The authors thank Ms.Alisha Knudson for the editorial help. They would also like to acknowledge the financial support from the NIH/NCI (3R01CA115483, to K.S.L.), the DoD PRMRP Award (W81XWH-13-1-0490, to K.S.L.), the NIH/NCI (1R01CA199668, to Y.L.), and the NIH/NICHD (1R01HD086195, to Y.L.).

הצהרת אתיקה: עכברים בעירום athymic נקבה (נו / נו מתח), בן 6-8 שבועות, נרכשה ולאחר מכן המשיכה בתנאים הפתוגן ללא פי הנחיות AAALAC והורשתה להתאקלם לפחות 4 ימים לפני כל ניסויים. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות מוסדיים ולפי מס &#39;פרוטוקול 07-13119 ומס&#39; 09-15584, שאושר על ידי שימוש בבעלי חיים וטיפול הוועדה המייעצת מינהלי באוניברסיטת קליפורניה בדייוויס. 1. סינתזה של TD PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבקבוק מסביב לתחתית, לפזר מיאו-PEG 5K -NH 2 (2 גרם, 0.4 מילימול) 10-20 מ&quot;ל של dimethylformamide נטול מים (DMF) ומקררים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך כוס זכוכית, לפזר equiv 3. של 1-הידרוקסי-6-כלורו-benzotriazole (HOBt), 3 equiv. של N, -diisopropylcarbodiimide &#39;N (DIC), ואת equiv 3. של (Fmoc) 2 ליס-OH ב נטול מים DMF (10-15 מ&quot;ל). מערבב במשך 15-20 דקות על צלחת ומערבבים מגנטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תערובת אל הבקבוק המכיל את התגובה מיאו-PEG 5K -NH 2. הסר את באמבט קרח ומערבבים לתערובת התגובה הלילה בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר את השלמת התגובה עם כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) 16 ובדיקה של קייזר 17 (בצבע צהוב מציין את העדר חינם NH 2). לזרז את המוצר 1 פולימריים (מיאו-PEG 5K -Lys (NH-Fmoc) 2) על ידי הוספת כ -200 מ&quot;ל של האתר קר כקרח אל הבקבוק התגובה. הפרד את הפולימר זירז באמצעות צנטריפוגה (6 דקות ב 6000 XG ו -4 מעלות צלזיוס). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע TLC, לזהות דגימות על צלחות TLC מצופה ג&#39;ל סיליקה. השתמש dichloromethane / מתנול (9: 1) כשלב הנייד. שים לב כתמים תחת מנורת UV לאחר שפתח את צלחות TLC. אפשר גם להשתמש ninhydrin מגיב מכתים לדמיין כתמים אמינים על פלטה חשמלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור קאיהבדיקה של ser, להציב קצת המדגם בצינור זכוכית המכיל מגיב קייזר. מחמם את זה ב 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולחפש את שינוי הצבע (אם הצבע של הפתרון נשאר צהוב, אז התגובה הושלמה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-לפזר את המוצר נטול מים DMF (10-20 מ&quot;ל) וחזור על המשקעים צנטריפוגה (ראה שלב 1.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.5, ולאחר מכן לשטוף את משקע הפולימר שלוש פעמים עם אתר קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את משקע פולימר 1 בבקבוק תגובה נקי ולחבר את הבקבוק למקור ואקום גבוה כדי להסיר את האתר שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ולהוסיף כ 20-30 מ&quot;ל של 20% (v / v) 4-methylpiperidine ב DMF פולימרי 1 ביניים. מערבבים עד המסה מלאה. הפעל את התגובה 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 16 TLC ולבדוק של קייזר (צבע כחול מאשר את נוכחותו של חינם NH 2) 17 (ראה שלב 1.4) כדי לאשר את completion של התגובה. אם התגובה היא מלאה, המשך ממטרי האתר, כאמור עבור מוצר 1 (שלבי 1.4-1.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את המוצר 2 פולימריים (מיאו-PEG 5K -Lys (NH 2) 2) תחת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע עוד סיבוב אחד של (Fmoc) 2 ליס-OH-צימוד על 2 ביניים (שלבים 1.1-1.7) כדי לייצר מוצר 3 (-Lys 5K מיאו-PEG (ליס (NH-Fmoc) 2) 2). דה-להגן (שלבים 1.8-1.10) הקבוצות Fmoc (4, מיאו-PEG 5K -Lys (ליס (NH 2) 2) 2) ו- זוג (שלבים 1.1-1.7) את (Fmoc) ליס (בוק) -OH כדי ליצור polylysine הדנדריטים הדור השלישי (5, מיאו-PEG 5k -Lys-ליס 2 - ((Fmoc) ליס (בוק)) 4) הסתיים עם ארבע קבוצות בוק ו Fmoc על קצה אחד של שרשרת PEG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הפולימר שהתקבל ביניים 5 בבקבוק תגובה. בשנת כפיבקבוק התגובה eparate, להכין 1: 1 (V / V) חומצה trifluoroacetic (TFA) ב dichloromethane (DCM). להוסיף 15-20 מ&quot;ל של 1: תערובת 1 TFA / DCM (V / V) כדי הפולימר ביניים 5. מערבבים את התערובת עד הפולימר נמס לגמרי. מערבב במשך שעה 3 נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע TLC 16 והבדיקה של קייזר (צבע כחול מאשר את נוכחותו של חינם NH 2) 17 (ראה שלב 1.4) כדי לאשר את השלמת התגובה. אם התגובה היא מלאה, להתאדות פולימר-ב-TFA / DCM התערובת עם אוויר עד פתרון צמיג מתקבל. המשך אל ממטרי האתר, כאמור עבור מוצר 1 (שלבי 1.4-1.6). יבש את המוצר 6 פולימריים (מיאו-PEG 5k -Lys-ליס 2 - ((Fmoc) ליס (NH 2)) 4) תחת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת פולימר ביניים 6 לתוך בקבוק תגובה. השתמש כ 40 מ&quot;ל של DMF נטול מים המכיל equiv 8. של N, N -diisopropylethylamine (DIEA) לפזר את פולימר ביניים 6. בתוך כוס זכוכית, לפזר 12 equiv. של HOBt, 12 equiv. של דסק&quot;ש, ו -12 equiv. של (Fmoc) Cys (TRT) -OH ב 20-25 מ&quot;ל של נטול מים DMF. Shake למשך 10-15 דקות, ולאחר מכן להוסיף את תערובת תגובת בקבוק התגובה המכיל 6. הפעל את תגובת הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר את השלמת תגובה עם TLC 16 והבדיקה של קייזר (ראה שלב 1.4; בצבע צהוב מציין את העדר 2 חינם NH) 17. אם התגובה היא מלאה, המשך ממטרים האתר, כאמור עבור מוצר 1 (שלב 1.4-1.6), לבודד 7 מוצר (מיאו-PEG 5K -Lys-ליס 2 - ((Fmoc) ליס - ((Fmoc) Cys (TRT))) 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע Fmoc דה-הגנה על 7, כפי שמתואר בשלב 1.8, כדי להשיג מוצר 8 (PEG 5K -Lys-ליס 2 - (ליס (NH 2) - (Cys (NH 2) (TRT))) 4). זוג (Fmoc) -PEG 2 -Suc-OH ( &quot;Ebes&quot; מקשר, 24 equiv.) על פולימר ביניים באמצעות ההליך המתואר לעיל HOBt / דסק&quot;ש בתיווך צימוד להשיג 9 ביניים (מיאו-PEG 5K -Lys-ליס 2 -Lys 4 - (Cys (TRT) 4) (Ebes (NH-Fmoc)) 8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו עוד סיבוב אחד של הגנה דה Fmoc (שלבים 1.6-1.8) כדי לקבל 10 ביניים (מיאו-PEG 5K -Lys-ליס 2 -Lys 4 - (Cys (TRT)) 4 (Ebes (NH 2)) 8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את פולימר ביניים 10 לתוך בקבוק התגובה ולהוסיף DMF נטול מים (כ 30-40 מ&quot;ל) כדי לפזר אותו. בעוד בקבוק תגובה, לפזר 24 equiv. של CAOSu (שהוכן על פי הנוהל שפורסם קודם לכן) נטול מים DMF (20-30 מ&quot;ל) 18. להוסיף 48 equiv. של N, N -diisopropylethylamine ולתת לו ומערבבים במשך 10-15 דקות. מעביר את התכולה לתוך בקבוק התגובה המכיל 10 ולתת o תגובת הריצהvernight. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר את השלמת התגובה עם TLC 16 ובדיקה של קייזר (ראה שלב 1.4; בצבע צהוב מציין את העדר 2 חינם NH) 17. אם התגובה היא מלאה, המשך ממטרים האתר, כאמור עבור מוצר 1 (שלבים 1.4-1.6) לבודד מוצר 11 (מיאו-PEG 5K -Lys-ליס 2 -Lys 4 - (Cys (TRT)) 4 -Ebes 8 -CA 8). Dialyze אותו במים דה-מיוננים Lyophilize המדגם להניב אבקה לבנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את פולימר ביניים 11 לתוך בקבוק תגובה. הכן ולהוסיף 20 מ&quot;ל של תערובת TFA / 1,2-ethanedithiol (EDT) / triethylsilane (TIS) / H 2 O (94 / 2.5 / 1 / 2.5, V / V) לתוך התמיסה פולימר. מערבבים את התערובת עד המסה מלאה. הפעל את התגובה ל -4 שעות. אשר את השלמת התגובה ידי TLC 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסה המנוע קטר, לפוצץ באוויר לתוך הפולימר-TFA / EDT / TIS / H 2תערובת O עד הפתרון הופכת צמיגה. המשך אל ממטרים האתר, כאמור עבור מוצר 1 (שלבים 1.4-1.6), כדי לבודד את המוצר הסופי, 12 (PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8). לפזר אותו אצטוניטריל ו Lyophilize זה להניב אבקה לבנה. </li></ol> 2. הכנת טעון PTX Micelles <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן micelle PTX הטעון PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 בשיטת האידוי הסטנדרטית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 20 מ&quot;ג של TD עם כמות שונה של PTX (1-9 מ&quot;ג) ב 1 מ&quot;ל של כלורופורם (CHCl 3). הסר את הממס באמצעות מאייד רוטרי להשיג משטח פולימר הומוגנית, יבש. מחדש את הסרט עם 1 מ&quot;ל של תמיסת מלח פוספט שנאגרו (PBS) על ידי מערבולת, ואחריו sonication למשך 30 דקות ב 40 קילוהרץ, במידת הצורך, כדי לאפשר את היווצרות מיצלות טעון בסמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6 μl של 3% (w / w) H 2 O 2 (1 equiv. כדי frEE הקבוצות תיאול) לחמצן הקבוצות תיאול על TD. השתמש פתרון micelle לאפיון נוסף לאחר הרמה של קבוצות תיאול פנויות נותרת בערכים נמוכים מתמיד, כפי שצוינה על ידי הבדיקה של אלמן 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22-מיקרומטר לעקר המדגם. לנתח את כמות התרופה שטעון מיצלות על מערכת 20 HPLC לאחר שחרור תרופות מן מיצלות ידי הוספת אצטוניטריל 9 פעמים וביצוע 10 דקות של sonication. השתמש בעמודת C18 עבור HPLC עם אצטוניטריל / מים כשלב הנייד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את טעינת סמים על פי עקומת הכיול בין הערכים באזור HPLC ועל ריכוזי התרופה 11 הסטנדרטית. הערה: יעילות ההעמסה מוגדרת כיחס בין תרופה והטעונה מיצלות לתוכן התרופה הראשוני. </li></ol></li></ol> 3. אפיונים של Micelles <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את התפלגות גודל וגודל של מ &#39;icelles עם פיזור אור דינאמי (DLS) מכשיר 29. לבצע את המדידות בטמפרטורת החדר ולשמור על ריכוז micelle הוא 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. הערה: כדי לבצע ניתוח גודל חלקיקים, השתמש PBS כמו ריק, ולאחר מכן לרשום את גודל החלקיקים עבור דגימות בפועל. קח את הקריאות בשלושה עותקים עבור דגימות, ולאחר מכן מחשב את הממוצע של הקריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ספקטרום הקרינה כדי למדוד את ריכוז micellar קריטי (CMC) של PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 לפני ואחרי cross-linking עם פירן כמו בדיקה ניאון הידרופובי, כפי שתואר לעיל 13,21. הערה: בדרך כלל, ריכוז micelle נע בין 5 × 10 -7 עד 5 × 10 -4 מ &#39; </li></ol> 4. יציבות של Micelles ב SDS עם או בלי סוכני צמצום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מלאי של פתרונות סולפט dodecyl נתרן פתרון (SDS) (7.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ו דיסולפיד מיצלות צולבים (1.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ב PBS. לאחר מכן, uלשיר את פתרונות המניות, לעשות תערובת פתרון שבו ריכוז SDS הסופי נמצא במרחק של 2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו ריכוז micelle הוא ברמה של 1.0 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את התפלגות גודל וגודל (כאמור בשלב 3.1) של הפתרונות micelle במרווחי זמן קבועים מראש עם או ללא נוכחות של גלוטתיון 10 מ&quot;מ (GSH). </li></ol> Assay המוליזה 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הפוטנציאל המוליטית של מיצלות PTX טעון, הלא צולבים (PTX-NCMs) המוכן על פי נוהל שפורסם בעבר 11 ו מיצלות הצולבות הטעונות PTX (PTX-DCMS) באמצעות citrated דם טרי מעכברים בעירום הנגבים צעיף זנב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף כדוריות דם אדומות על ידי צנטריפוגה של דגימת דם (1.0 מ&quot;ל) XG ב 1000 למשך 10 דקות, לשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS, ולאחר מכן מחדש להשעות את כדורי תא עם PBS לריכוז סופי של 2%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 200 μl של השעיה כדורית עם ריכוזים שונים (0.2 ו -1.0מ&quot;ג / מ&quot;ל) של PTX-NCMs ו PTX-DCMS, בהתאמה, ו דגירה של 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס שייקר אינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התערובות הכדוריות micelle ב 3000 XG במשך 5 דקות. העברת 100 μl של supernatant מכל הדגימות לצלחת 96-היטב. מדוד את ספיגת של המוגלובין חופשי supernatant ב 540 ננומטר באמצעות קורא מיקרו צלחת. הערה: RBCs מודגרות עם טריטון-100 (2%) והטלוויזיה הציבורית הם כדי לשמש בקרות חיוביות ושליליות, בהתאמה. המוליזה אחוז RBCs מחושב עם הנוסחה הבאה: RBC המוליזה = (מדגם OD - OD שליטה שלילי) / (OD חיובית מלאה - OD שליטה שלילי) × 100%. </li></ol>

<ol>
	<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+in+medicine:+therapeutic+applications+and+developments.">Nanoparticles in medicine: therapeutic applications and developments.</a> Clin. Pharmacol. Ther. 83, 761-769 (2008).</li><li>Wang, A. Z., Langer, R., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+Delivery+of+Cancer+Drugs.">Nanoparticle Delivery of Cancer Drugs.</a> Annu. Rev. Med. 63, 185-198 (2012).</li><li>Iyer, A. K., Khaled, G., Fang, J., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+enhanced+permeability+and+retention+effect+for+tumor+targeting.">Exploiting the enhanced permeability and retention effect for tumor targeting.</a> Drug Disc. Today Targets. 11, 812-818 (2006).</li><li>Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+chemical+strategies+for+therapeutic+delivery+by+using+polymeric+nanoparticles.">Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles.</a> Pharmacol. Rev. 64, 505-519 (2012).</li><li>Kamaly, N., Xiao, Z., Valencia, P. M., Radovic-Moreno, A. F., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+polymeric+therapeutic+nanoparticles:+design,+development+and+clinical+translation.">Targeted polymeric therapeutic nanoparticles: design, development and clinical translation.</a> Chem. Soc. Rev. 41, 2971-3010 (2012).</li><li>Li, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversibly+stabilized+multifunctional+dextran+nanoparticles+efficiently+deliver+doxorubicin+into+the+nuclei+of+cancer+cells.">Reversibly stabilized multifunctional dextran nanoparticles efficiently deliver doxorubicin into the nuclei of cancer cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 9914-9918 (2009).</li><li>Miyata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Block+catiomer+polyplexes+with+regulated+densities+of+charge+and+disulfide+cross-linking+directed+to+enhance+gene+expression.">Block catiomer polyplexes with regulated densities of charge and disulfide cross-linking directed to enhance gene expression.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 2355-2361 (2004).</li><li>Chan, Y., Wong, T., Byrne, F., Kavallaris, M., Bulmus, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-labile+core+cross-linked+micelles+for+pH-triggered+release+of+antitumor+drugs.">Acid-labile core cross-linked micelles for pH-triggered release of antitumor drugs.</a> Biomacromolecules. 9, 1826-1836 (2008).</li><li>Rijcken, C. J., Snel, C. J., Schiffelers, R. M., van Nostrum, C. F., Hennink, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysable+core-crosslinked+thermosensitive+polymeric+micelles:+synthesis,+characterisation+and+in+vivo+studies.">Hydrolysable core-crosslinked thermosensitive polymeric micelles: synthesis, characterisation and in vivo studies.</a> Biomaterials. 28, 5581-5593 (2007).</li><li>Talelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-crosslinked+polymeric+micelles+with+controlled+release+of+covalently+entrapped+doxorubicin.">Core-crosslinked polymeric micelles with controlled release of covalently entrapped doxorubicin.</a> Biomaterials. 31, 7797-7804 (2010).</li><li>Xiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+self-assembling+nanoparticle+for+paclitaxel+delivery+in+ovarian+cancer.">A self-assembling nanoparticle for paclitaxel delivery in ovarian cancer.</a> Biomaterials. 30, 6006-6016 (2009).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+size-tunable+nanocarrier+system+for+targeted+anticancer+drug+delivery.">A novel size-tunable nanocarrier system for targeted anticancer drug delivery.</a> J. Control. Release. 144, 314-323 (2010).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-defined,+reversible+disulfide+cross-linked+micelles+for+on-demand+paclitaxel+delivery.">Well-defined, reversible disulfide cross-linked micelles for on-demand paclitaxel delivery.</a> Biomaterials. 32, 6633-6645 (2011).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-defined,+reversible+boronate+crosslinked+nanocarriers+for+targeted+drug+delivery+in+response+to+acidic+pH+values+and+cis-diols.">Well-defined, reversible boronate crosslinked nanocarriers for targeted drug delivery in response to acidic pH values and cis-diols.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51, 2864-2869 (2012).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+smart+and+versatile+theranostic+nanomedicine+platform+based+on+nanoporphyrin.">A smart and versatile theranostic nanomedicine platform based on nanoporphyrin.</a> Nat. Commun. 5, (2014).</li><li>Belenki, B. G., Gankina, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-Layer+chromatography+of+polymers.">Thin-Layer chromatography of polymers.</a> J. Chromatogr. A. 141, 13-90 (1977).</li><li>Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+test+for+detection+of+free+terminal+amino+groups+in+the+solid-phase+synthesis+of+peptides.">Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides.</a> Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).</li><li>Pandey, P. S., Rai, R., Singh, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+cholic+acid-based+molecular+receptors:+head-to-head+cholaphanes.">Synthesis of cholic acid-based molecular receptors: head-to-head cholaphanes.</a> J. Chem. Soc., Perkin Trans 1. , 918-923 (2002).</li><li>Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+Ellman's+reagent.">Reassessment of Ellman's reagent.</a> Methods Enzymol. 91, 49-60 (1983).</li><li>Ahuja, S., Rasmussen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+HPLC+method+development+for+pharmaceuticals.">Overview of HPLC method development for pharmaceuticals.</a> HPLC Method Development for Pharmaceuticals. , 1-11 (2007).</li><li>Li, Y., Pan, S., Zhang, W., Du, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+thermo-sensitive+core-shell+nanoparticles+for+targeted+paclitaxel+delivery.">Novel thermo-sensitive core-shell nanoparticles for targeted paclitaxel delivery.</a> Nanotechnology. 20 (6), 065104 (2009).</li><li>Kato, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+cross-linked+micelles+for+the+targeted+delivery+of+vincristine+to+B-cell+lymphoma.">Disulfide cross-linked micelles for the targeted delivery of vincristine to B-cell lymphoma.</a> Mol. Pharm. 9, 1727-1735 (2012).</li><li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glutathione+synthesis.">Regulation of glutathione synthesis.</a> Mol. Aspects Med. 30, 42-59 (2009).</li><li>Xiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="OA02"+peptide+facilitates+the+precise+targeting+of+paclitaxel-loaded+micellar+nanoparticles+to+ovarian+cancer+in+vivo.">"OA02" peptide facilitates the precise targeting of paclitaxel-loaded micellar nanoparticles to ovarian cancer in vivo.</a> Cancer Res. 72, 2100-2110 (2012).</li><li>Koo, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-cross-linked+PEG-poly(amino+acid)s+copolymer+micelles+for+glutathione-mediated+intracellular+drug+delivery.">Disulfide-cross-linked PEG-poly(amino acid)s copolymer micelles for glutathione-mediated intracellular drug delivery.</a> Chem. Commun. 28, 6570-6572 (2008).</li><li>McLellan, L. I., Wolf, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+and+glutathione-dependent+enzymes+in+cancer+drug+resistance.">Glutathione and glutathione-dependent enzymes in cancer drug resistance.</a> Drug. Resist. Update. 2, 153-164 (1999).</li><li>Karala, A. R., Lappi, A. K., Saaranen, M. J., Ruddock, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+peroxide-mediated+oxidative+refolding+of+a+protein+at+physiological+pH+and+implications+for+oxidative+folding+in+the+endoplasmic+reticulum.">Efficient peroxide-mediated oxidative refolding of a protein at physiological pH and implications for oxidative folding in the endoplasmic reticulum.</a> Antioxid. Redox Signal. 11, 963-970 (2009).</li><li>Gabizon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+nanomedicines:+closing+the+translational+gap.">Cancer nanomedicines: closing the translational gap.</a> Lancet. 384, 2175-2176 (2014).</li></ol>

Y. Li and K.S.L. are the inventors of a pending patent on reversibly crosslinked micelle systems (US patent application 61/485,774). K.S.L. is the founding scientist of LamnoTherapeutics Inc., which plans to develop the nanotherapeutics described in the manuscript. The remaining authors declare no competing financial interests.

חלקיקים כמה נחקרו לשימוש הפוטנציאל שלהם משלוח סמים. דוקסורוביצין ו- paclitaxel liposomal (PTX) -loaded-אגרגטים ננו אלבומין בסרום האדם הם בין באלצ&#39;ואה אושרה על ידי ה- FDA לטיפול בסרטן. עם זאת, למרות קליני יעיל, הן של באלצ&#39;ואה אלה הן יחסית &quot;גדולות&quot; בגודל, והם נוטים להצטבר בכבד והריאות. מיצלות פולימרית עם גדלים של חלקיקים קטנים יחסית ויכולות העמסת תרופה גבוהות הם מתעוררים nanocarriers עבור משלוח סמים. מבנה ליבה-הפגז הייחודי שלהם &#39;&#39; solubilize &#39;&#39; מולקולות התרופה הידרופובי בתנאים מימיים ידי אנקפסולציה פיזית. מיצלות פולימרית המורכבת TDs המוגדרת היטב ערוכה חלקיקי monodispersed טופס מעבדה שלנו (גודל חלקיקים 10-50 ננומטר) עם חיים-מדף ארוכים יעיל גבוה encapsulating תרופות. אחד היתרונות הרבים של פלטפורמת TD החזקה הוא הצדדי של הפולימר.תרופות רבות, צבעי ניאון, ו ligands מיקוד ניתן לשלב בקלות לתוך פלטפורמת TD 13,15,24. צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול פתחנו חזקה, הפיכה, מערכת micelle צולבת דיסולפיד למסירת PTX, אשר מוגדרת היטב, עם גודל חלקיקים סביב 27 ננומטר, ויש לו התפלגות גודל צרה. TDs היו מסונתז באמצעות כימית פפטיד פתרון שלב בשלבים. המבנה הכימי המוגדר היטב של TDs אלה הוא גורם המפתח ליצירת חלקיקים עם המאפיינים הרצויים. לכן, המאשר את השלמת התגובה עם הבדיקה של TLC וקייזר הוא קריטי מאוד. חמצון H 2 O 2 הוא גם שלב קריטי, הקבוצות תיאול על TD הם מתחמצנים כדי ליצור דיסולפיד חוצה קישורים, אשר מאוד לשפר את היציבות של מיצלות. לעומת שיטת החמצון מבוסס החמצן הקודם שלנו, H 2 O 2 -שיטת חמצון מבוססת היא 96 פעמים מהר יותר, ובכך לספק מיצלות צולבים בתקופות זמן קצרות יותר. יתר על כן, GSH, tripeptide המכיל תיאול, הוא אנטי-אוקסידנט חשוב המיוצר על ידי התאים, והוא משחק תפקיד חשוב הדחה רדיקלים חופשיים ותרכובות חמצן תגובתי. זה גורם תרומות גדולות ידי שמירה על הומאוסטזיס חמזור הסלולר. ריכוז הסלולר של GSH הוא היבט מעניין של תכנון תרופות. הריכוז התאי של GSH עכשיו היא מבוסס היטב כדי להיות גבוהה במידה ניכרת בהשוואת הריכוז התאי (10 המ&quot;מימ לעומת 2 מיקרומטר, בהתאמה) 25. יתרה מכך, רמת GSH גבוהה תאית לעתים קרובות דווחה תאים סרטניים רבים עמידות לתרופות אדם בעכברים 26. חלוקת תאיים גבוהה של GSH מקל על שבירה של cross-linking דיסולפיד של מיצלות ואת גורמת לשחרור והצטברות של מטען התרופה. החלקיקים דיסולפיד הצולבים הםיציב בנוכחות SDS. עם זאת, בסביבת תאיים העשירית GSH גורמת לשחרור של התרופה על ידי פירוק אג&quot;ח דיסולפיד, ובכך מערער את המערכת. פולימר-induced המוליזה נבעה האינטראקציה המזיקה של מיצלות פולימריות עם מרכיבי דם, כגון תאי דם אדומים. צולבים מיצלות הראה הרבה פחות המוליזה לעומת אנלוגים הלא צולבים. שינויים ופתרון בעיות ניצול H 2 O 2 כסוכן חמצון מאפשר במערך קשר צולב דיסולפיד יעיל יותר בהשוואה שדווח בעבר, בשיטה המבוססת על חמצן 13. H 2 O 2 הוא סוכן חמצון חזק 27, כי הוא זול מאוד מסיס במים ונותן מוצרים באיכות גבוהה בהשוואה לכמה סוכני חמצון ידוע אחרים (למשל, כרומטי או permanganate). עם זאת, זמן החמצון ייתכן שיהיה צורך further עבר אופטימיזציה המבוסס על הסולם של הסינתזה. מגבלות של הטכניקה H 2 O 2 הוא מחמצן חזק. למרות ריכוז נמוך של H 2 O 2 משמש לביצוע היווצרות הקשר צולב דיסולפיד, יש טיפול שיש לנקוט בעת שימוש עם TDs עמוסה &quot;רגיש-חמצון&quot; תרופות כדי למנוע שפלת תרופה רצויה. משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות הטכניקה המתוארת היא הגדרת ניסוי קלה כי ניתן לשכפל בקלות במעבדה סטנדרטית. לדוגמא, טעינת סמים בשיטת אידוי סטנדרטית היא פחות זמן רב בהשוואה לשיטת הדיאליזה. היווצרות דיסולפיד בליבה באמצעות H 2 O 2 כסוכן חמצון הוא 96 פעמים מהר יותר מאשר שיטת חמצון שדווח בעבר באמצעות oxygen 13. שחזור של צעד תרופת הטעינה ניתן להעריך בקלות על ידי מדידת גודל החלקיקים (שיטת DLS) ותוכן תרופה (HPLC). יישומים עתידיים או כיווני לאחר מאסטרינג טכניקה זו לעומת תרופות מולקולות קטנות, אחד המכשולים העיקריים שצריך להתגבר עליהם לפני-ננו-רפואה יכולה להזין הגדרות טיפול בסרטן המיינסטרים היא על האתגרים הטכניים של דרוג את הייצור 28. כאשר ישלטו בטכניקה חדשה שפותחה זה, אפשר בקלות לסנתז דיסולפיד מיצלות צולבות בקנה מידה גדול. זה מאוד רצוי מחקרים קליניים של ננו-ניסוח זה בחולים אנושיים.

ננוטכנולוגיה הוא תחום מהיר המתעורר כי הרוויח במספר התחומים ביו 1. חלקיקים לספק הזדמנויות לעיצוב כוונון תכונות כי הם לא ריאליים עם סוגים אחרים של תרופות קונבנציונליות. ננו-נישא לשפר את היציבות של תרופות נגד לפירוק, להאריך את זמן מחזור סמים, להתגבר על בעיות מסיסות תרופה, והוא יכול להיות מכויל עבור שיגור תרופות ועבור 1,2 סוכני הדמית אספקת שיתוף. מערכות אספקה ​​מבוססת ננו-חלקיקי הבטחה בתחום הדמיה וטיפול בסרטן. Vasculatures הסרטני הם דולפים אל מקרומולקולות יכול לגרום להצטברות מועדפת של מחזורי חלקיקים באתרי גידול באמצעות החדירות המשופרות ושימור (EPR) אפקט 3. בין ננו-נישא כמה (למשל, ליפוזומים, הידרוג, ו מיצלות פולימריות) כי הם נמשכים במרץ כנישאים לתרופות אנטי-סרטניות, מיצלות פולימריים צברו פופולריות רחבה מעל הדואר האחרון בעשור 4,5. מיצלות פולימריים הן מערכת תרמודינמית כי, על עירוי לוריד, עלול להיות מדוללת מתחת ריכוז micelle הביקורתי (CMC), מה שמוביל דיסוציאציה שלהם לתוך unimers. אסטרטגיות Cross-linking כבר מועסק על מנת למזער דיסוציאציה micellar לתוך unimers. עם זאת, מיצלות התייצבה מדי עלולה למנוע התרופה מלשחרר באתרי היעד, ובכך להפחית את היעילות הטיפולית הכוללת. כמה גישות כימיות נחקרו על מנת להפוך את cross-linking מתכלה בתגובת חיזור או לגירויים חיצוניים, כגון אג&quot;ח דיסולפיד לצמצום 6,7 ו- pH-cleavable 8 או אסתר hydrolysable אג&quot;ח 9,10. דיווחנו בעבר בעיצוב סינתזה של חלקיקים micellar המורכב חומצה כולית הדנדריטים (CA) בלוקים פוליאתילן גליקול ליניארי (PEG) קופולימרים, המכונה telodendrimers (TD) 11-15 </sup&gt;. TDs אלה מיוצגים PEG נ&quot;ק -CAy (כאשר n = משקל מולקולרי ב kilodaltons (K), Y = מספר חומצה כולית (CA) יחידות). הם מאופיינים בגודל הקטן שלהם, חיי מדף ארוכים, ויעילות גבוהה בסמי encapsulating כגון פקליטקסל (PTX) ודוקסורוביצין (DOX) בליבה הידרופובי. אבני הבניין של TD, כגון PEG, ליזין, ו- CA, הם ביולוגית, ואת הנוכחות של קורונה PEG יכול להקנות אופי הננו-חלקיק &quot;התגנבות&quot;, מניעת ספיגת הלא ספציפית של חלקיקים micellar ידי מערכות reticuloendothelial. ליניארי-הדנדריטים Thiolated פולימרים יכול להיווצר בקלות על ידי החדרת cysteines לתוך עמוד השדרה אוליגו-ליזין הדנדריטים של ניכוי מס במקור הרגילה שלנו. מאמר זה מציג פרוטוקול קליל לייצור מערכת אספקת סמים micellar צולבים הפיך על ידי החדרת צולבות קישורים דיסולפיד לתוך ליבת הידרופובי של TDS (איור 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="795">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">MeO-PEG5K-NH2</td>
			<td style="width:105px;">Rapp Polymere</td>
			<td style="width:119px;">125000-2</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Lys(Fmoc)-OH</td>
			<td style="width:105px;">Aaptec</td>
			<td style="width:119px;">AFK107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Lys(Boc)-OH</td>
			<td style="width:105px;">Anaspec</td>
			<td style="width:119px;">AS-20132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Cys(Trt)-OH</td>
			<td>Aapptec</td>
			<td>AAC105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dimethylformamide</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1160-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethyl ether</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">E134-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D125806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6508</td>
			<td>Corrosive, handle with care</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4-methyl piperidine</td>
			<td style="width:105px;">Alfa-Aesar</td>
			<td style="width:119px;">L-02709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ebes linker</td>
			<td style="width:105px;">Anaspec</td>
			<td>AS-61924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cholic acid</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1,2-Ethanedithiol</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">02390</td>
			<td>Handle inside fume hood. Bleach gloves after usage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triisopropylsilane</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">233781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform (anhydrous)</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hydrogen peroxide solution 30%</td>
			<td style="width:105px;">Aaron Industries</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HoBt-Cl</td>
			<td style="width:105px;">Aaptec</td>
			<td style="width:119px;">CXZ096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DIC</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D125407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Female athymic nude mice (Nu/Nu strain), 6&#8211;8 weeks age</td>
			<td colspan="2">Harlan (Livermore, CA)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a facile and efficient approach for the production of reversible disulfide cross-linked micelles

ננו-רפואה היא צורה מתעוררת של טיפול שמנצל את המאפיינים הייחודיים של חלקיקים שהם ננומטר בקנה מידה עבור יישומים ביו. שיפור אספקת סמים על מנת למקסם את התוצאות טיפולית כדי להפחית תופעות לוואי הקשורות לתרופה כמה מאבני היסוד של ננו-רפואה של ימינו. חלקיקים בפרט מצאו יישום רחב בטיפול בסרטן. חלקיקים המציעים רמה גבוהה של גמישות בעיצוב, יישום, וייצור מבוסס על המיקרו-סביבה של הגידול מוקרנים כיעיל יותר עם תרגום מהיר לתוך הפרקטיקה הקלינית. The-המוביל ננו micellar פולימריים היא בחירה פופולרית עבור יישומי משלוח סמים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל סינתזה טעונה-סמים, מיצלות צולבות דיסולפיד מבוססות על ההרכבה העצמית של קופולימר ליניארי-הדנדריטים amphiphilic מוגדר היטב (telodendrimer, TD). TD מורכב פוליאתילן GLycol (PEG) כפלח הידרופילי אשכול חומצת thiolated cholic כמו בשלבים מצורפים מחצית הידרופובי יוצרי ליבה ל PEG אמין הסתיים באמצעות כימיה פפטיד מבוסס פתרון. תרופות כימותרפיות, כגון פקליטקסל (PTX), ניתן לטעון בשיטת אידוי ממס סטנדרטית. O 2 החמצון בתיווך נוצל בעבר כדי ליצור תוך micellar דיסולפיד צולבים קישורים מקבוצות תיאול חינם על TDS. עם זאת, התגובה היתה איטית ולא ריאלי עבור ייצור בקנה מידה גדול. לאחרונה, שיטת חמצון H 2 O 2 בתיווך שנחקרה כגישה יותר ריאלית ויעילה, וזה היה 96 פעמים מהר יותר מאשר השיטה שדווחה בעבר. בגישה זו, 50 גרם של טעון PTX, חלקיקים צולבים דיסולפיד הופק בהצלחה עם התפלגות גודל חלקיקים צרה ויעילות טעינת תרופה גבוהה. יציבות פתרון micelle וכתוצאה מנותחת באמצעות תנאים לשבש כגון שיתוף דגירה wה- i סולפט dodecyl חומרי ניקוי, נתרן, עם או בלי סוכן צמצום. שטעונים-הסמים, מיצלות הצולבות דיסולפיד הפגינו פחות פעילות המוליטית בהשוואה לעמיתיהם הלא הצולבים שלהם.

הכנה ואפיון של טיעון בסמים, דיסולפיד צולב Micelles Amphiphilic פולימר PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 הוא פולימר הדנדריטים מסוגל להרכיב דיסולפיד צולב מערכת micellar למסירת תרופה לסרטן. מבחינה מבנית, הוא מוגדר בתור oligomer הדנדריטים של חומצה כולית (תחום הידרופובי) צמוד קצה אחד של מולקולת PEG ליניארי (תחום הידרופילי, משקל מולקולרי 5K) באמצעות פולי קנים (ליזין-ציסטאין-Ebes) עמוד שדרה. ישנם מספר יתרונות של שימוש קופולימרים לחסום אלה פני מערכות micellar דיווחו אחרות. ראשית, הוא יכול להיות מסונתז בקלות דרך תגובות עיבוי שלב פתרון בשלבים. שנית, לעומת מספר פולימרי amphiphilic דיווח אחרים, מערכת פולימר thiolated, שהוכנו באמצעות פתרון שלב ומבוסס כימיה של חלבונים בשלבי Fmoc, יש structu מוגדר היטבמִחָדָשׁ. זה יכול להיות מאוחסן בצורת אבקת lyophilized ויש לו חיי מדף מורחבים. יכולות להיות מנוצלות מספר טכניקות כדי לאפיין את המוצר הסופי. כמות חומצה כולית המצורפת TD יכול להיות מזוהים על ידי השוואת יחס אות של פרוטונים על PEG לאלה על שלוש קבוצות מתיל של חומצה כולית של ספקטרום NMR H 1. המשקלים המולקולריים של TD יכול להיות מאושרת על ידי כרומטוגרפיה חלחול ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF ו ג&#39;ל (GPC). המבחן של כמותי האלמן ניתן להשתמש כדי לפענח את מספר שאריות ציסטאין חינם נוכחיות לכל מולקולה. PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 יכול עצמי להרכיב כדי ליצור מיצלות בהמדים מימיים. בשיטת אידוי ממס רגילה, מגוון של תרופות הידרופובי, כגון PTX ו- vincristine, כבר כמוס בהצלחת מיצלות 13,22. Oxygen נוצל בעבר לחמצן הקבוצות תיאול ללא 5K PEG -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 וליצור-קשרים צלב דיסולפיד התוך micellar. כמו פיקוח על ידי בדיקה של אלמן, יחס ההמרה מקבוצות תיאול חופשי דיסולפיד אג&quot;ח הגיעו 85% לאחר 48 שעות של חמצון. AH 2 O 2 חמצון בתיווך הועסק לאחרונה כשיטה חלופית. שיעור ההמרה הגיע 88% ב 30 דקות (איור 2), אשר היו 96 פעמים מהר יותר מאשר הגישה הקודמת. חמישים גרם טיעון PTX, דיסולפיד חלקיקים צולבים הופקו בהצלחה באמצעות גישה יעילה יותר זה (איור 3). גודל החלקיקים היה בסביבות 27 ננומטר, עם התפלגות גודל צרה (איור 3). היעילות טעינת סמים התקרב 100% עם טעינת PTX של 4.0 מ&quot;ג / מ&quot;ל. דיסולפיד cross-linking היתה השפעה דרמטית על הערך CMC. לעומת TD PEG תקן 5K -CA 8 החסריםאג&quot;ח דיסולפיד, קל TD הצולב נרשם ירידה של פי 10 בערכי CMC ציינו (5.53 מיקרומטר לעומת 0.67 מיקרומטר) 13. מחקרי יציבות בנוסף, אנו חקרנו את יציבות PTX טעונה, מיצלות צולבות דיסולפיד נגד תנאים-שיבוש micelle חמורים. נתרן גופרתי dodecyl (SDS) הוא חומר ניקוי יוני חזק המשמש באופן שיגרתי להערכת יציבות micellar, כפי שהוא יכול לשבור מיצלות פולימריים ביעילות. יציבות טעון סמים, מיצלות צולבים דיסולפיד (1.0 מ&quot;ג / מ&quot;ל) היה פיקוח על ידי DLS בנוכחות של שיבוש-micelle SDS (2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל). גודל החלקיקים של מיצלות נותר יציב לאורך זמן, המציין כי מיצלות צולבים כאלה נותרו על כנן (איור 4, לוחות שמאל). תנאי רדוקטיבי צפויים לדבוק אג&quot;ח דיסולפיד בליבה הידרופובי, יסEby ביצוע מיצלות רגיש יציבות. גלוטתיון (GSH), גידול אנדוגני צמצום סוכן, מועסק לעתים קרובות ללימודים כאלה. יש בניגוד מוחלט ברמת תאיים של GSH לעומת רמת תאיים (10 מ&quot;מ לעומת 2 מיקרומטר). הבדל זה בריכוזים משמש לעתים קרובות כדי ליצור מערכות גירויי תגובה. לאחר התוספת של GSH לעבר ריכוז תאי (10 מ&quot;מימ) 23, את הגודל טעון-סמים, מיצלות הצולבות דיסולפיד נותר על כנן למשך 30 דקות. הם ירדו במפתיע 1 ננומטר, אשר מציין את הפחתת מספר קריטי של אג&quot;ח דיסולפיד, תנאי מוקדם של דיסוציאציה המהירה של מיצלות (איור 4, פאנל מימין). נהפוך הוא, המערכת נותר יציב בנוכחות ריכוזים תאיים של GSH (מידע לא מוצג). לימוד המוליזה דמות5 הראה הבדלים בפעילות המוליטית הנצפית של מיצלות הטעונה PTX, עם או בלי דיסולפיד cross-linking. המוליזה של כדוריות דם יש להימנע בעת ניהול חלקיקים אלה לתוך זרם הדם, כפי שהיא מערערת היתרונות הטיפוליים שלהם. המטו-התאימות היא חיונית מאוד עבור יישום in vivo של ספקים בסמים מבוססי פולימרים, כגון TDs amphiphilic כי יש פוטנציאל solubilize שומנים או להכניס את עצמם לתוך ממברנות פוספוליפידים, שמוביל פקיעת קרומי פלזמה. כפי שניתן לראות בתרשים 5, PTX-NCMs נמצאו כבעלי תא דם אדום-תלוי-מינון (RBC) לספור תמוגה, עם אחוז המוליזה הגדלת לעומת 8.1% ל -14.2% כמו ריכוז של PTX-NCMs עלה מ 0.2 מ&quot;ג / ml ל -1.0 מ&quot;ג / מ&quot;ל. עם זאת, PTX-DCMS שיש דיסולפיד cross-linking לא הראו פעילות המוליטית לצפייה (&lt;1.0%) ב RBCs באותם תנאי הניסוי. ההבדל הזה ב hemolysהוא ניתן לייחס מגמת גשרי דיסולפיד תוך micellar שנכחו הליבה הידרופובי, המונעים PTX-DCMS מ מתנער להרכיב TDs amphiphilic. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54722/54722fig1.jpg" /> איור 1: צעדים לגיבוש מיצלות צולבים. ייצוג סכמטי של מיצלות דיסולפיד הצולבת שהוקמה על ידי חמצון של thiolated telodendrimer PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 לאחר הרכבה עצמית. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54722/54722fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54722/54722fig2.jpg" /> איור 2: שיטות חמצון להיווצרות micelle צולבת. שיעור ההמרה של tהוא תיאול קבוצות על TDs כדי דיסולפיד אג&quot;ח כפונקציה של זמן חמצון עבור שתי שיטות החמצון. הריכוז הכולל של מיצלות נשמר בטמפרטורה של 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54722/54722fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54722/54722fig3.jpg" /> איור 3: טיעון בסמים, micelle הצולב. פנל משמאל: תמונה מתוך סדרה של PTX טעון, מיצלות צולבות דיסולפיד. סרגל קנה מידה: 1 אינץ &#39;. פנל ימני: גודל החלקיקים, כפי שנקבע על ידי פיזור אור דינאמי (DLS). הריכוז הכולל של מיצלות נשמר בטמפרטורה של 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל. העמסת PTX היה 4 מ&quot;ג / מ&quot;ל. נתוני גודל החלקיקים הוצגו כמו גודל חלקיקים הממוצע ± סטיית התקן בהתבסס על שלוש מדידות. SD: סטיית התקן, מתארת ​​את רוחב התפלגות גודל חלקיקים הנמדד.<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54722/54722fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54722/54722fig4.jpg" /> איור 4: מחקר יציבות. גודל החלקיקים של PTX טעון, מיצלות צולבים דיסולפיד בנוכחות של 2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​SDS ללא (משמאל) או עם (מימין) GSH (10 מ&quot;מ), כפי שהיא נמדדת על ידי DLS. נתוני גודל החלקיקים הוצגו כמו גודל חלקיקים הממוצע ± סטיית התקן בהתבסס על שלוש מדידות. SD: סטיית התקן, מתארת ​​את רוחב התפלגות גודל חלקיקים הנמדד. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54722/54722fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54722/54722fig5.jpg" /> איור 5: assay המוליזה. פעילות המוליטית חוץ גופייה של PTX טעון, מיצלות צולבות דיסולפיד בהשוואה מיצלות הלא crosslinked על תאי דם אדומים (RBCs). Triton-100 (2%) ו- PBS שימשו בקרות חיוביות ושליליות, בהתאמה. על הערכים המדווחים הם ממוצע ± סטיית התקן של דגימות בשלושה עותקים. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54722/54722fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles at JoVE.com

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

גישה קלילה ויעילה לייצור ההפיך דיסולפיד צולב Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

a-facile-efficient-approach-for-production-reversible-disulfide-cross

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.8K Views.  University of California, Davis. To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

Video: A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ<em&gt; Coli Escherichia</em&gt;: עיצוב, ייצור טיהור

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is not completely understood. All proteasomes contain a structurally conserved core particle (CP), or 20S proteasome, containing two heptameric&#160;&#946; subunit rings sandwiched between two heptameric&#160;&#945; subunit rings. Archaeal 20S proteasomes are compositionally simpler compared to their eukaryotic counterparts, yet they both share a common assembly mechanism. Consequently, archaeal 20S proteasomes continue to be important models for eukaryotic proteasome assembly. Specifically, recombinant expression of archaeal 20S proteasomes coupled with nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) has yielded many important insights into proteasome biogenesis. Here, we discuss a means to improve upon the usual strategy of coexpression of archaeal proteasome &#945; and &#946; subunits prior to nondenaturing PAGE. We demonstrate that although rapid and efficient, a coexpression approach alone can miss key assembly intermediates. In the case of the proteasome, coexpression may not allow detection of the half-proteasome, an intermediate containing one complete &#945;-ring and one complete &#946;-ring. However, this intermediate is readily detected via lysate mixing. We suggest that combining coexpression with lysate mixing yields an approach that is more thorough in analyzing assembly, yet remains labor nonintensive. This approach may be useful for the study of other recombinant multiprotein complexes.

This protocol uses both subunit coexpression and postlysis subunit mixing for a more thorough examination of recombinant proteasome assembly.

בחינת העצרת הפרוטאזום עם רקומביננטי Archaeal הפרוטאזומים ועמוד Nondenaturing: The Case for גישה משולבת

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.

We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.

שיטה יעילה עבור הבידוד של רנ&quot;א מאוד מטוהר מזרעים לשימוש ב כמוני transcriptome ניתוח

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 באמצעות Microseeding ואבץ-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

הפקה בקנה מידה מעבדתי וטיהור של נוגדן רפואי

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly thermally stable. There are &#62;375,000 putative G4-forming sequences in the human genome, and they are enriched in promoter regions, untranslated regions (UTRs), and within the telomeric repeat. Due to the potential for these structures to affect cellular processes, such as replication and transcription, the cell has evolved enzymes to manage them. One such enzyme is G4 Resolvase 1 (G4R1), which was biochemically co-characterized by our laboratory and Nagamine et al. and found to bind extremely tightly to both G4-DNA and G4-RNA (Kd in the low-pM range). G4R1 is the source of the majority of G4-resolving activity in HeLa cell lysates and has since been implicated to play a role in telomere metabolism, lymph development, gene transcription, hematopoiesis, and immune surveillance. The ability to efficiently express and purify catalytically active G4R1 is of importance for laboratories interested in gaining further insight into the kinetic interaction of G4 structures and G4-resolving enzymes. Here, we describe a detailed method for the purification of recombinant G4R1 (rG4R1). The described procedure incorporates the traditional affinity-based purification of a C-terminal histidine-tagged enzyme expressed in human codon-optimized bacteria with the utilization of the ability of rG4R1 to bind and unwind G4-DNA to purify highly active enzyme in an ATP-dependent elution step. The protocol also includes a quality-control step where the enzymatic activity of rG4R1 is measured by examining the ability of the purified enzyme to unwind G4-DNA. A method is also described that allows for the quantification of purified rG4R1. Alternative adaptations of this protocol are discussed.

G4 Resolvase1 binds to G-quadruplex (G4) structures with the tightest reported affinity for a G4-binding protein and represents the majority of the G4-DNA unwinding activity in HeLa cells. We describe a novel protocol that harnesses the affinity and ATP-dependent unwinding activity of G4-Resolvase1 to specifically purify catalytically active recombinant G4R1.

גישה G-quadruplex זיקה-DNA עבור טיהור של enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a challenge for ChIP due to technical difficulty in isolation of high-quality nuclei with minimal contamination of myofibrils. Previous protocols have attempted to purify nuclei before cross-linking, which incurs the risk of altered DNA-protein interaction during the prolonged nuclei preparation process. In the current protocol, we first cross-linked the skeletal muscle tissue collected from mice, and the tissues were minced and sonicated. Since we found that ultracentrifugation was not able to separate nuclei from myofibrils using cross-linked muscle tissue, we devised a sequential filtration procedure to obtain high-quality nuclei devoid of significant myofibril contamination. We subsequently prepared chromatin by using an ultrasonicator, and ChIP assays with anti-BMAL1 antibody revealed robust circadian binding pattern of BMAL1 to target gene promoters. This filtration protocol constitutes an easily applicable method to isolate high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle tissue, allowing consistent sample processing for circadian and other time-sensitive studies. In combination with next-generation sequencing (NGS), our method can be deployed for various mechanistic and genomic studies focusing on skeletal muscle function.

We present a filtration-based protocol to isolate high-quality nuclei from cross-linked mouse skeletal muscle wherein we removed the need for ultracentrifugation, making it easily applicable. We show that chromatin prepared from the nuclei is suitable for chromatin immunoprecipitation and likely chromatin immunoprecipitation sequencing studies.

שיטה המבוססת על סינון של הכנת גרעינים באיכות גבוהה מן שריר השלד צולבות צולבות עבור Immunoprecipitation הכרומטין

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

שיטת Refolding יעילה וטיהור של ליגנד Chemoreceptor מחייב תחום

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

זיהוי של סובסטרטים קינאז CK2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall process costs. Alternative, cost-effective capture steps are therefore valuable for industrial-scale manufacturing, where large quantities of a single mAb are produced. Here we present a method for the immobilization of a DsRed-based epitope ligand to a cross-linked agarose resin allowing the selective capture of the HIV-neutralizing antibody 2F5 from crude plant extracts without using Protein A. The linear epitope ELDKWA was first genetically fused to the fluorescent protein DsRed and the fusion protein was expressed in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants before purification by immobilized metal-ion affinity chromatography. Furthermore, a method based on activated cross-linked agarose was optimized for high ligand density, efficient coupling and low costs. The pH and buffer composition and the soluble ligand concentration were the most important parameters during the coupling procedure, which was improved using a design-of-experiments approach. The resulting affinity resin was tested for its ability to selectively bind the target mAb in a crude plant extract and the elution buffer was optimized for high mAb recovery, product activity and affinity resin stability. The method can easily be adapted to other antibodies with linear epitopes. The new resins allow gentler elution conditions than Protein A and could also reduce the costs of an initial capture step for mAb production.

In this procedure, a DsRed-based epitope ligand is immobilized to produce a highly selective affinity resin for the capture of monoclonal antibodies from crude plant extracts or cell culture supernatants, as an alternative to Protein A.

הופעל מקושרת צולבת מקושרת לפיתוח מהיר של שרפים כרומטוגרפיה של אהדה-לכידת נוגדן כמחקר מקרה

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...