת PBS ו הוגדל משמעותית בקבוצת bFGF, המציין הפעלה של איתות Wnt / β-קטנין ותהליך EnMT. לאחר הזרקת intracameral של bFGF ואחריו הזרקת marimastat, מכתים הגרעין של ABC פחת, דבר המצביע על אפקט EnMT-העיכוב של marimastat. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54329/54329fig1.jpg" /> איור 1:. בניגוד שלב תמונות של במבחנה CECs שור בתרבית לאחר זורעים על הצלחת התרבות, שור CECs בתחילה הופיע פיברובלסטים דמויי בימים 3 ו -6 הם הפכו משושה יותר בהגיעם מפגש מלא על סרגל קנה מידה יום 9. = 50 מיקרומטר. נציג תמונות של 3 חזרות.4329fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54329/54329fig2.jpg" /> איור 2: Immunostaining של CECs שור בתרבית במבחנה במהלך בתרבות חוץ גופית של שור CECs, טרנסלוקציה הגרעין של ABC, חילזון, חילזון זוהה באמצעות יום 14. ABC:. Β-קטנין פעיל. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. נציג תמונות של 3 חזרות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54329/54329fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54329/54329fig3.jpg" /> איור 3:. Immunostaining של CECs שור במבחנה התרבותית עם או בלי marimastat ברמות מפגש תאים שונות שדי Immunostainingtrated כי ABC, חילזון, חילזון ניכר בגרעין של CECs שור עם או בלי 10 מיקרומטר של marimastat ביום 3. עם זאת, marimastat מופחת המכתים הגרעיני משמעותי של ABC, חילזון, חילזון ביום 9 כאשר CECs שור הפך לחלוטין ומחובר. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. נציג תמונות של 3 חזרות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54329/54329fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54329/54329fig4.jpg" /> איור 4:. תמונות שלהוציא של חולדות בנקודות הזמן המצוין לאחר cryoinjury בעקבות cryoinjury במשך 3 ימים רצופים, חולדות היו נתונים הזרקת intracameral של 0.02 מ&quot;ל של PBS או 50 ng / ml bFGF ביום 3. ביום 6, 0.02 מ&quot;ל של 10 מיקרומטר marimastat הוזרק intracamerally בקבוצת bFGF / מארי, ואילו PBS הוזרק ב grou 2 אחריםנ.ב. (n = 9 בכל קבוצה). תמונות שלהוציא חשף מופחת בצקת בקרנית לאחר הזרקת bFGF, ואילו בצקת בקרנית מופחתת marimastat נוספת לעומת bFGF לבד. N = 9 בכל קבוצה. סרגל קנה מידה = 1 מ&quot;מ. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54329/54329fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54329/54329fig5.jpg" /> איור 5:. Immunostaining כפתורי עכברוש קרני Immunostaining של כפתורים הקרניים העכברוש שנמסקו ביום 9 גילה מכתים גרעיני קטן של ABC בקבוצת PBS. בקבוצת bFGF, היה מכתים גרעיני נרחב של ABC, אשר הופחת משמעותית בקבוצת bFGF / מארי. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54329/54329fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של תי</a>הדמות של.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition at JoVE.com

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

תרבות עיקרית של תאי אנדותל קרניים שור שמשה לחקור את המנגנון של מעבר אנדותל-mesenchymal הקרני. יתר על כן, מודל cryoinjury האנדותל עכברוש הקרני שמש להפגין מעבר אנדותל-mesenchymal קרני in vivo.

במבחנה מודלים Vivo ללמוד קרנית האנדותל-mesenchymal מעבר

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

in-vitro-vivo-models-to-study-corneal-endothelial-mesenchymal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

7.9K Views.  Far Eastern Memorial Hospital.  תרבות עיקרית של תאי אנדותל קרניים שור שמשה לחקור את המנגנון של מעבר אנדותל-mesenchymal הקרני. יתר על כן, מודל cryoinjury האנדותל עכברוש הקרני שמש להפגין מעבר אנדותל-mesenchymal קרני in vivo. 

Video: In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

פיתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay לאבחון תפקוד התכווצות של תאי mesenchymal שעבר אפיתל-mesenchymal מעבר

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

דג זברה בוגרת מודלים פציעה ללמוד את השפעות Prednisolone רגנרציה רקמת העצם

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart disease. When using prosthetic materials however, these grafts are susceptible to bacterial infections and various host responses.
Identification of bacterial and host factors that play a vital role in endovascular adherence of microorganisms is of importance to better understand the pathophysiology of the onset of infections such as infective endocarditis (IE) and to develop preventive strategies. Therefore, the development of competent models to investigate bacterial adhesion under physiological shear conditions is necessary. Here, we describe the use of a newly designed in vitro perfusion chamber based on parallel plates that allows the study of bacterial adherence to different components of graft tissues such as exposed extracellular matrix, endothelial cells and inert areas. This method combined with colony-forming unit (CFU) counting is adequate to evaluate the propensity of graft materials towards bacterial adhesion under flow. Further on, the flow chamber system might be used to investigate the role of blood components in bacterial adhesion under shear conditions. We demonstrated that the source of tissue, their surface morphology and bacterial species specificity are not the major determining factors in bacterial adherence to graft tissues by using our in-house designed in vitro perfusion model.

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

We describe an in-house designed in vitro flow chamber model, which allows the investigation of bacterial adherence to graft tissues.

מודל במבחנה של מערכת מקבילה-Plate זלוף ללמוד חיידקי ההקפדה להשתיל רקמות

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

שיטת In Vivo ללמוד העכבר דם Testis מכשול שלמות

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...