This research was funded by the Office of Naval Research through Core funds provided to the Naval Research Laboratory.

<ol>
	<li>Avila-Calderon, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+bacterial+membrane+vesicles.">Roles of bacterial membrane vesicles.</a> Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).</li><li>Kulp, A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+functions+and+biogenesis+of+secreted+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles.</a> Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).</li><li>Beveridge, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+Gram+negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles.">Structures of Gram negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> J. Bacteriol. 181, 4725-4733 (1999).</li><li>Kulkarni, H. M., Jagannadham, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+multifaceted+roles+of+outer+membrane+vesicles+from+Gram-negative+bacteria.">Biogenesis and multifaceted roles of outer membrane vesicles from Gram-negative bacteria.</a> Microbiology. 160, 2109-2121 (2014).</li><li>Ellis, T. N., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+and+immunomodulatory+roles+of+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74, 81-94 (2010).</li><li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery.">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environ. Microbiol. 15, 347-354 (2013).</li><li>Alves, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+nanobioreactors-directing+enzyme+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Bacterial nanobioreactors-directing enzyme packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 7, 24963-24972 (2015).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality.">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> J. Mol. Biol. 380, 51-66 (2008).</li><li>Haurat, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+sorting+of+cargo+proteins+into+bacterial+membrane+vesicles.">Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles.</a> J. Biol. Chem. 286, 1269-1276 (2011).</li><li>Kesty, N. C., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+heterologous+outer+membrane+and+periplasmic+proteins+into+Escherichia+coli+outer+membrane+vesicles.">Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles.</a> J. Biol. Chem. 279, 2069-2076 (2003).</li><li>Zakeri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+tag+forming+a+rapid+covalent+bond+to+a+protein,+through+engineering+a+bacterial+adhesion.">Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, e690-e697 (2012).</li><li>Li, L., Fierer, J. O., Rapoport, T. A., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+and+optimization+of+the+covalent+association+between+SpyCatcher+and+a+peptide+tag.">Structural analysis and optimization of the covalent association between SpyCatcher and a peptide tag.</a> J. Mol. Biol. 426, 309-317 (2014).</li><li>Dumas, D. P., Durst, H. D., Landis, W. G., Raushel, F. M., Wild, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+organophosphorus+nerve+agents+by+the+phophotriesterase+from+Pseudomonas-Diminuta.">Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phophotriesterase from Pseudomonas-Diminuta.</a> Arch. Biochem. Biophys. 277, 155-159 (1990).</li><li>Bigley, A. N., Raushel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+mechanisms+for+phosphotriesterases.">Catalytic mechanisms for phosphotriesterases.</a> Biochimica et Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 1834, 443-453 (2013).</li><li>Minton, N. A., Murray, V. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+organo-phosphate+poisoning.">A review of organo-phosphate poisoning.</a> Med. Toxicol. Adverse Drug Exper. 3, 350-375 (1988).</li><li>Bigley, A. N., Xu, C., Henderson, T. J., Harvey, S. P., Raushel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+neutralization+of+the+chemical+warfare+agent+VX:+Evolution+of+phosphotriesterase+for+phosphorothiolate+hydrolysis.">Enzymatic neutralization of the chemical warfare agent VX: Evolution of phosphotriesterase for phosphorothiolate hydrolysis.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 10426-10432 (2013).</li><li>Chatterjee, S. N., Chaudhuri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gram-negative+bacteria:+the+cell+membranes.">Gram-negative bacteria: the cell membranes.</a> Outer Membrane Vesicles of Bacteria. SpringerBriefs in Microbiology. , 15-34 (2012).</li><li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+OmpA+in+Escherichia+coli.">The function of OmpA in Escherichia coli.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 396-401 (2002).</li><li>Danoff, E. J., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+soluble,+periplasmic+domain+of+OmpA+folds+as+an+independent+unit+and+displays+chaperone+activity+by+reducing+the+self-association+propensity+of+the+unfolded+OmpA+transmembrane+beta-barrel.">The soluble, periplasmic domain of OmpA folds as an independent unit and displays chaperone activity by reducing the self-association propensity of the unfolded OmpA transmembrane beta-barrel.</a> Biophys. Chem. 159, 194-204 (2011).</li><li>Alves, N. J., Kline, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+on+the+inhibition+of+plasmin+and+delta-plasmin+via+benzamidine+derivatives.">Comparative study on the inhibition of plasmin and delta-plasmin via benzamidine derivatives.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 358-362 (2015).</li><li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilization+and+development+of+solid+protein+pharmaceuticals.">Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.</a> Int. J. Pharm. 203, 1-60 (2000).</li><li>Goormaghtigh, E., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density-based+separation+of+liposomes+by+glycerol+gradient+centrifugation.">Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation.</a> Anal. Biochem. 159, 122-131 (1986).</li><li>Alves, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalized+liposome+purification+via+Liposome+Extruder+Purification+(LEP).">Functionalized liposome purification via Liposome Extruder Purification (LEP).</a> Analyst. 138, 4746-4751 (2013).</li><li>Mayer, L. D., StOnge, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+free+and+liposome-associated+doxorubicin+and+vincristine+levels+in+plasma+under+equilibrium+conditions+employing+ultrafiltration+techniques.">Determination of free and liposome-associated doxorubicin and vincristine levels in plasma under equilibrium conditions employing ultrafiltration techniques.</a> Anal. Biochem. 232, 149-157 (1995).</li><li>Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-superpositive+GFP+reassembly+is+a+fast,+efficient,+and+robust+method+for+detecting+protein-protein+interactions+in+vivo.">Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo.</a> Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).</li><li>De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+the+interacation+of+two-stranded+de+novo+designed+coiled-coils:+effect+of+chain+length+on+the+kinetic+and+thermodynamic+constants+of+binding.">Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding.</a> Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).</li><li>Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-Intein+for+simultaneous+site-specific+conjugation+of+quantum+dots+to+multiple+protein+targets+in+vivo.">Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).</li><li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+proteomic+profiling+of+native+outer+membrane+vesicles+derived+fromEscherichia+coli.">Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli.</a> Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protecting+enzymatic+function+through+directed+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> Sci. Rep. 6, 24866 (2016).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+delivery+capabilities+and+challenges+utilizing+enzyme/protein+packaged+bacterial+vesicles.">Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles.</a> Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

פונקציות פרוטוקול זה להפגין נציג מכוון טכניקת אריזה שבה אנזים עניין מיוצר וארוז לתוך OMV ידי E. coli. כמו עם טכניקות מורכבות רבות ישנם אזורים מרובים, בם הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי להתאים לשימוש ביישומים ייחודיים שונים, שחלקם מפורטים להלן. בעוד מנגנון של אנקפסולציה האריזה אנזים OMV ניתן להתאים לצרכים הספציפיים ישנם מספר צעדים בתוך פרוטוקול זה אשר הם קריטיים להצלחתו. ההסרה הראשונית של חיידק שלם ופסולת הסלולר היא בעל חשיבות משמעותית תשפיע על כל הניסיונות במורד הזרם ב quantitation או ניתוח מדגם. שני צעדים צנטריפוגה רצופים ואחריו הסינון הוא בדרך כלל מספיק כדי להסיר מזהמים אלה. עם זאת, בכל טיפול במקרים יש לנקוט בעת פתרונות decanting לאחר צנטריפוגה כדי למזער העברת מזהמים. באופן דומה, o הגלולה הסופית OMVultracentrifugation הבא btained הוא לעתים קרובות רק דבק רופף התחתון של הצינור צנטריפוגות. בשלבים הסופיים, יש להקפיד בעת הסרת בינוני התרבות בילה על מנת להבטיח כי הגלולה נשארת באין מפריעה בחלק התחתון של הספינה. במקרה מסוים זה עשוי להיות טוב ביותר כדי לשמור על מדיום התרבות הסופי עד לאחר ניתוח מדגם באמצעות מכשיר DLS או מעקב ננו-חלקיקים על מנת להבטיח גלולת OMV לא נעלמה מעיניו של השלבים הסופיים של הפרוטוקול. להלן כמה חששות נוספים שעלולים להתעורר עם שני פרוטוקול המסוים הזה ואחרים המותאמות לצרכים הספציפיים של החוקרים. השימוש PTE במערכת זו מספקת עבור אנקפסולציה אנזים מודל מצוין עבור תיקון הסביבה של אזורים מזוהמים organophosphate עם PTE להיות להחלפה בקלות על ידי אנזים חלופי או חלבון של עניין. כפי שתואר כאן Coexpression של PTE-SC עם OmpA-ST הביאה לעלייה גדולה expressi PTE הכוללתעל וכן רמות ייצור שלפוחית ​​גבוהות עם יותר PTE שצריך לארוז בתוך השלפוחית ​​לעומת PTE והטוראי-SC הביע לבד. על ידי הפחתת מספר האינטראקציות בין הממברנה החיצונית ואת פפטידוגליקן דרך המחיקה C- מסוף של OmpA Hyper-vesiculation מושגת. זה מספק נתיב קל עבור חיידקים לייצא את PTE רקומביננטי, הממתנת את ההשפעות הרעילות כי הם נצפו לעתים קרובות ביטוי יתר של חלבונים שאינם ילידי הארץ. בעוד PTE ניתן להחליף בקלות במערכת מודל זה חשוב לציין שלא כל מצעי אנזים יעברו בחופשיות דרך bilayer OMV ועל כן הכרחי כי כל אנזים ייחודי זוג מצע להיבדק בכל מקרה לגופו. גם אם מצע אינו עובר דרך הממברנה טכניקה זו יכול עדיין להיות מנוצל כדי לייצר ולארוז אנזים לתוך OMV והוסיף טריטון X-100, או פעיל שטח חלופי הולם, ניתן להוסיף מספיק levels להתפקע השלפוחית ​​לפני השימוש. בהיעדר ביטוי חלבון רקומביננטי ואריזת פרוטוקול זה יכול לשמש גם שיטה בסיסית לייצור וטיהור OMV ממיני חיידקי מגוונים. שיטות חלופיות לטיהור OMV, כגון חלוקת שיפוע צפיפות 22, קרום סינון 23, ו-סינון אולטרה 24, קיימות גם ועלולות להיות טכניקות מתאימות יותר בהתאם ליישום המיועד. טכניקות טיהור חלופיות אלו יכולות גם להיות בתוספת בנקל בפרוטוקול זה במקום של pelleting ultracentrifugation של OMV עבור האריזה בבימויו של חלבון לתוך OMV וזאת באמצעות כלי הצמדה סינטתית biorthogonal. שינויים אחרים יכולים להתבצע למערכת ההצמדה הסינטתית הספציפית מנוצלת בפרוטוקול זה, כמו גם את חלבון קשירת קרום שנבחר. ישנן אסטרטגיות סינטטיות שונות עבור זיווג שני חלבונים שוניםהים בתוך מערכת ביולוגית הכוללים: חלבוני פיצול 25, סלילים מפותלים 26, ולפצל 27 inteins, רק לרשימה כמה. חלבונים בממברנה אחרים כבול או הטרנסממברני כגון OmpF ו OmpC יספקו סבירים עבור אתרי ST שינוי מתאימים גם 28. במקרים מסוימים זה יכול להיות גם צורך להחליף את ST ותחומי SC צבת SC על חלבון העיגון ואת ST הקטן בהרבה על האנזים / חלבון רקומביננטי. ישנם גם מספר אסטרטגיות שיבוט שונים שניתן ליישם כאן כוללים שימוש פלסמידים מרובים תחת מערכות אינדוקציה הזהות או שונות, פלסמיד אחד עם חלבונים מרובים מקודד, או אפילו תוך שימוש בטכניקות הומולוגיות לשלב את כל או חלקים של הביטוי המערכת לתוך הגנום של חיידקים. במיקרו-סביבה של OMV עוזר לייצב את האנזים ארוז צמצום איון האנזימטית המתרחשת כלל מתחת פחות אידיאלי stתנאי orage, ההפשרה להקפיא, ו lyophilization 29. זה צפוי גם כי OMV יספק עמידות משופרת מאוד כדי מחשוף פרוטאוליטים כמו bilayer OMV יתפקד כמחסום פיזי בין האנזים פעיל ואת החלבונים המצויים במרחב החוץ-OMV. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב עוד יותר לכלול פפטיד, מולקולה קטן חיצוני מול, או תג חלבון כדי להקל משלוח ממוקד של חלבונים וטיהור זיקה כמוסים OMV. בעוד PTE נבחר יישום ייחודי זה את התוצאות של מחקר זה, ואת התוכן של פרוטוקול זה, יכולים להיות מנוצלים בקלות לעצב אסטרטגיות אריזת חלבון מקבילות לשימוש משלוח תרופות מגוון, יישומים רפואיים אבחון, וטיפול סביבתי 30.

אנו מציגים כאן שיטה בעיצוב, ייצור, וטיהור של שלפוחית ​​הממברנה החיצונית חיידקי טעון אנזים (OMV). OMV הם קטנים, בעיקר unilamellar, proteoliposomes כי טווח בגודל 30-200 1,2 ננומטר. כל חיידקים גראם-שליליים גראם חיוביים כי נחקרו עד כה הוכיחו שחרור או OMV או שלפוחית תאיים (EV) מפני השטח שלהם 3,4. המנגנון המדויק שבו OMV מיוצר עדיין הובהר באופן מלא בשל אוכלוסיות חיידקים המגוונות אשר מפרישות אותם כמו גם את הפונקציות השונות, כי הם משרתים. OMV הוכח להובלת מגוון רחב של מטענים ממולקולות קטנות, פפטידים, חלבונים ו החומר גנטי מגיש מגוון רחב של איתות מורכבת, טרנסלוקציה גן, ארסיות מתפקדת 5,6. המנגנונים המדויקים של biogenesis OMV אינם מתאפיינים היטב, נראים שונה בין מינים של חיידקים. למרות תיהים למעשה, פתחנו שיטה לשיפור יעיל האריזה של חלבון רקומביננטי לתוך OMV ידי יצירת הצמדה סינטתית בין חלבון של עניין וכן אנדוגני חלבון הנפוץ ביותר בקרום החיצוני חיידקי OMV שלאחר מכן. בהיעדר זיקה סינטתית, או זיקה שולבה באופן מלאכותי, בין חלבון recombinantly הביע ואת OMV את יעילות האריזה הנצפית היא מאוד נמוכה 7. תוצאה זו היא צפויה כמו שילוב של חלבונים בתוך OMV גם מתרחשת דרך אנקפסולציה מקריות בדיוק ברגע של היווצרות OMV על פני השטח חיידקי או באמצעות אריזות בבימויו של המנגנונים אינם מובנים היטב. חלק ההצלחה נצפתה חלבוני אריזה פשוט דרך על ביטוי במרחב periplasmic המסתמך על אנקפסולציה מקרית אלא אריזה יעילה מאוד חלבון תלוי עם כמה חלבוני אריזה ביעילות גבוהה בהשוואה לאחרים הב- אינו לארוז בכלל 8-10. על ידי ניצול טכניקות ביולוגיה סינטתית משותפות חפשנו להנדס Escherichia coli (E. coli) לייצר בו זמנית, חבילה ומפרישי אנזים פעיל עניין לתוך OMV עוקף מגבלות ידע קיימות לגבי איך OMV נוצרת וכיצד מטען נבחר על-ידי החיידקים אריזה. לעניין יישום זה מערכת bioconjugation חלבון פיצול נבחרת ההצמדה הסינטתית בחירה כדי להקל אריזה כיוונית לתוך OMV. כפי שהשם מרמז מערכת bioconjugation חלבון פיצול מורכבת משני תחומים למקטע ומשלימים אינטראקציה זה עם זה. תחומי חלבון הפיצול שנבחרו לצורך פרוטוקול זה המכונה SpyCatcher (SC) ואת SpyTag (ST) התחום נגזרים פיברונקטין מחייב pyogenes סטרפטוקוקוס החלבון (FbaB) 11. מערכת חלבון פיצול זה הוא יוצא דופן בכך wתרנגולת שתי יחידות המשנה הן בתוך קרבת אג&quot;ח isopeptide יוצרת באופן ספונטני בין הפרוקסימלי אספרטית שאריות חומצת חומצה ליזין אמינו יצירת הצמדה קוולנטי. היווצרות קשר Isopeptide אינה דורשת תוספת של חלבונים מלווים, אנזימים קטליטי, או קו-פקטורים ויכולה להתרחש בקלות בטמפרטורת חדר (RT) על פני טווח רחב של מצבים רלוונטיים מבחינה הפיזיולוגית 12. כהוכחה מושג, phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) מ diminuta Brevundimonas נבחרה להיות ארוז לתוך E. coli נגזר OMV 13. PTE מכיל אתר binuclear Zn / Zn פעיל ויש לו את היכולת לשבור זרחנים אורגניים באמצעות תגובה הידרוליזה המרת aryldialkylphosphates לתוך dialkylphosphates ו כהלים aryl 14. חשיפה זרחנים אורגניים פוגעת בתפקוד העצבי הנכון דרך עיכוב הידרוליזה של אצטילכולין על ידי האצטילכולין בצמתים neuromuscular מאקיןתרכובות organophosphate נגזר g 15 מסוכן מאוד. ממושך או חשיפה משמעותית זרחנים אורגניים תוצאות נפוצות עוויתות בלתי נשלטת בדרך כלל גורם למוות באמצעות מחנק. בעוד PTE מציג את הפעילות הקטליטית הגבוהה ביותר כלפי paraoxon, דברה חזקה מאוד, הוא גם מסוגל hydrolyzing מגוון רחב של חומרי הדברה אחרות ו- V / G סוג גזי עצבים כימיים 16. כדי להקל על אריזת OMV, פלסמיד חיידקי תוכנן מקודד מבנה גן המכיל מקדם מושרה, רצף לוקליזציה periplasmic, ואתר שיבוט מרובה קצר במעלה זרם של רצף גן SC. החדרה של גן PTE בין מנהיג רצף SC מותר ליצירת מתג גנטי שמכוון את חלבון היתוך PTE-SC למרחב periplasmic לאריזת OMV. למרות שהמאמצים המתוארים כאן להתמקד PTE, גן האנזים הוא להחלפה יכול להיות מוחלף בקלות עם רצף גן אחר facאריזת ilitate של אנזים או חלבון חלופי. כמו החלק השני של ההצמדה הסינטתית, חלבון הממברנה חיצוני בשפע (OmpA) נבחר להציג את רצף הפפטיד ST. בעוד הבחירה של חלבון עוגן יכול להשתנות, זה הכרחי כי החלבון יש דומיין מתירנית המציג במרחב periplasmic, סובל את ההיתוך לבנות ללא גרימת cytotoxicity, ידוע להיות נוכח OMV, ואינו מצטבר כאשר הוא recombinantly מיוצר. OmpA הוא חלבון 37.2 kDa הטרנסממברני Porin כי ידוע להיות מבוטא בכמות גבוהה בקרום החיצוני בקטריאלי ולאחר OMV 17. הוא מעורב התחבורה של מולקולות קטנות, &lt;2 ננומטר בגודל, דרך הממברנה בקטריאלי 18. יש Native OmpA שני תחומים ייחודיים מבחינה מבנית, מוטיב חבית בטא הטרנסממברני וחלק periplasmically מסיס בטרמינל C-ידוע אינטראקציה עם 19 פפטידוגליקן. בשנות ה designe היתוך OmpA-ST מוטציהד כאן חלק מסוף-C של OmpA נמחק ואת ST היה התמזג N- periplasmically פונה או C-Termini. מחיקת חלק periplasmic של OmpA מקטינה את מספר האינטראקציות בין הממברנה החיצונית ואת פפטידוגליקן וכתוצאה מכך יציבות הממברנה מובילה Hyper-vesiculation 7. הגנום OmpA נשמרה בנוסף לבנות OmpA-ST הביע recombinantly להמתיק יציבות הממברנה ברוטו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="617">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">IPTG</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Always prepare fresh or aliquot and freeze.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">L-arabinose</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Can be prepared ahead of time and stored at 4C.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Chloramphenicol&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">TB/LB Culture Media</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Other growth medias will likely work similarly.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">One of many potential suitable surfactants.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Baffled culture flasks</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">The baffles promote higher levels of aeration.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">CHES</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:96px;">BP318-100</td>
			<td style="width:273px;">Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH &#62; 8).</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Paraoxon</td>
			<td style="width:93px;">Chem Service</td>
			<td style="width:96px;">N-12816</td>
			<td style="width:273px;">Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:155px;">Syringe Filter 0.45 &#181;m</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:96px;">60183-221&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (30 mm)</td>
			<td style="width:273px;">Filter diameter will depend on volume of sample.&#160; Low protein binding membrane is critical.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:155px;">Shaker incubator</td>
			<td style="width:93px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:96px;">Excella E24</td>
			<td style="width:273px;">Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Sorvall Culture Centrifuge</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:96px;">RC 5B PLUS</td>
			<td style="width:273px;">Large volume (500 mL) culture centrifuge capable of 7,000 x g.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Sorvall Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:96px;">WX Ultra 90</td>
			<td style="width:273px;">Capable of centrifugal forces &#8805;150,000 x g.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:155px;">Ultracentrifuge Rotor</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:96px;">AH-629</td>
			<td style="width:273px;">Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:155px;">Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (25 x 89 mm)</td>
			<td style="width:93px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:96px;">344058</td>
			<td style="width:273px;">Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Spectrophotometer&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Tecan</td>
			<td style="width:96px;">Infinite M1000</td>
			<td style="width:273px;">Necessary for enzyme kinetic assays.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">DLS / particle tracking</td>
			<td style="width:93px;">NanoSight&#160;</td>
			<td style="width:96px;">LM10</td>
			<td style="width:273px;">Necessary for OMV size distribution and concentration determination.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">BL21(DE3)</td>
			<td style="width:93px;">NEB</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Suitable bacterial expression strain.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">pET22</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:96px;">69744-3</td>
			<td style="width:273px;">Other plasmids can be used in place of these.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">pACYC184</td>
			<td style="width:93px;">NEB</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Other plasmids can be used in place of these.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:93px;">Qiagen</td>
			<td style="width:96px;">28704</td>
			<td style="width:273px;">Example kit.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed protein packaging within outer membrane vesicles from escherichia coli: design, production and purification

עניין גובר יישום טכניקות ביולוגיה סינטטיות לתכנת שלפוחית ​​קרום חיצונית (OMV) מוביל כמה יישומים מעניינים וייחודיים מאוד עבור OMV שבו חלקיקים מסורתיים מוכיחים קשים מדי לסנתז. נכון להיום, כל חיידקים גראם שליליים הוכחו לייצר אריזות הוכחת OMV של מגוון מטענים הכוללת מולקולות קטנות, פפטידים, חלבונים החומר הגנטי. בהתבסס על המטענים המגוונים שלהם, OMV הם מעורבים בתהליכים ביולוגיים רבים, החלו מתקשורת תאי תאים כדי העברת גנים ואספקה ​​של גורמים ארסיים התלויים בו חיידקים מפיקים את OMV. רק לאחרונה חיידקי OMV להיות נגיש לשימוש על פני מגוון רחב של יישומים באמצעות פיתוח טכניקות לשלוט ואריזה ישירה של חלבונים רקומביננטיים לתוך OMV. פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור, טיהור, ושימוש OMV ארוז אנזים מתן השתפר overaייצור ll של אנזים רקומביננטי, vesiculation גדל, ויציבות אנזים משופר. ניצול מוצלח של פרוטוקול זה יגרום ליצירת זן חיידקים אשר בו זמנית מייצר חלבון רקומביננטי ומפנה אותו אנקפסולציה OMV באמצעות יצירת זיקה סינטתית בין חלבון רקומביננטי חלבון עוגן הממברנה חיצוני. גם פרוטוקול זה מפרט שיטות לבידוד OMV מתרבויות חיידקים כמו גם טכניקות טיפול הולמות ודברים שיש להביא בחשבון בעת ​​התאמת פרוטוקול זה לשימוש עבור יישומים ייחודיים אחרים כגון: משלוח סמי תרופות, אבחון רפואי, וטיפול סביבתי.

ביטוי סימולטני של שני חלבונים רקומביננטיים, כפי שנדרש לצורך אסטרטגית אריזת OMV המפורטים בפרוטוקול זה, ניתן להשיג באמצעות מספר דרכים שונות. כאן, מערכת וקטור שני נוצלה עם מקורותיה התואמים של שכפול קלטות גן מושרים נפרדות. על מנת לתת הביטוי של PTE-SC לבנות עמוד שדרת פלסמיד המסחרי (pACY184) תוכנן לכלול קלטת גן arabinose מושרה ו תאום ארגינין רצף מנהיג לוקליזציה periplasmic ואחריו שורה של אתרי הגבלה ייחודיים כדי להקל שיבוט של גן האנזים בתור היתוך חלבון SC C-terminal. הבונה פלסמיד המקודד את החלבון עוגן הקרום החיצוני הוא pET22 וקטור מסחרי אשר מנצל את אופרון הלקטוז לבקרה של ביטוי חלבון ואת רצף לוקליזציה pelB periplasmic. רצף ST קצר שובט לתוך חלבון OmpA קטום לפני insertion לתוך פלסמיד ביטוי. בשני פלסמידים, רצף hexahistidine מסוף-C נשמר כדי לאפשר זיהוי סימולטני של חלבוני ההיתוך בדגימות OMV. בנייה ואפיון של מבנים גן אלה, כולל הן את המבנים היתוך N- ו- C- מסוף ST כדי OmpA, מתוארים באופן מלא אלבס et al. 7. קונסטרוקציות הגן המתוארות כאן לא יכולות להיות תורמות את כל האריזות של האנזימים. במקרים מסוימים ייתכן שיהיה צורך לשנות את אות לוקליזציה periplasmic, אלמנטים רגולטוריות, או את תגיות epitope. בנוסף, כמה חלבונים עשויים להיות גדולים להחריד ולא מסוגלים רוחביים את הקרום הפנימי לגמרי. הפעילות האנזימטית ויעילות האריזה OMV לא ניתן לקבוע מראש ויהיה צורך לקבוע באופן אמפירי עבור כל חלבון המטרה. להלן תוצאות שאחד בדרך כלל היה לצפות לאחר o נושאת בהצלחהut בפרוטוקול זה. כולל הוא סכימטי של תחומי חלבון השני ST / SC המפוצל, OmpA-ST ואיחוי PTE-SC בונה וכן דוגמא של היווצרות isopeptide על הממברנה החיצונית חיידקי אנקפסולציה הבאה של PTE-SC בתוך OMV (איור 1) . כמו כן, נכללים תוצאות נציגי מורפולוגיה OMV מטוהר באמצעות SEM וכן התפלגות גודל וריכוז OMV מוחלט נקבע באמצעות תוכנת מעקב חלקיקים (איור 2). אפיון נוסף של תכולת חלבון OMV ביטוי חלבון רקומביננטי נתפס באמצעות SDS-PAGE ו כתם מערבי (איור 3). משקולות מולקולרית של חלבונים של עניין ספציפי לפרוטוקול המובאים כאן הם כדלקמן: OmpA הילידים (37.2 KDA), OmpA-ST (23 KDA), PTE-SC (51 KDA), OmpA-ST / PTE-SC (74 KDA) . מטוהרי OMV צריך להקה בחושך ב כ 37 kDa וזה מעיד על OmpA יליד בהיקף הנרחב ביותר. בהתאם לרזולוצית ג&#39;ל ייתכנו ba המרובהnds הנוכחי באזור זה של הג&#39;ל כמו OmpA, OmpF ו OmpC כולם בשפע יחסית ולשתף משקל מולקולרי דומה. להקה נוספת שהוא פי 2.2 kDa גדול יותר OmpA-ST עשוי להיות גם ציין עקב מחשוף לא תקין של רצף המנהיג כתוצאת מכריע מכונה ביטוי E. coli. חשוב לציין כי מדגם OMV מטוהר בהצלחה לא יהיה הרבה חלבונים אחרים מבוטאים בכמות גבוהה. אם להקות אחרות נוכחות גם הטיהור בוצעה כהלכה או חיידקי זן מנוצלים ניתן חלבוני אריזה אחרים לא נצפו זה BL21 E. coli (DE3) זן. יתר על כן, מבחני פעילות וניסויים קרע שלפוחית סופקו להפגין תוצאות נציג שניתן היה לצפות אם המצע האנזימטית יכול באופן חופשי להיכנס OMV באמצעות חלבונים Porin הטרנסממברני (איור 4). Paraoxon יחסית בחופשיות נכנסהOMV באמצעות חלבונים Porin הטרנסממברני אנדוגני להגיב עם PTE ארוז המוצר התגובה, p -nitrophenol, גם עובר יחסית בחופשיות דרך קרום OMV. תופעה זו לא תהיה בכל מקום בין כל המוצר, המצע, וערכות האנזים חייב להיקבע באופן ניסיוני. למרות שחרורו קרע ואנזים מוצלחים OMV כבר ראו עם ריכוזים נמוכים של חומרי ניקוי PTE (להלן טריטון X-100), תוספות עשויות להשפיע על הפעילות של אנזימים אחרים. מפות פלסמיד גם נכללו כדי להדגים את העיצוב של אסטרטגית אריזת שני פלסמיד ניצול SC / מערכת ST (איור 5). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54458/54458fig1.jpg" /> איור 1: אריזת בימוי של חלבונים לתוך OMV. מבנים גבישיים עבור החלבונים מנוצלים strat אריזת OMV תארEGY: OmpA, PTE, SpyTag (ST) ו SpyCatcher (SC); PDB: 2GE4, 1PTA, 4MLI, 4MLI, בהתאמה. ייצוג סכמטי של מבני היתוך OmpA-ST והטוראי-SC ויוצרים אג&quot;ח isopeptide על הממברנה החיצונית של החיידקים מוצג. היתוך קרום זה שמניע התאגדות של PTE בתוך OMV הטביעה. איור לשכפל (מותאם) מאל et אלבס. ACS Appl Mat ממשקים (2015), 7 (44), עמ &#39;24,963-24,972 7. זכויות יוצרים 2015 האגודה האמריקנית לכימיה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54458/54458fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54458/54458fig2.jpg" /> איור 2: אפיון OMV. (א) SEM של ultracentrifuge מטוהרים OMV מן החיידק הילידים [BL21 (DE3)]. (ב) טראק חלקיקים נציג<html> המלך הפצות גודל ו- (ג) ריכוז שלפוחית הכולל בממוצע לכל 90 שניות מדגם קורא עבור Native OMV, PTE-SC בהעדר ההפעלה arabinose (PTE-No A), PTE-SC בנוכחות ההפעלה arabinose (PTE-A) , טרנספורמציה שיתוף OmpA-ST N-terminal עם-SC PTE בנוכחות arabinose והפעלה IPTG (PTE / OMV-N), ואת supernatant ultracentrifuge (UC supernatant). עלייה משמעותית בייצור OMV נצפתה במדגם PTE / OMV-N לעומת OMV Native וטוראי-SC בונה לבד. OMV כומתו ב supernatant UC להפגין התאוששות מלאה כמעט של OMV גלולה UC עוזב לא מעט על מנת OMV ב ultracentrifugation פוסט supernatant. כל הנתונים מייצגים אמצעי (± סטיית תקן) של ניסויים בשלושה עותקים. איור לשכפל (מותאם) מאל et אלבס. ACS Appl Mat ממשקים (2015), 7 (44), עמ &#39;24,963-24,972 7. זכויות יוצרים 2015 האגודה האמריקנית לכימיה.ד / 54458 / 54458fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54458/54458fig3.jpg" /> איור 3: קביעת תכולת חלבון המטוהר OMV. (א) SDS-PAGE של גלולת OMV UC המטוהרת של ההיתוך בטרמינל C-OmpA-ST coexpressed עם-SC PTE (PTE / OMV) לבנות הוכחת שפע נציג OmpA-ST, Native OmpA, PTE-SC ואת OmpA- ST / PTE-SC היתוך isopeptide. (ב) ניתוח כתם מערבי ניצול ההווה שלו-התג הכלול OmpA וטוראי בונה כדי להקל להדמיה באמצעות נוגדן אנטי 6xHis. חשוב לציין כי PTE ידוע dimerize, כפי שמעיד על הכתם על ידי הנוכחות של משקל מולקולרי גדול מינה-tagged. למרות שישנם מאוד גבוהות רמות ביטוי OmpA-ST נצפו אין המרה מלאה של בחינםPTE-SC קרום כבול OmpA-ST / PTE-SC. למרות זאת, העלייה בייצור PTE הכולל ויעילות שיפור באריזה מראה כי בעוד היווצרות קשר קוולנטי היא לא נמצא בכל מקום העמותה הלא קוולנטיים של ST ותחומי SC היא גורם חשוב באריזה מכוונת בתוך OMV. איור לשכפל (מותאם) מאל et אלבס. ACS Appl Mat ממשקים (2015), 7 (44), עמ &#39;24,963-24,972 7. זכויות יוצרים 2015 האגודה האמריקנית לכימיה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54458/54458fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54458/54458fig4.jpg" /> איור 4: פעילות PTE ואפיון האריזה. (א) PTE בסך הכל רמות הביטוי ויעילות האריזה OMV נקבע באמצעות מדידות מהירות התחלתית ניצול סעיףOxon כמו מצע chromogenic השוואת ההווה PTE של כדורי תא, supernatant UC, ואת כדורי UC OMV מטוהרים. (ב) נציגי נתונים הוכיחו את השימוש טריטון X-100 (0.5% T100) לשבש את bilayer OMV המאפשר גישה ללא הפרעה של מצע אל OMV הפנים. השוואת נתונים אלה מבחנים שבוצעו בהעדר T100 מקלה אימות של טרנסלוקציה של מצע ברחבי bilayers שלמי OMV אם מירויות ראשוניות האנזימטית הן ללא שינוי. במקרה של paraoxon היה הבדל פעילות מעט מאוד שנצפתה קיומו או אי קיומו של T100 המציין paraoxon עובר בחופשיות דרך נקבוביות אנדוגני על OMV. (C) PTE-SC בכושר נתונים הקינטית משוואה קינטיקה אנזימטית תקן מיכאליס-מנטן עבור PTE / OMV-N וטוראי-A. (ד) ניתוח Lineweaver-בורק המשמש לקביעת K M וחתול k / K M (48, 4.4 x 10 7; 44 מיקרומטר, 4.9 x10 7 שניות -1 M -1, בהתאמה) הוכחת פרמטרים קינטיים ספרות PTE דומים כמו אנזים הילידים (90 מיקרומטר, 2.7 x 10 7 שניות -1 M -1) עם R 2 ≥ 0.999 בכל המקרים. כל הנתונים מייצגים אמצעי (± סטיית תקן) של ניסויים בשלושה עותקים. איור לשכפל (מותאם) מאל et אלבס. ACS Appl Mat ממשקים (2015), 7 (44), עמ &#39;24,963-24,972 7. זכויות יוצרים 2015 האגודה האמריקנית לכימיה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54458/54458fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54458/54458fig5.jpg" /> איור 5: בונה פלסמיד נציג למערכת הדוגמה המתוארת כאן. אנזים-SC שונה SpyCatcher (PTE-SC) פלסמיד ממוקד עבור אנקפסולציה בתוך OMV (משמאל). SpyTag modifקרום מטען עוגן-ST (OmpA-ST-N) פלסמיד (מימין). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54458/54458fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification at JoVE.com

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ<em&gt; Coli Escherichia</em&gt;: עיצוב, ייצור טיהור

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

directed-protein-packaging-within-outer-membrane-vesicles-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

13.3K Views.  Naval Research Laboratory. A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented. 

Video: Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

בידוד של קומפלקסים RNA חלבון מאותו מקור מתאי שימוש Elution oligonucleotide מכוונת

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

ייצור בקנה מידה גדול של RNAs רקומביננטי על גרדום מעגלית באמצעות מערכת נגזר וירואיד ב- Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic acid (sRNA) molecules and target messenger RNAs (mRNAs). In addition, site-directed mutagenesis is used to map specific protein binding sites to RNA. A 2-step and 3-step PCR based introduction of mutations is described. The approach is relevant to all protein-RNA and RNA-RNA interaction studies. In short, the technique relies on designing primers with the desired mutation(s), and through 2 or 3 steps of PCR synthesizing a PCR product with the mutation. The PCR product is then used for cloning. Here, we describe how to perform site-directed mutagenesis with both the 2- and 3-step approach to introduce mutations to the sRNA, McaS, and the mRNA, csgD, to investigate RNA-RNA and RNA-protein interactions. We apply this technique to investigate RNA interactions; however, the technique is applicable to all mutagenesis studies (e.g., DNA-protein interactions, amino-acid substitution/deletion/addition). It is possible to introduce any kind of mutation except for non-natural bases but the technique is only applicable if a PCR product can be used for downstream application (e.g., cloning and template for further PCR).

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in deoxyribonucleic acid (DNA). This protocol describes how to do site-directed mutagenesis with a 2-step and 3-step polymerase chain reaction (PCR) based approach, which is applicable to any DNA fragment of interest.

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

אפיון מובילי הממברנה על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli וייצור ממברנה ושלפוחיות

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the dissection and manipulation of biological pathways. Currently, only a limited number of chemically induced dimerization (CID) systems exist and engineering new ones with desired sensitivity and selectivity for specific small-molecule ligands remains a challenge in the field of protein engineering. We here describe a high throughput screening method, combinatorial binders-enabled selection of CID (COMBINES-CID), for the de novo engineering of CID systems applicable to a large variety of ligands. This method uses the two-step selection of a phage-displayed combinatorial nanobody library to obtain 1) &#34;anchor binders&#34; that first bind to a ligand of interest and then 2) &#34;dimerization binders&#34; that only bind to anchor binder-ligand complexes. To select anchor binders, a combinatorial library of over 109 complementarity-determining region (CDR)-randomized nanobodies is screened with a biotinylated ligand and hits are validated with the unlabeled ligand by bio-layer interferometry (BLI). To obtain dimerization binders, the nanobody library is screened with anchor binder-ligand complexes as targets for positive screening and the unbound anchor binders for negative screening. COMBINES-CID is broadly applicable to select CID binders with other immunoglobulin, non-immunoglobulin, or computationally designed scaffolds to create biosensors for in vitro and in vivo detection of drugs, metabolites, signaling molecules, etc.

Creating chemically induced protein dimerization systems with desired affinity and specificity for any given small molecule ligand would have many biological sensing and actuation applications. Here, we describe an efficient, generalizable method for de novo engineering of chemically induced dimerization systems via the stepwise selection of a phage-displayed combinatorial single-domain antibody library.

יצירת חלבון מאוד ספציפי הנגרמת כימית מערכות דימריזציה על ידי בחירת בחירה באמצעות מבחר של קומבינטורית מתחם יחיד בספריית הנוגדן

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen's Eggs

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. It is formed by two proteinaceous sublayers that are tightly associated and formed by distinct female reproductive organs. Both structures are assumed to have their own functional specificities, which remain to be defined. To characterize the function of proteins composing each sublayer, the first challenge is to establish the conditions that would allow for the mechanical separation of these two intricate layers, while limiting any structural damage. The second step is to optimize the experimental conditions to facilitate protein solubilization from these two sublayers, for subsequent biochemical analyses. The efficiency of this approach is assessed by analyzing the protein profile of each sublayer by Sodium Dodecyl Sulfate-Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), which is expected to be distinct between the two structures. This two-step procedure remains simple; it requires classical biochemical equipment and reagents; and is compatible with further in-depth proteomics. It may also be transposed to other avian eggs for comparative biology, knowing that the structure and the composition of the perivitelline layer has been shown to have species-specific features. In addition, the non-denaturing conditions developed for sublayers separation (step 1) allow their structural analyses by scanning and transmission electron microscopy. It may also constitute the initial step for subsequent protein purification to analyze their respective biological activities and 3D structure, or to perform further immunohistochemical or functional analyses. Such studies would help to decipher the physiological function of these two sublayers, whose structural and functional integrities are determinant criteria of the reproductive success.

This article reports a simple method to isolate the outer and inner perivitelline sublayers of chicken eggs while minimizing structural alteration and to optimize protein solubilization of each sublayer for proteomic analyses.

הפרדה מכנית וסלוביליזציה של חלבון של שכבות המשנה החיצוניות והפנימיות של פריוויטלין מביצי חן

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. ...

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית מ