The authors thank Ms.Alisha Knudson for the editorial help. They would also like to acknowledge the financial support from the NIH/NCI (3R01CA115483, to K.S.L.), the DoD PRMRP Award (W81XWH-13-1-0490, to K.S.L.), the NIH/NCI (1R01CA199668, to Y.L.), and the NIH/NICHD (1R01HD086195, to Y.L.).

윤리 문 : 여성 무 흉선 누드 마우스 (민 / 뉴 주) 6-8 주령은 구입 후 AAALAC 지침에 따라 무균 상태에서 보관하고 실험하기 전에 적어도 4 일 동안 순응시켰다되었다. 모든 동물 실험은 기관의 지침에 따라 수행 캘리포니아 데이비스 대학의 동물 사용 및 관리 관리 자문위원회에 의해 승인 된 프로토콜 번호 07-13119 호 및 제 09-15584에 따라되었다. TD PEG 5K -Cys 1. 합성 4 -Ebes 8 -CA (8) <ol><li> 둥근 바닥 플라스크에, 얼음에 무수 디메틸 포름 아미드 (DMF) 및 냉기의 10 ~ 20 ml의 MEO-PEG 5K -NH 2 (2g, 0.4 밀리몰)을 녹인다. </li><li> 유리 비이커에 3 당량을 용해. 1- 히드 록시 -6- 클로로 - 벤조 트리아 졸, 벤조 트리아 졸 (HOBt), 3 당량의. N의 N &#39;이소 프로필 카보 다이이 미드 (DIC), 3 당량. 무수 D에서의 (FMOC) 2리스-OHMF (10-15 mL)을 첨가 하였다. 자기 볶음 접시에 15 ~ 20 분 동안 교반한다. </li><li> 메오 5K-PEG -NH 2. 얼음 욕을 제거하고 실온에서 밤새 반응 혼합물을 교반 함유하는 반응 플라스크에 혼합물을 추가한다. </li><li> 박막 크로마토 그래피 (TLC) 16 카이저 테스트 (17), 반응의 완료를 확인 (황색 무연 NH 2의 부재를 나타낸다). 반응 플라스크에 빙냉 에테르 약 200 ml에 첨가하여 중합체 생성물 1 (MEO 5K-PEG -Lys (NH-FMOC)를 2) 침전물. 원심 분리를 통해 침전 된 폴리머 (6 6,000 XG에 분, 4 ° C)를 분리합니다. <ol><li> TLC를 수행 실리카겔 코팅 TLC 플레이트 상에 시료를 발견. 디클로로 메탄 / 메탄올을 사용하여 (9 : 1)을 이동상으로서. TLC 판을 개발 한 후 UV 램프 아래 지점을 관찰한다. 하나는 핫 플레이트 아민 반점을 가시화 염색 시약을 닌히 드린 사용할 수있다. </li><li> 카이에 대한산이의 테스트는, 카이저의 시약을 포함하는 유리 튜브의 샘플을 조금 넣습니다. 5 분 동안 100 ℃에서 가열 한 상기 색상 변화 (용액의 색이 노란색 남아있는 경우, 다음 반응이 완료 될 때)을 찾는다. </li></ol></li><li> 무수 DMF (10-20 mL) 중의 생성물을 재용 해하고, 침전 및 원심 분리를한다 (단계 1.4 참조)를 반복한다. </li><li> 다음 반복 단계 1.5 및 빙냉 에테르 중합체 침전물을 세 번 세척 하였다. </li><li> 깨끗한 반응 플라스크에 폴리머 석출 한 전송 잔류 에테르를 제거 고진공 소스로 플라스크를 연결한다. </li><li> 준비하고 20 %의 약 20 ~ 30 ml에 추가 (v / v)의 DMF 4 메틸 피 1 중간을 중합체. 완전히 용해 될 때까지 저어. 3 시간 동안 반응을 실행합니다. </li><li> TLC 16 수행하고 황제의 시험 (청색 무료 NH 2의 존재를 확인) (17) (단계 1.4 참조) completio을 확인합니다반응 없음. 반응이 완료되면 제품 1 (1.4-1.6 단계)에 대해 언급 한 바와 같이, 에테르 침전를 진행합니다. </li><li> 고분자 제품 2 (MEO-PEG 5K -Lys (NH 2) 2) 진공에서 건조. </li><li> (1.1-1.7 단계) 제품 3을 생성하는 중간 2 상 (FMOC) 2리스-OH 결합 하나 더 라운드를 수행 (MEO-PEG 5K -Lys (리스 (NH-FMOC) 2) 2). (1.8-1.10 단계)를 FMOC 그룹 (4, MEO-PEG 5K -Lys (리스 (NH 2) 2) 2) 커플 (FMOC)리스 (BOC) (1.1-1.7 단계) -OH로 드 보호 3 세대 수지상 폴리 라이신 생성 (5, MEO-PEG 5K -Lys-리스 2 - ((FMOC)리스 (BOC)) 4) PEG 사슬의 한쪽 끝에서 네 BOC 및 FMOC 그룹이 종료되었습니다. </li><li> 반응 플라스크에 중간체 얻어진 중합체 5 옮긴다. 에서와 같이디클로로 메탄 (DCM)에서 1 (v / v)의 트리 플루오로 아세트산 (TFA) : eparate 반응 플라스크 1을 준비합니다. 폴리머 (5) 중간에 1 TFA / DCM (v / v)의 혼합물 : 1의 15 ~ 20 ML을 추가합니다. 중합체가 완전히 용해 될 때까지 혼합물을 교반한다. 추가로 3 시간 동안 교반한다. </li><li> TLC 16 카이저의 수행 및 시험 반응 종료를 확인하기 위해도 17의 (단계 1.4 참조) (청색 무연 NH (2)의 존재를 확인한다). 반응이 완료되면 점성 용액이 얻어 질 때까지 공기와 중합체 인 TFA / DCM 혼합물을 증발시켰다. 제품 1 (1.4-1.6 단계)에 대해 언급 한 바와 같이, 에테르 침전를 진행합니다. 진공에서 - (((FMOC)리스 (NH 2)) 4 -Lys-리스 2 MEO-PEG 5K) 고분자 제품 (6)을 건조. </li><li> 반응 플라스크에 6 중간 전사 중합체. 8 당량을 포함하는 무수 DMF의 약 40 ml를 사용합니다. N의 N의 -diisopropylethylami네브라스카 (DIEA)는 폴리머 (6) 중간을 용해한다. 유리 비이커에, 12 당량을 용해. 의 HOBt, 12 당량. DIC, 12 당량의. 무수 DMF의 20 ~ 25 ml의의의 (FMOC) 시스테인 (트리트) -OH. 10 ~ 15 분 동안 진탕 한 후 (6)을 함유하는 반응 플라스크에 반응 혼합물을 추가한다. 밤새 반응을 실행합니다. </li><li> TLC (16)와 카이저의 시험과 반응의 완료를 확인합니다 (단계 1.4 참조; 황색 무료 NH 2의 부재를 나타내는) 17. ((FMOC) 라이신 - - ((FMOC) Cys 또는 반응이 완료되면 제품 1 (단계 1.4-1.6)에 대해 언급 된 바와 같이, 제품 7 (MEO 5K-PEG -Lys-리스 2 분리, 에테르 침전 진행 (트리트))) 4. </li><li> 제품 8 얻기 위해, 단계 1.8에 설명 된대로, 7 FMOC 탈 보호를 수행합니다 (- (리스 (NH 2) - PEG 5K -Lys-리스 2 (시스테인 (NH 2) (트리트을))) 4). 커플 (FMOC) -PEG 2 -Suc-OH ( &quot;Ebes&quot;링커, 24 당량.)를의 HOBt에 대해 위에서 설명 된 절차를 사용하여 중간 고분자 / DIC 매개 커플 링에 중간 9 (MEO-PEG 5K -Lys-리스 2 -Lys 4 얻기 - (시스테인 (트리트을) ) 4 (Ebes (NH-FMOC)) 8). </li><li> 중간 10 얻을 수 FMOC 탈 보호 한 번 더 라운드 (1.6-1.8 단계) 수행 (MEO-PEG 5K -Lys-리스를 2 -Lys 4 - (시스테인 (트리트)) 4 (Ebes (NH 2)) 8). </li><li> 반응 플라스크에 폴리머 중간층 (10)을 전송하고 용해 무수 DMF (30-40 ml)로 추가한다. 또 다른 반응 플라스크에서 24 당량을 용해. 무수 DMF에 (이전에 게시 된 절차에 따라 제조) CAOSu (20 ~ 30 ㎖) 18. 48 당량을 추가합니다. 및 N, N- 디 이소 프로필 에틸 아민으로는 10 ~ 15 분 동안 교반 할 수 있습니다. 10을 함유하는 반응 플라스크에 콘텐츠를 전송하고, 반응 런 O하자vernight. </li><li> TLC 16 카이저의 테스트로 반응 종료를 확인하고 (단계 1.4 참조, 황색 무연 NH 2의 부재를 나타내는) 17. (Cys이고 (트리트)) 4 -Ebes - 반응이 완료되면 제품 1 (1.4-1.6 단계) 제품 (11)을 분리 (MEO 5K-PEG -Lys-리스 2 -Lys 4 바와 같이, 에테르 침전 진행 8 -CA 8). 탈 이온수를 투석하고, 백색 분말을 수득 샘플을 동결 건조. </li><li> 반응 플라스크에 중간 폴리머 (11)를 놓습니다. 준비하고 고분자 용액에 TFA / 1,2- 에탄 (EDT) / 트리 에틸 실란 (TIS)의 20 ㎖ / H 2 O (94 / 2.5 / 1 / 2.5, v / v)의 혼합물을 추가합니다. 완전히 용해 될 때까지 혼합물을 저어. 4 시간 동안 반응을 실행합니다. TLC (16)에 의해 반응 종료를 확인한다. </li><li> 흄 후드 아래에 공기를 불어 폴리머 TFA / EDT / TIS / H 2용액까지 O 혼합물의 점성이된다. 제품 1 (1.4-1.6 단계)에 대해 언급 한 바와 같이 최종 제품, 12 (PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8)를 분리, 에테르 침전를 진행합니다. 아세토 니트릴에 용해하고, 백색 분말을 수득하여 동결 건조. </li></ol> PTX로드 미셀 2. 준비 <ol><li> 표준 증착 방법을 사용하여 PTX로드 PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 미셀을 준비합니다. <ol><li> 클로로포름 1 ㎖ (클로로포름)에서 PTX의 다른 양 (1-9 mg)을 함께 TD 20 mg을 녹이고. 균질 건조한 중합체 필름을 수득하는 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거한다. 필요한 경우 약물로드 미셀의 형성을 허용하도록, 40 kHz에서 30 분 동안 초음파 처리 하였다 와류에 의한 인산 완충 용액 (PBS) 1 ㎖로 필름을 재구성한다. </li><li> 3 %의 (w / w) H 2 O 2 (1 당량 6 μl를 추가합니다. 호텔 fr하기TD를에 티올기를 산화) 티올기를 EE. 엘만 (Ellman) 테스트 (19)에 의해 지시 된 바와 같이 유리 티올 그룹의 레벨이 일정하게 낮은 값으로 유지되면 추가 특성에 대한 미셀 솔루션을 사용합니다. </li><li> 샘플을 살균 할 수있는 0.22 μm의 필터 솔루션을 필터링합니다. 9 번 아세토 니트릴을 첨가하고, 초음파 처리를 10 분간 수행하여 미셀의 약물 방출 후 HPLC 시스템 (20)의 미셀에로드 된 약물의 양을 분석한다. 이동상으로 아세토 니트릴 / 물 HPLC의 C18 컬럼을 사용합니다. </li><li> HPLC로 면적 값과 11 표준 약물 농도의 검량선에 따라 약물 로딩을 계산한다. 주 : 적재 효율이 초기 약물 함량 미셀에로드 약물의 비율로 정의된다. </li></ol></li></ol> 미셀 3 요소 특성 분석 <ol><li> 제 m의 크기 및 크기 분포를 측정동적 광산란 (DLS) 악기 (29)와 icelles. 실온에서 측정을 수행하고 ㎖ / 1 밀리그램의 미셀 농도를 유지한다. 주 : 입자 크기 분석을 수행 빈으로 PBS를 사용하고 실제 샘플 입자 크기를 기록한다. 샘플에 대한 세중의 측정을하고 측정 값을 평균. </li><li> 이전에 13,21 바와 같이, 이전과 소수성 형광 프로브로 피렌와 가교 후 PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA (8)의 임계 미셀 농도 (CMC)을 측정하는 형광 스펙트럼을 사용합니다. 참고 : 일반적으로, 미셀 농도는 5 × 10-7 5 × 10 -4 M. 범위 </li></ol> 또는 환원제없이 SDS에서 미셀 4. 안정성 <ol><li> 소듐 도데 실 설페이트 스톡 용액 (SDS) 용액 (7.5 ㎎ / ㎖) 및 PBS에서 이황화 가교 미셀 (1.5 ㎎ / ㎖)을 준비한다. 다음, U를최종 SDS 농도로 된 혼합 용액을 상기 원액을 2.5 ㎖의 노래 밀리그램 / 및 미셀 농도가 1.0 ㎎ / ㎖이다. </li><li> 또는 10 mM의 글루타치온 (GSH)의 존재없이 소정의 시간 간격으로 미셀 용액 (단계 3.1에서 언급 한 바와 같이) 크기 및 크기 분포를 측정한다. </li></ol> 5. 용혈 분석 <ol><li> 로부터 수집 이전에 발행 절차 (11)와 누드 마우스에서 신선한 구연산 혈액을 사용하여 PTX-로드 가교 미셀 (PTX-된 DCM)에 따라 제조 PTX-로드, 비 가교 미셀 (PTX-NCMs)의 용혈성 잠재력을 평가 꼬리 베일. <ol><li> 2 %의 최종 농도로 PBS로 세포 펠렛을 다시 정지 후, 10 분간 1,000 XG에서 혈액 샘플 (1.0 mL)을 원심 분리하여 적혈구를 모아서 PBS로 세 번 세척하고. </li></ol></li><li> 서로 다른 농도 (0.2 및 1.0 적혈구 현탁액 200 μl를 혼합mg의 PTX-NCMs 및 PTX-된 DCM,의 / ㎖)을 각각 및 인큐베이터 통에 37 ° C에서 4 시간 동안 배양한다. </li><li> 5 분 동안 3,000 XG에서 미셀 적혈구 혼합물을 원심 분리기. 96 웰 플레이트의 모든 샘플의 상등액 100 ㎕를 옮긴다. 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 540 nm에서 상층 액의 헤모글로빈의 흡광도를 측정한다. 주 : 트리톤-100 (2 %) 및 PBS와 함께 배양 된 RBC를 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용하여야한다. 적혈구의 퍼센트 용혈는 다음과 같은 공식으로 계산된다 적혈구 용혈 = (OD 샘플 - OD 대조군) / (OD 양성 대조군 - OD 대조군) × 100 %입니다. </li></ol>

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Y. Li and K.S.L. are the inventors of a pending patent on reversibly crosslinked micelle systems (US patent application 61/485,774). K.S.L. is the founding scientist of LamnoTherapeutics Inc., which plans to develop the nanotherapeutics described in the manuscript. The remaining authors declare no competing financial interests.

여러 가지 나노 입자는 약물 전달에 잠재적 인 사용을 위해 조사되었다. 리포좀 독소루비신과 파클리탁셀 (PTX)는 인간 혈청 알부민 나노 집계가 암 치료에 대한 FDA의 승인을 nanotherapeutics 중입니다 -loaded. 임상 적 효과가 있지만, 그러나, 이러한 nanotherapeutics 모두는 상대적으로 크기가 &quot;큰&quot;이며, 그들은 간과 폐에 축적되는 경향이있다. 상대적으로 작은 입자 크기와 높은 약물 적재 용량 고분자 미셀 약물 전달을위한 nanocarriers을 부상하고있다. 고유 한 코어 - 쉘 구조의 &#39;용해&#39;물리적 캡슐화 수성 조건 하에서 소수성 약물 분자. 약물 봉입 긴 저장 수명 및 높은 효율을 갖는 연구실 형태 단 분산 나노 입자 제조 TDs를 잘 정의 된 (10 내지 50 nm의 입자 지름)으로 구성된 고분자 미셀. 강인한 TD 플랫폼의 많은 장점 중 하나는 고분자의 다양성이다.많은 약물, 형광 염료 및 타겟팅 리간드 용이 TD 13,15,24 플랫폼으로 통합 될 수있다. 프로토콜 내에서 중요한 단계 우리는 27 나노 미터 주위에 입자 크기가 잘 정의 PTX 배달을위한 강력한 가역적 디설파이드 가교 미셀 시스템을 개발 및 좁은 크기 분포를 갖고있다. TDS 농도가 단계적 용액 상 펩티드 화학을 통해 합성 하였다. 이들의 TDS의 잘 정의 된 화학 구조는, 원하는 특성을 갖는 나노 입자를 생성하는 중요한 요인이다. 따라서, TLC 카이저의 테스트로 반응 종료를 확인하는 것은 매우 중요하다. 가 H 2 O 2 산화는 TD의 티올 기 크게 미셀의 안정성을 향상되는 디설파이드 가교를 형성하기 위해 산화된다 중요한 단계이다. 이전 산소계 산화법에 비해, H 2 O 2 -기초 산화 방법에 따라서 짧은 기간에 가교 미셀을 제공하는 96 배 더 빠르다. 또한, GSH, 티올 - 함유 트리 펩타이드는 세포에 의해 생성 중요한 항산화 제이며, 유리 라디칼 및 반응성 산소 화합물을 청소하는 데 중요한 역할을한다. 그것은 세포의 산화 환원 항상성을 유지함으로써 큰 ​​기여를한다. GSH의 세포 농도는 약물 설계의 흥미로운 특징이다. GSH의 세포 내 농도는 지금 단단히 세포 외 농도 25 (2 μM, 각각 대 10 밀리미터)보다 훨씬 높게 설정됩니다. 더 중요한 것은, 상승 된 세포 내 GSH 수준은 종종 많은 약제 내성 인간과 쥐의 종양 세포 (26)에보고되었다. GSH의 높은 세포 내 분포, 약물 페이로드의 방출 및 축적 미셀과 결과의 이황화 가교 결합의 파단을 용이하게한다. 이황화 가교 결합 된 나노 입자는SDS의 존재 하에서 안정한. 그러나, GSH가 풍부한 세포 내 환경함으로써 시스템을 불안정, 디설파이드 결합을 분해하여 약물의 방출을 트리거합니다. 중합체 유도 된 용혈은 적혈구 세포와 같은 혈액 성분과 고분자 미셀의 유해한 상호 작용에 기인. 가교 미셀 비 - 가교 된 유사체와 비교하여 훨씬 적은 용혈을 보였다. 수정 및 문제 해결 이전에보고 된, 산소 기반 방법 (13)에 비교할 때, 산화제로서 H 2 O 2를 이용하면보다 효율적 이황화 가교 결합 형성을 허용한다. H 2 O 2 물 높고 저렴한 가용성 인 몇몇 다른 공지 된 산화제 (예를 들어, 크롬산이나 과망간산)에 비해 높은 품질의 제품을 제공하는 강력한 산화제 (27)이다. 그러나, 산화 시간 furthe해야 할 수도(R)은 합성의 스케일에 기초하여 최적화. 기술의 한계 H 2 O 2는 강한 산화제이다. H 2 O 2의 낮은 농도는 이황화 가교 결합 형성을 수행하기 위해 사용되는 경우에도주의가 바람직하지 않은 약물 열화를 방지하는 &quot;산화 성&quot;약물 적재 TDs를 함께 사용할 때 수행되어야한다. 기존 / 대체 방법에 대하여 기술의 중요성 설명이 기술은 쉽게 표준 실험실에서 복제 할 수있는 쉬운 실험 장치이다. 예를 들어, 표준 증착법을 이용하여 약물 로딩은 투석 방법과 비교하여 섭취하는 짧은 시간이다. 산화제로서 H 2 O 2를 사용하여 코어의 다이 설파이드 형성은 빠르게 oxyg 이용한 산화 이전에보고 된 방법보다 96 배13 갖추고 있습니다. 약물 적재 단계 재현성 쉽게 입도 (DLS 방법)과 약물 함량 (HPLC)를 측정함으로써 평가할 수있다. 이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램 또는 방향 소분자 약물에 비해 필요로하는 주요 장애물 중 하나는 주요 암 치료 설정 생산을 28 배율의 기술적 인 과제를 입력 할 수있는 나노 의학 전에 극복되어야한다. 이것은 새롭게 개발 된 기술을 습득 한 후, 하나는 쉽게 대규모 디설파이드 가교 미셀을 합성 할 수있다. 이것은 인간의 환자에서이 나노 제제의 임상 연구에 매우 바람직하다.

나노 기술은 생물 의학 분야 (1)의 수를 도움이되고 빠른 신흥 분야이다. 나노 입자는 기존 치료제의 다른 유형 가능하지 않은 특성을 설계 및 튜닝을위한 기회를 제공한다. 나노 담체는 약물 순환 시간을 연장, 생분해에 대한 약물의 안정성을 향상시키는 약물 용해도 문제를 극복하고, 미세 조정 표적 약물 전달 및 공동 전달 조영제 1.2이 될 수있다. 나노 입자 기반 배달 시스템은 암 이미징 및 치료에 약속을 개최합니다. 종양 vasculatures는 거대 분자에 누설하고 향상된 침투성 및 보존 (EPR) 효과 3를 통해 종양 부위에 나노 입자를 순환의 우선 축적으로 이어질 수 있습니다. 적극적으로 항암 약물 캐리어로 추진되고있는 여러 가지 나노 캐리어 (예를 들어, 리포좀, 하이드로 겔 및 고분자 미셀) 중 고분자 미셀은 일을 통해 폭 넓은 인기를 얻고있다전자 지난 십 4,5. 고분자 미셀은 정맥 내 투여에 잠재적으로 그들의 unimers 해리 선도의 임계 미셀 농도 (CMC) 미만으로 희석 할 수 있고, 열역학 시스템이다. 가교 전략에 unimers 미셀 해리를 최소화하기 위해 사용되어왔다. 그러나, 과도하게 미셀 안정화시켜 전체 치료 효과를 감소 대상 부위에서 방출로부터 약물을 방지 할 수있다. 여러 가지 화학적 방법은 수 있도록 탐구 된 가교 산화 환원에 대한 응답으로 또는 환원 이황화 결합 6,7 및 pH의 절단 (8) 또는 가수 분해 가능한 에스테르 결합 9,10와 같은 외부 자극에 분해. 우리는 이전에 telodendrimers (TD)이라고 설계 및 수지상 콜산 (CA) 및 블록 선형 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 공중 합체로 이루어진 미셀 나노 입자의 합성을보고 11-15 </&gt; SUP. 이 TDs를은 (N = 분자량 킬로 달톤 (K)에서, y는 콜산의 수 (CA) 단위 =) PEG NK -CAy로 표시됩니다. 그들은 이러한 소수성 코어 파클리탁셀 (PTX)과 독소루비신 (DOX)로 캡슐화 약물에 작은 크기, 긴 수명, 높은 효율을 특징으로한다. 이러한 PEG, 리신, 및 CA 등 TD의 빌딩 블록은 생체 적합성 및 PEG 코로나의 존재는 망상 내피 시스템에 의해 미셀 나노 입자의 비특이적 흡수를 방지하는 &quot;은폐&quot;나노 입자의 특성을 부여 할 수있다. 티올 선형 덴드리머 용이 우리 표준의 TDS 수지상 올리고 라이신 백본에 시스테인을 도입함으로써 생성 될 수있다. 이 문서의 TDS 소수성 코어에 이황 가교 (도 1)을 도입함으로써 가역적 가교 미셀 약물 전달체의 제조를위한 손쉬운 프로토콜을 제공한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="795">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">MeO-PEG5K-NH2</td>
			<td style="width:105px;">Rapp Polymere</td>
			<td style="width:119px;">125000-2</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Lys(Fmoc)-OH</td>
			<td style="width:105px;">Aaptec</td>
			<td style="width:119px;">AFK107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Lys(Boc)-OH</td>
			<td style="width:105px;">Anaspec</td>
			<td style="width:119px;">AS-20132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Cys(Trt)-OH</td>
			<td>Aapptec</td>
			<td>AAC105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dimethylformamide</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1160-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethyl ether</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">E134-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D125806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6508</td>
			<td>Corrosive, handle with care</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4-methyl piperidine</td>
			<td style="width:105px;">Alfa-Aesar</td>
			<td style="width:119px;">L-02709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ebes linker</td>
			<td style="width:105px;">Anaspec</td>
			<td>AS-61924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cholic acid</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1,2-Ethanedithiol</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">02390</td>
			<td>Handle inside fume hood. Bleach gloves after usage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triisopropylsilane</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">233781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform (anhydrous)</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hydrogen peroxide solution 30%</td>
			<td style="width:105px;">Aaron Industries</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HoBt-Cl</td>
			<td style="width:105px;">Aaptec</td>
			<td style="width:119px;">CXZ096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DIC</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D125407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Female athymic nude mice (Nu/Nu strain), 6&#8211;8 weeks age</td>
			<td colspan="2">Harlan (Livermore, CA)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a facile and efficient approach for the production of reversible disulfide cross-linked micelles

나노 의학은 생물 의학 응용 프로그램에 대한 규모 나노 미터 입자의 고유 한 특성을 이용합니다 치료의 새로운 형태이다. 치료 결과를 극대화하고, 약물과 관련된 부작용을 감소시키는 약물 전달을 향상 오늘날 나노 의학의 초석 일부이다. 특히 나노 입자는 암 치료의 다양한 응용 프로그램을 발견했다. 디자인, 응용 프로그램 및 종양 미세 환경에 따라 생산에 높은 수준의 유연성을 제공 나노 입자는 임상 적으로 신속한 번역 더 효과적 일 것으로 예상된다. 고분자 미셀 나노 캐리어는 약물 전달 응용 프로그램에 대한 인기있는 선택입니다. 이 글에서, 우리는 잘 정의 된 양친 선형 수지상 공중 합체 (telodendrimer, TD)의 자기 조립 (self-assembly)에 따라 약물로드, 이황화 가교 미셀을 합성하는 간단하고 효과적인 프로토콜을 설명합니다. TD는 폴리에틸렌 GL 구성된다친수성 세그먼트 용액 계 펩티드 화학 제를 사용하여 아민 종결 된 PEG에 코어 형성 용 소수성 잔기에 부착 단계적 같은 티올 콜산 클러스터와 ycol (PEG). 파클리탁셀 (PTX)과 같은 화학 요법 약물은 표준 용매 증발 법을 사용하여로드 될 수있다. 오 2 - 매개 산화는 이전에 TDS 농도에 무료 티올 그룹에서 내 미셀 이황화 가교를 형성하기 위해 사용 하였다. 그러나 반응이 느리고 대규모 생산에 가능하지 않았다. 최근는 H 2 O 2 - 매개 산화법 더 가능하고 효율적인 방식으로 탐구하였으며, 이는 96 배 빠른 속도로 이전에보고 된 방법보다이었다. 이 방법을 사용 PTX로드, 이황화 가교 나노 입자 50g을 성공적으로 좁은 입자 크기 분포와 높은 약물 적재 효율로 생산되고있다. 얻어진 미셀 용액의 안정성은 그러한 w 공동 배양 같은 방해 조건을 이용하여 분석또는 환원제없이 세제, 도데 실 황산나트륨, 제 i. 이들 비 - 가교 상대 비교할 때 약물로드 디설파이드 가교 미셀 적은 용혈 활성을 보여 주었다.

약물로드, 이황화 가교 미셀의 제조 및 특성 양친 매성 고분자 5K PEG -Cys -Ebes 4 8 8 -CA 암 약물 전달 디설파이드 가교 미셀 시스템을 형성 할 수있는 수지상 중합체. 구조적으로, 이는 분지 된 폴리 (라이신 시스테인 Ebes) 백본을 통해 선형 PEG 분자 (친수성 도메인 분자량 5K)의 일단에 연결된 콜릭 산 (소수성 도메인)의 수지상 올리고머로서 정의된다. 다른보고 미셀 시스템을 통해 이러한 블록 공중 합체를 사용하여 여러 가지 이점이있다. 첫째, 용이 단계적 용액 상 축합 반응을 통해 합성 될 수있다. 둘째, 잘 확립 된 용액 상 펩티드 단계적 FMOC 화학을 통해 제조 된 몇몇 다른보고 된 양친 성 중합체, 티올 중합체 시스템에 비해, 잘 정의 된 구조물의 있습니다레. 이 동결 건조 된 분말 형태로 저장되고 확장 된 수명을 보유 할 수있다. 몇 가지 기술은 최종 제품의 특성을 이용할 수있다. TD 부착 콜산의 양은 1 H NMR 스펙트럼에 콜산의 세 메틸기에서에게 PEG의 양성자의 신호 비를 비교함으로써 검출 될 수있다. TD를의 분자량은 MALDI-TOF 질량 분석 및 겔 투과 크로마토 그래피 (GPC)에 의해 확인 될 수있다. 엘만 (Ellman) 정량 시험 분자 당 존재하는 자유 시스테인 잔기의 수를 해독하는데 사용될 수있다. PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 수성 미디어에서 미셀을 형성하는 자기 조립 할 수 있습니다. 표준 용매 증발 법 등 PTX 및 빈 크리스틴과 같은 소수성 약물의 다양한 사용하여 성공적 미셀 13,22 캡슐화되었다. OxygEN는 이전 5K PEG -Cys 4 -Ebes 8 -CA (8)의 유리 티올기를 산화 인트라 미셀 이황화 가교 결합을 형성하는데 이용되었다. 엘만 (Ellman) 시험에 의해 모니터링 된 바와 같이, 다이 설파이드 결합을 위해 유리 티올 기의 전화율은 산화 후 48 시간 후 85 %에 달했다. AH 2 O 2 - 매개 산화는 최근 또 다른 방법으로 사용 하였다. 전환율은 이전의 방법보다 96 배 빠른 속도로 30 분이었다 (도 2)의 88 %에 달했다. PTX로드 오십 g는 이황화 가교 나노 입자가 성공적으로 더 효율적인 접근 방법 (도 3)를 사용하여 제조되었다. 입자 크기는 좁은 크기 분포 (도 3)와, 주위에 27 nm였다. 약물 적재 효율은 4.0 ㎎ / ㎖의 PTX로드와 100 %에 접근했다. 이황화 가교는 CMC 값에 큰 영향을 미쳤다. 부족 표준 TD PEG 5K -CA 8 비교이황화 결합은 가교 TD 관찰 된 CMC 값의 10 배 감소 (0.67 μM 대 5.53 μM) 13을 나타내었다. 안정성 연구 우리는 더 심한 미셀 방해 조건으로부터 PTX로드, 이황화 가교 미셀의 안정성을 조사 하였다. 소듐 도데 실 설페이트 (SDS)를 효율적 고분자 미셀을 분해 수 일상적 미셀의 안정성을 평가하기 위해 사용되는 강한 이온 성 세제이다. 약물 - 로딩 디설파이드 가교 미셀 (1.0 ㎎ / ㎖)의 안정성은 미셀을 방해 SDS (2.5 ㎎ / ㎖)의 존재 하에서 DLS로 모니터링 하였다. 미셀의 입자 크기는 (도 4의 왼쪽 패널) 등의 가교 미셀 그대로 남아 있음을 나타내는 시간에 걸쳐 꾸준히 유지되었다. 환원 조건 THER 소수성 코어에 이황화 결합을 절단 예상eby 불안정에 민감한 미셀을. 글루타티온 (GSH)을 환원제 내인성 종종 이러한 연구에 사용된다. 세포 외 수준 (2 μm의 대 10mm)에 비해 GSH의 세포 내 수준에서 뚜렷한 대조가있다. 농도의 차이는 종종 자극 응답 시스템을 생성하는 데 사용된다. 세포 내 농도 (10mm) 23 GSH를 첨가 한 후, 약물 - 로딩 디설파이드 가교 미셀의 크기는 30 분 동안 그대로 남아 있었다. 그들은 갑자기 이황화 결합, 미셀 (그림 4, 오른쪽 패널)의 신속한 분리의 전제 조건의 중요한 수의 감소를 의미, 1 나노 미터로 감소. 반대로, 시스템 (데이타 미기재) GSH의 세포 외 농도의 존재 하에서 안정적이었다. 용혈 연구 그림5 또는 이황화 가교없이 PTX로드 미셀의 관찰 용혈 활성의 차이를 나타낸다. 혈류에서 이러한 입자를 관리 할 때 그들의 치료 이점을 저해 혈액 세포의 용혈은 피해야한다. Hemato 호환성은 지질을 용해하거나 세포막의 파열로 이어지는 인지질 세포막에 끼어있는 잠재력을 가지고있는 양친 TDs를 같은 고분자 계 약물 담체의 생체 응용에 매우 중요하다. 도 5에 도시 된 바와 같이, PTX-NCMs 0.2 mg 내지 증가 PTX-NCMs의 농도가 14.2 %로 8.1 %에서 증가 용혈의 백분율 (RBC) 용해 수, 용량 의존적 적혈구가 나타났다 / 1.0 ㎎ / ㎖로 용액. 그러나 PTX-된 DCM 이황화 가교 결합이 동일 실험 조건에서 적혈구의 용혈 관측 활동 (&lt;1.0 %)을 나타내지 않았다. hemolys의 차이추세는 양친 TDS 파일을 형성하기 위해 해리로부터 PTX-된 DCM을 방지 소수성 코어에 존재하는 내부 미셀 디설파이드 브릿지에 기인 할 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54722/54722fig1.jpg" /> 그림 1 : 가교 미셀을 형성하는 단계. 자기 조립 후에 5K PEG 티올 telodendrimer -Cys 4 -Ebes 8 -CA (8)의 산화에 의해 형성되는 디설파이드 가교 미셀의 개략도. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54722/54722fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54722/54722fig2.jpg" /> 도 2 : 가교 미셀 형성 산화법. t의 전환율그 TDS 농도에서 그룹이 두 산화법위한 산화 시간의 함수로서 결합 디설파이드 티올. 미셀의 총 농도가 20 ㎎ / ㎖로 유지 하였다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54722/54722fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54722/54722fig3.jpg" /> 도 3 : 약물로드 가교 미셀. 왼쪽 패널 : PTX로드, 이황화 가교 미셀의 배치의 사진. 스케일 바 : 1 인치. 오른쪽 패널 : 입자 직경, 동적 광산란 (DLS)에 의해 측정. 미셀의 총 농도가 20 ㎎ / ㎖로 유지 하였다. PTX의 로딩 ㎖ / 4 mg을했다. 입자 크기 데이터는 3 회 측정에 기초하여 ± SD 평균 입자 크기로 나타내었다. SD : 표준 편차는 측정 된 입자 크기 분포의 폭을 설명한다.<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54722/54722fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54722/54722fig4.jpg" /> 그림 4 : 안정성 연구. DLS 의해 측정 (왼쪽) 또는없이 (오른쪽) GSH (10 mM)을 2.5 ㎎ / ㎖ SDS의 존재 PTX로드, 이황화 가교 미셀의 입자 크기. 입자 크기 데이터는 3 회 측정에 기초하여 ± SD 평균 입자 크기로 나타내었다. SD : 표준 편차는 측정 된 입자 크기 분포의 폭을 설명한다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54722/54722fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54722/54722fig5.jpg" /> 그림 5 : 용혈 분석. 적혈구에 비가 교 미셀 비교 PTX로드, 이황화 가교 미셀의 생체 외 용혈성 활동 (적혈구). 트리톤-100 (2 %) 및 PBS는 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용 하였다. 보고 된 값은 배수로 샘플들의 평균 ± SD이다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54722/54722fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

가역 디설파이드 가교 미셀 제조를위한 손쉬운 효율적인 접근법

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

a-facile-efficient-approach-for-production-reversible-disulfide-cross

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.8K 조회수.  University of California, Davis. To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장<em&gt; 대장균</em&gt; : 디자인, 생산 및 정제

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

연구

생화학

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is not completely understood. All proteasomes contain a structurally conserved core particle (CP), or 20S proteasome, containing two heptameric&#160;&#946; subunit rings sandwiched between two heptameric&#160;&#945; subunit rings. Archaeal 20S proteasomes are compositionally simpler compared to their eukaryotic counterparts, yet they both share a common assembly mechanism. Consequently, archaeal 20S proteasomes continue to be important models for eukaryotic proteasome assembly. Specifically, recombinant expression of archaeal 20S proteasomes coupled with nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) has yielded many important insights into proteasome biogenesis. Here, we discuss a means to improve upon the usual strategy of coexpression of archaeal proteasome &#945; and &#946; subunits prior to nondenaturing PAGE. We demonstrate that although rapid and efficient, a coexpression approach alone can miss key assembly intermediates. In the case of the proteasome, coexpression may not allow detection of the half-proteasome, an intermediate containing one complete &#945;-ring and one complete &#946;-ring. However, this intermediate is readily detected via lysate mixing. We suggest that combining coexpression with lysate mixing yields an approach that is more thorough in analyzing assembly, yet remains labor nonintensive. This approach may be useful for the study of other recombinant multiprotein complexes.

This protocol uses both subunit coexpression and postlysis subunit mixing for a more thorough examination of recombinant proteasome assembly.

재조합 고세균 프로 테아과 비 변성 페이지로 프로 테아 조립 검사 : 케이스를 결합 접근에 대한

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.

We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.

양 사체 (Transcriptome) 분석에있는 사용을위한 씨앗에서 매우 정제 된 RNA의 분리를위한 효율적인 방법

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

생산, 결정화 및 구조 결정의<em&gt; C. 남과 어울리지 않는</em&gt; PPEP-1 Microseeding 및 아연 SAD를 통해

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

실험실 규모의 생산과 치료 용 항체의 정제

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly thermally stable. There are &#62;375,000 putative G4-forming sequences in the human genome, and they are enriched in promoter regions, untranslated regions (UTRs), and within the telomeric repeat. Due to the potential for these structures to affect cellular processes, such as replication and transcription, the cell has evolved enzymes to manage them. One such enzyme is G4 Resolvase 1 (G4R1), which was biochemically co-characterized by our laboratory and Nagamine et al. and found to bind extremely tightly to both G4-DNA and G4-RNA (Kd in the low-pM range). G4R1 is the source of the majority of G4-resolving activity in HeLa cell lysates and has since been implicated to play a role in telomere metabolism, lymph development, gene transcription, hematopoiesis, and immune surveillance. The ability to efficiently express and purify catalytically active G4R1 is of importance for laboratories interested in gaining further insight into the kinetic interaction of G4 structures and G4-resolving enzymes. Here, we describe a detailed method for the purification of recombinant G4R1 (rG4R1). The described procedure incorporates the traditional affinity-based purification of a C-terminal histidine-tagged enzyme expressed in human codon-optimized bacteria with the utilization of the ability of rG4R1 to bind and unwind G4-DNA to purify highly active enzyme in an ATP-dependent elution step. The protocol also includes a quality-control step where the enzymatic activity of rG4R1 is measured by examining the ability of the purified enzyme to unwind G4-DNA. A method is also described that allows for the quantification of purified rG4R1. Alternative adaptations of this protocol are discussed.

G4 Resolvase1 binds to G-quadruplex (G4) structures with the tightest reported affinity for a G4-binding protein and represents the majority of the G4-DNA unwinding activity in HeLa cells. We describe a novel protocol that harnesses the affinity and ATP-dependent unwinding activity of G4-Resolvase1 to specifically purify catalytically active recombinant G4R1.

효소 활성 G4 Resolvase1의 정화를위한 G-quadruplex DNA 화성 접근

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a challenge for ChIP due to technical difficulty in isolation of high-quality nuclei with minimal contamination of myofibrils. Previous protocols have attempted to purify nuclei before cross-linking, which incurs the risk of altered DNA-protein interaction during the prolonged nuclei preparation process. In the current protocol, we first cross-linked the skeletal muscle tissue collected from mice, and the tissues were minced and sonicated. Since we found that ultracentrifugation was not able to separate nuclei from myofibrils using cross-linked muscle tissue, we devised a sequential filtration procedure to obtain high-quality nuclei devoid of significant myofibril contamination. We subsequently prepared chromatin by using an ultrasonicator, and ChIP assays with anti-BMAL1 antibody revealed robust circadian binding pattern of BMAL1 to target gene promoters. This filtration protocol constitutes an easily applicable method to isolate high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle tissue, allowing consistent sample processing for circadian and other time-sensitive studies. In combination with next-generation sequencing (NGS), our method can be deployed for various mechanistic and genomic studies focusing on skeletal muscle function.

We present a filtration-based protocol to isolate high-quality nuclei from cross-linked mouse skeletal muscle wherein we removed the need for ultracentrifugation, making it easily applicable. We show that chromatin prepared from the nuclei is suitable for chromatin immunoprecipitation and likely chromatin immunoprecipitation sequencing studies.

Chromatin Immunoprecipitation을위한 Cross-linked Skeletal Musculus로부터 고품질 핵을 준비하기위한 Filtration 기반 방법

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

다양 한 생 화 확 적인 접근을 사용 하 여 소설 CK2 키 기판의 식별

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall process costs. Alternative, cost-effective capture steps are therefore valuable for industrial-scale manufacturing, where large quantities of a single mAb are produced. Here we present a method for the immobilization of a DsRed-based epitope ligand to a cross-linked agarose resin allowing the selective capture of the HIV-neutralizing antibody 2F5 from crude plant extracts without using Protein A. The linear epitope ELDKWA was first genetically fused to the fluorescent protein DsRed and the fusion protein was expressed in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants before purification by immobilized metal-ion affinity chromatography. Furthermore, a method based on activated cross-linked agarose was optimized for high ligand density, efficient coupling and low costs. The pH and buffer composition and the soluble ligand concentration were the most important parameters during the coupling procedure, which was improved using a design-of-experiments approach. The resulting affinity resin was tested for its ability to selectively bind the target mAb in a crude plant extract and the elution buffer was optimized for high mAb recovery, product activity and affinity resin stability. The method can easily be adapted to other antibodies with linear epitopes. The new resins allow gentler elution conditions than Protein A and could also reduce the costs of an initial capture step for mAb production.

In this procedure, a DsRed-based epitope ligand is immobilized to produce a highly selective affinity resin for the capture of monoclonal antibodies from crude plant extracts or cell culture supernatants, as an alternative to Protein A.

선호도 크로마토그래피 수지의 신속한 개발을 위한 활성화된 상호 연결 아가로스 - 사례 연구로서의 항체 포획

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...