אני מודה ד&quot;ר וינסנט Seutin בתמיכה המתמשכת שלו, Christelle Gillissen ולורן Massotte לקבלת סיוע טכני מעולה, ד&quot;ר ז&#39;אן Defourny וסנדרה Ormenese עבור עצות עם מיקרוסקופ confocal, ד&quot;ר ז&#39;אק ארגנה על המתנה של מגבר Axopatch 200B השני, הדמית GIGA פלטפורמה לשיתוף המיקרוסקופ confocal ותוכנת Imaris וד&quot;ר סטיבן פרימן לקריאת כתב היד באופן ביקורתי. עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של FRS בלגי - FNRS (U.N002.13 ו T.N0015.13) ופורסם בתמיכת קרן אוניברסיטת הבלגית (Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique).

הכותב מצהיר שאין לו שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

דו&quot;ח זה מתאר פרוטוקול צעד אחר צעד ליישם קלטות somatodendritic כל תא כפולות וקלטות הדנדריטים מקומיות. זה שימושי לקביעת ההשפעה של תעלות יונים (כלומר, אני ח) על מהלך הזמן של הפוטנציאלים postsynaptic ומיפוי חלוקת ערוץ יון (אני ח) לאורך תחום somatodendritic של נוירונים DA nigral, בהתאמה. כתוצאה מדידות אלקטרו משולבים כדי לפרסם הוק היסטוכימיה להתאושש מורפולוגיה התא. ההליך הועסק לחקור נוירונים DA ממוקמים nigra substantia, אבל ניתן להכליל עבור נוירונים GABA nigral שכנות, נוירונים DA הטגמנטום הגחוני או נוירונים מוח תיכונים אחרים. כל השלבים ניתן בעקבות לבחון גם תעלות יונים אחרים הביעו דנדריטים של נוירונים nigral בלי שינויים חשובים. הוק הודעה להדמיה הוא רלוונטי במיוחד עבור נוירונים עם נושאות האקסוןדנדריטים, כגון נוירונים nigral 25,26, interneurons oriens-alveus בהיפוקמפוס 21 או כמה עצב פירמידליים CA1 67. מעניין לציין, כי נוירונים שיתוף תכונה זו נראה יותר נפוץ ממה שמקובל לחשוב 67. ניתוח מורפולוגי חושף גם את המיקום המדויק של האלקטרודות האקסון. הגילוי של זה האחרון עשוי להיות מותאם על ידי התיוג של חלבונים הביעו במגזר הראשוני האקסון (ערוצי Na + מתח מגודר או Ankyrin G) באמצעות אימונוהיסטוכימיה 68,69. מהימנותם של נתונים שנאספו עם קלטות הדנדריטים וסימון עצבי עוקב תמיד תלויה באיכות הפרוסה. מאמץ מקסימאלי צריך אפוא להיות מיושם כדי לשמר את הכדאיות של תאים בתוך הרקמה. זו מושגת באמצעות טיפול עדין של בעלי חיים בריאים, כלים איכותיים ריאגנטים, חמצון מספיק של טמפרטורות הרקמות קרות כקרח לאורך כל הכנת פרוסות. תנאי הקלטה יציבים להסתמך על הבחירה של נוירונים בריאים. במצב כל התא, התנגדות סדרה צריכה תחילה להיות נמוכה ככל האפשר ומתוחזק קבועה לאורך כל הניסוי. היציבות של הקלטות היא עוד תלויה מניפולטורים באיכות גבוהה נטול להיסחף ותנודות. ניתן להפחית הפרעות אלו על ידי אופטימיזציה של יציבות פיפטה: בדיקת החיבור לבעל פיפטה וכדי headstage, שליטה שכבלי micromanipulator מופשלים, הימנעות שינויים פתאומיים בטמפרטורה או תנועה הבמה לבדיקת המנגנון של המניפולטור. עבור הקלטות כפולות, methylsulfate 13,15,21 נכלל הפתרון התאי, אבל גלוקונאט 9,14,25 יכול להיות מועסק לסירוגין. עם זאת, האניון העיקרי עשוי לשנות את קרום פוטנציאל 70,71 וכמה זרמים תלויי מתח 72. פתרון תאי ניתן להשלים עם ATP, GTP ו phosphocreatine לשמר את physioloפונקציות gical של נוירונים. בנוסף, הוספת צבע פלואורסצנטי בפתרון פיפטה (למשל, Alexa 594 או Sulforhodamine 101 41) כדי להמחיש את דנדריטים במהלך ההקלטה סומטיים יכול להיות שימושי למשל להציב יישום הלחץ (איור 7 נ&quot;צ. 41) או מגרה חשמל פִּיפֵּטָה. הפתרון פיפטה להקלטות מצורפות תא מכיל ריכוז גבוה K + ואין Na + להקליט ח ט גדול. ראוי לציון יחס ריכוז Na + / K + משפיע על משרעת הנוכחית 10, פוטנציאל ההיפוך של 11 הנוכחי ואת gating של אני ח 73. לחלופין, אני ח יכול גם להקליט באמצעות מחוץ-outs 10. בתצורת הקלטה זו אולם, המילייה התאי הקרבה של הערוצים עשוי להיות מוטרד. כתוצאה מכך, הבדלים הפעלה תלוי המתח של לי &lt;sub&gt; h הוא ציין כאשר זרמי השוואה שהושגו באמצעות טלאים מצורפי תא ומחוץ-outs 10. נפיחות של נוירונים הוא נתקל מדי פעם במהלך ההקלטה תיקון- clamp, ולעתים קרובות מתעוררת מגורמים ברורים, כגון איכות נמוכה של מים, חוסר איזון חזקה osmolarity או pH בין התוך ואת הפתרונות תאיים 39 או טעויות בהרכב של פתרונות. איכות הקלטות אלקטרו יש שכיחות ישירה על איכות המורפולוגיה של נוירונים התאושש. טפטפות סומטיים עמידות גבוהה משמשות להקלטות כפולות (6 - 10 MΩ, כמו שופטים 6,11.) ו להקלטות סומטיים אחת אחרי הקלטות מצורפות תא כדי למזער את הדילול של המילייה התאית 14. ההקלטה סומטיים כל התא בעקבות הקלטת התא מצורף ולכן הוא כל זמן קצר (&lt;10 דקה &#39;). בחוץ-אאוט תיקונים משני טפטפות סומטיים הדנדריטים חיוניים סגירה תקינה של גell קרום וההתאוששות הבאה של מורפולוגיה התא. בנוסף של מבנה התא, התוכן הנוירוכימיים עשוי להיקבע על נוירונים רשמו 59,74. למשל, hydroxylase החלבון טירוזין תאיים ניתן immunolabeled לזיהוי חד-משמעי של נוירונים DA 13. נוירונים DA מרוכזים בעיקר SN pars compacta, עם צפיפות נמוכה בהרבה נוכח SN pars reticulata, שם הם מתערבבים עם מספר גבוה יותר של נוירונים GABA 75. בעוד גוף התא של הנוירונים DA הוא לעיתים קרובות גדול יותר מזה של נוירונים GABA, זיהוי חזותי של תאים אלה עם IR-videomicroscopy אינה ודאית הפריע חלקית את אטימות compacta pars. כדי לעקוף מגבלות אלו, הבחירה מראש של נוירונים DA ניתן להקל על ידי השימוש של עכברים מהונדסים המבטא בסמן פלורסנטי באוכלוסייה ספציפית של נוירונים (TH 65 או DAT נוירונים DA, GADעבור נוירונים GABA) ואת התאורה epifluorescence. לחלופין, פלורסנט לצבוע עשוי להיכלל הפתרון של האלקטרודה סומטיים כדי להקל על ויזואליזציה של דנדריטים. רזולוציה מוגברת של התא פלורסנט מובא על ידי confocal דיסק מסתובב ניפקוב 14,22,30 או שני הפוטונים מיקרוסקופיה 7 בשילוב IR-DGC 6. כמה יתרונות קשורים DGC בהשוואת דסק&quot;ש. ראשית, כפי מנסרות דסק&quot;ש אינן נדרשות, תמונת IR-DGC ניתן ועליהן 49,52,53,76 תמונת קרינה. שנית, DGC ניתן לשלב עם photostimulation ו optogenetics 77. חסרון של הכנת פרוסה הוא השמירה על השלמות של נוירונים. נוירונים DA להאריך הדנדריטים שלהם בשלושת המטוסים מרחבית 78,79 ולכן עיצור של תא הדנדריטים לא ניתן להימנע לחלוטין פרוסות 80. הבחירה של האורינטציה של פרוסות (עטרה, אופקי או פסקsagittal) היא trade-off. מקורו של העצבוב ואת תכנון הניסוי חייב להיחשב כדי לבחור את כיוון הזכות פרוסה. תיקון הדנדריטים ישיר הוא הטכניקה המשמשת כדי למפות את התפלגות תעלות יונים פונקציונליות במדורים השונים של תאים. בנוסף, טכניקה זו מציעה לקבוע את השתנות תכונות פעילות של ערוצים 20. כהשלמה המיקום וצפיפות של תעלות יונים ניתן לקביעה באמצעות אימונוהיסטוכימיה על מיקרוסקופ אור ואלקטרוניקה רמות 17,23. גישה זו גם מציעה את האפשרות לקבוע את צפיפות הערוץ במבני קליבר קטנים אשר אינם נגישים טפטפות תיקון. עם זאת ערוצים אלה עשויים להיות במצב תפקודי ברור 24 או אפילו פעילים בהשוואה לאלו אשר נרשמו באמצעות טכניקות תיקון- clamp. טכניקות שניהם לכן, יש לקבל תמונה מלאה על המיקום והמאפיינים שלתעלות יונים באזור תאי ספציפי 17. עם התפתחותה של צבעים מתח רגיש, הדמיה מתח נעשה שימוש כדי לבחון את התפשטות של APS ו EPSPs בנוירונים במקומות מרובים 81. כחלופה להקלטות תיקון- clamp כפולות, גישה זו ניתן ליישם גם עבור דנדריטים דק שאינם נגישים טפטפות תיקון אבל מחייבים כיול מדויק של האות ו המיצוע. בעוד נוירונים DA ב SN ואזור tegmental גחון נחקרים נרחב באמצעות הקלטות סומטיים בהקשר הפיזיולוגי pathophysiological, את המאפיינים התפקודיים של הדנדריטים שלהם נותרים עלומים בעיקר בשני התנאים. תיקון מ דנדריטים יושם עבור נוירונים דופמין nigral על ידי מספר קבוצות עם הצלחה 13,25,26 ונשאר שיטת הבחירה לנתח תכונות להתרגש מבני subcellular בסדר אלה 8. הקלטות דנדריטים לספק opportu נוסףnity לבחון את היעילות ואת הפלסטיות של שידור הסינפטי פלסטיות של רגישות הדנדריטים 82,83.

נוירונים לקבל מידע הסינפטי בעיקר על הדנדריטים שלהם. מעורר אותות הסינפטי מעכבים להפיץ מהאתר שלהם של דור לאתר האינטגרציה שבו פוטנציאל פעולה (APS) הם עוררו את אות המוצא. בדרכם, פוטנציאלים הסינפטי מושפעים הוא מבחינת המבנה של דנדריטים האינטראקציה בין תכונות הממברנה פסיביות ואקטיביות. השילוב של פרמטרים משתנים מאוד אלה מרחיב את כוח החישוב של נוירונים 1,2. עם זאת, הקוטר הקטן של דנדריטים מעכבים אולם המחקר של התכונות החשמליות שלהם. הפיתוח המתמיד של טכניקת תיקון- clamp 3, אופטיקה 4 והעידון של שיטות להכנת פרוסה 5 במהלך העשורים האחרונים אפשרו הקלטות מן דק מאוד (0.7 - 3 מיקרומטר O) דנדריטים 6,7. שיטות אלה היו, והם, עדיין במידה רבה להשתמש כדי לבחון את הרגישות של דנדריטים במגוון of נוירונים 8. קלטות הדנדריטים ישירות חיוניות כדי לקבוע את החלוקה 9-19 ו הבדלים בתכונות הפונקציונליות 20-22 של תעלות יונים בתאים עצביים ברורים. נתונים אלו הם משלימים ההכרחיים של הפצות ערוץ יון מזוהות עם אימונוהיסטוכימיה בשילוב מיקרוסקופ אור האלקטרונים 23,24. קלטות somatodendritic Dual יושמו לחקור את התפשטות פוטנציאל פעולה 9,13-15,21,22,25-27 והפצת פוטנציאלים הסינפטי 13,16,18 לאורך תחום somatodendritic של נוירונים, להשיג דגמי כבל פסיביים מפורטים 28. 30 ולחקור ההחלטה הזמנית של אינטגרציה עצבית 31. Nigra substantia (SN) הוא אזור הממוקם במוח התיכון מעורב בכמה פונקציות כגון שליטה על תנועה, הקידוד של גמול והתנהגויות רגילות. הירידה של דופמין עקב אל הפרטאובדן דופאמין (DA) נוירונים SN קשור הפרעות המוטוריות אצל חולים הסובלים ממחלת פרקינסון 32. מעגל nigral מורכב משני סוגי תאים עיקריים: נוירונים דופאמינרגיים GABAergic. מעניין, הנוירונים האלה יש כמה תכונות ספציפיות המבדילות אותם נוירונים אחרים. האקסון של חלק גדול של נוירונים DA וכמה נוירונים GABA מקורו מאתר הדנדריטים המציין כי סוכת הדנדריטים היא הטרוגנית (האקסון נושאות דנדריטים-חסר האקסון) 25,26,33. המורפולוגיה של נוירונים אלה ניגודים ולכן עם בארגון טיפוסי של נוירונים שבו העברת מידע בהתאם לחוק של קיטוב דינמי הנפלטת קחאל: החל דנדריטים, כדי סומה ולבסוף האקסון 34. נוירונים DA ידועים גם לשחרר דופמין מן הדנדריטים שלהם 35, ליצור פעילות התפוצצות 36 הפלסטיות NMDA קולטן 37. dissection של תופעות אלה הוא חמקמק ללא הקלטות ישירות מהאתר שבו הם יזמו. כדי לקבל תובנה לתוך הקשר בין המיקום המדויק תכונות פעילות של תעלות יונים ותפקידם העברת הרגישות ומידע הדנדריטים בנוירונים nigral, קלטות הדנדריטים ישירות הן את שיטת בחירה. דו&quot;ח זה מתאר הליך מפורט, שניתן להשתמש בם כדי להשיג הקלטות יחידות כפולות תיקון- clamp מ דנדריטים של נוירונים nigral ואת תיוג biocytin פוסט הוק המקביל. העקרונות הבסיסיים עבור תיקון והגופני ואת קרום הדנדריטים הם מאוד דומים. למעשה זאת, הקלטות מאתרים הדנדריטים דורשות אופטימיזציה ספציפית בהשוואה להקלטות סומטיים. קלטות הדנדריטים מוצלחות לסמוך על האיכות של הפרוסות, התאמה אופטימלית של אופטיקה, גישה עדינה של פיפטה את התיקון והיציבות של ההקלטות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="621">
	<tbody>
		<tr height="137">
			<td height="137" style="height:138px;width:156px;">Double-distillated water</td>
			<td style="width:143px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">Super Q</td>
			<td style="width:187px;">&#160;Resistivity &#62;14 M&#937; cm, ideal 18.2 M&#937; cm at 25&#176;C, filtered (0.22 &#181;m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Microfilter candles</td>
			<td style="width:143px;">Robu</td>
			<td style="width:137px;">Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:156px;">Tissue slicer with vibroprobe</td>
			<td style="width:143px;">Leica</td>
			<td style="width:137px;">VT1200</td>
			<td style="width:187px;">cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Tissue slicer</td>
			<td style="width:143px;">Dosaka</td>
			<td style="width:137px;">DTK-1000</td>
			<td style="width:187px;">cutting parameters: speed 4, frequency 7</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Razor blades</td>
			<td style="width:143px;">Gilette</td>
			<td style="width:137px;">Super Silver</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:143px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Reserve chamber</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Custom-made</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">PP beckers</td>
			<td style="width:143px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">213-1725</td>
			<td style="width:187px;">400 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Syringe filter</td>
			<td style="width:143px;">Merk Millipore</td>
			<td style="width:137px;">Millex - GV 0,22 &#181;m</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Cyanoacrylate glue&#160;</td>
			<td style="width:143px;">UHU</td>
			<td style="width:137px;">&#34;Sekunden Kleber&#34;</td>
			<td style="width:187px;">liquid glue</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Recording chamber&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;">Slice mini chamber</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Horizontal pipette puller</td>
			<td style="width:143px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:137px;">Brown-Flaming P-97</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Pipettes</td>
			<td style="width:143px;">Hilgenberg</td>
			<td style="width:137px;">1807524</td>
			<td style="width:187px;">2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Dental wax</td>
			<td style="width:143px;">Colt&#232;ne/Whaledent</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">orthodontic tray wax strips</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Platinum grid</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Microforge</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:137px;">MF-830</td>
			<td style="width:187px;">to fire-polish pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:156px;">Potassium methyl sulfate</td>
			<td style="width:143px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:137px;">215481</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:156px;">Biocytin</td>
			<td style="width:143px;">Molecular probes</td>
			<td style="width:137px;">B1592</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:156px;">Manometer</td>
			<td style="width:143px;">GREISINGER electronic</td>
			<td style="width:137px;">GDH 13 AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:156px;">Microscope</td>
			<td style="width:143px;">Zeiss</td>
			<td style="width:137px;">FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:156px;">Dodt Gradient Contrast</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Manipulators</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;">LN Mini 25</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:156px;">Frame grabber</td>
			<td style="width:143px;">The Imaging Source</td>
			<td style="width:137px;">DFG/USB2pro</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Camera</td>
			<td style="width:143px;">DAGE-MTI</td>
			<td style="width:137px;">NC-70</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:156px;">Condenser</td>
			<td style="width:143px;">Zeiss</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">high numerical aperture condenser working with oil</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:156px;">Objective</td>
			<td style="width:143px;">Zeiss</td>
			<td style="width:137px;">W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR</td>
			<td style="width:187px;">63x magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:156px;">Fourfold-changer</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">between the camera and the microscope</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:156px;">Black &#38; white video monitor</td>
			<td style="width:143px;">Sony</td>
			<td style="width:137px;">SSM-175CE</td>
			<td style="width:187px;">16-inch, 850 TV lines, analog</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:156px;">Sample Bottles, Amber Glass, with Cap</td>
			<td style="width:143px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">215-2409</td>
			<td style="width:187px;">to transfer slices from the setup to histology room</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">The Axon Guide</td>
			<td style="width:143px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Book</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:156px;">Stimfit</td>
			<td style="width:143px;">https://github.com/neurodroid/stimfit</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Analysis of electrophysiological data</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:156px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">441244</td>
			<td style="width:187px;">see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:26px;width:156px;">Well cell culture plate</td>
			<td style="width:143px;">Greiner-Bio-One</td>
			<td style="width:137px;">662160</td>
			<td style="width:187px;">for the staining of fixed slices</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:143px;">Merk</td>
			<td style="width:137px;">108643</td>
			<td style="width:187px;">see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">mouse anti-TH monoclonal primary</td>
			<td style="width:143px;">Immunostar</td>
			<td style="width:137px;">22941</td>
			<td style="width:187px;">working concentration: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568</td>
			<td style="width:143px;">Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A-11031</td>
			<td style="width:187px;">working concentration: 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:143px;">Dako</td>
			<td style="width:137px;">X0907</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">ProLong Diamond Antifade</td>
			<td style="width:143px;">Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">P36961</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Fluorescein Avidin DCS</td>
			<td style="width:143px;">Vector Lab</td>
			<td style="width:137px;">A-2011</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:156px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:143px;">Olympus</td>
			<td style="width:137px;">FV1000</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:156px;">ImageJ</td>
			<td style="width:143px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">NeuronJ</td>
			<td style="width:143px;">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">plugin for ImageJ</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Imaris</td>
			<td style="width:143px;">http://www.bitplane.com</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Reconstruction of biocytin filled neurons</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Neuromantic</td>
			<td style="width:143px;">http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Reconstruction of biocytin filled neurons</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:61px;width:156px;">WinWCP</td>
			<td style="width:143px;">http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Analysis of electrophysiological data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular patch-clamp recordings from the somatodendritic domain of nigral dopamine neurons

דנדריטים של נוירונים דופאמינרגיים לקבל ולהעביר קלט סינפטי, פוטנציאל פעולה תמיכה לאחור-לריבוי שחרור הנוירוטרנסמיטר. הבנת פונקציות בסיסיות אלה ישפכו אור על העברת מידע בנוירונים אלה. קלטות תיקון- clamp דנדריטים לספק את האפשרות לבחון את התכונות החשמליות ישירות של דנדריטים תעלות יוני מתח מגודר בסיסיות. עם זאת, מבנים בסדר אלה אינם נגישים בקלות טפטפות תיקון בגלל הקוטר הקטן שלהם. דו&quot;ח זה מתאר צעד אחר צעד הליך כדי לאסוף הקלטות יציבות ואמינות מן דנדריטים של נוירונים דופאמינרגיים פרוסים חריף. מדידות אלקטרו משולבות עם התאוששות פוסט הוק של מורפולוגיה תא. ניסויים מוצלחים להסתמך על הכנת שיפור של פרוסות, פתרונות טפטפות, התאמה נאותה של אופטיקה והיציבות של פיפטה במגע עם המבנה המוקלט. עקרונות תקן של סוםהקלטת תיקון- clamp atic מוחלת דנדריטים אבל עם גישה מתונה יותר של פיפטה. טכניקות צדדיות אלו יכולות להיות מיושמות על מנת לענות על שאלות שונות לגבי הנכסים להתרגש של דנדריטים.

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons at JoVE.com

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

הקלטות תיקון מהדק subcellular מן האחוזה Somatodendritic של נוירונים Nigral דופמין

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

subcellular-patch-clamp-recordings-from-somatodendritic-domain-nigral

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.8K Views.  Quartier Hôpital, 














University
of Liege. Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro. 

Video: Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

מותאמים הצמד תיקון הקלטות מ-מוטור נוירון שרירים יעד השלד דג הזברה

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

הקלטות קלאמפ תיקון בתאי שיער באוזן פנימיים מבודדות מדג הזברה

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondria are involved in many important cellular functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most important mitochondrial functions are related to the efficient production of ATP, the energy currency of the cell, by oxidative phosphorylation, and the mediation of signals for programmed cell death3.
The enzyme primarily responsible for the production of ATP is the F1FO-ATP synthase, also called ATP synthase4-5. In recent years, the role of mitochondria in apoptotic and necrotic cell death has received considerable attention. In apoptotic cell death, BCL-2 family proteins such as Bax enter the mitochondrial outer membrane, oligomerize and permeabilize the outer membrane, releasing pro-apoptotic factors into the cytosol6. In classic necrotic cell death, such as that produced by ischemia or excitotoxicity in neurons, a large, poorly regulated increase in matrix calcium contributes to the opening of an inner membrane pore, the mitochondrial permeability transition pore or mPTP. This depolarizes the inner membrane and causes osmotic shifts, contributing to outer membrane rupture, release of pro-apoptotic factors, and metabolic dysfunction. Many proteins including Bcl-xL7 interact with F1FO ATP synthase, modulating its function. Bcl-xL interacts directly with the beta subunit of F1FO ATP synthase, and this interaction decreases a leak conductance within the F1FOATPasecomplex, increasing the net transport of H+ by F1FO during F1FO ATPase activity8 and thereby increasing mitochondrial efficiency. To study the activity and modulation of the ATP synthase, we isolated from rodent brain submitochondrial vesicles (SMVs) containing F1FO ATPase. The SMVs retain the structural and functional integrity of the F1FO ATPase as shown in Alavian et al. Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of SMVs from rat brain and we delineate the patch clamp technique to analyze channel activity (ion leak conductance) of the SMVs.

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

A method to isolate submitochondrial vesicles enriched in F1FO ATP synthase complexes from rat brain is described. These vesicles allow the study of the activity of F1FO ATPase complex and its modulation using the technique of patch clamp recording.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; הכנת שלפוחיות ATPase וטכניקה לביצוע הקלטות מהדק תיקון של קרום שלפוחית ​​Submitochondrial

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

בידוד של נוירונים חושיים של<em&gt; Aplysia californica</em&gt; להקלטות מהדק תיקון של זרמי glutamatergic

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

תיקון הקלטות קלאמפ מתאים עוברי דג הזברה מאוטנר

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

אלקטרו ומורפולוגי אפיון של שבבים עצביים במוח חריף Slices שימוש מותאם Patch-קלאמפ הקלטות

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.