Agradeço ao Dr. Vincent Seutin por seu apoio constante, Christelle Gillissen e Laurent Massotte para excelente assistência técnica, Drs Jean Defourny e Sandra Ormenese para conselhos com o microscópio confocal, Dr Jacques destinar para o dom do segundo amplificador Axopatch 200B, o GIGA-Imaging plataforma para compartilhar o microscópio confocal e software Imaris e Dr. Stephen Freeman pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por subsídios da FRS belgas - FNRS (U.N002.13 e T.N0015.13) e publicado com o apoio da Fundação Universidade belga (Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique).

O autor declara que ele não tem interesses financeiros concorrentes.

Este relatório descreve um protocolo passo-a-passo para implementar gravações de célula inteira somatodendríticos duplas e gravações dendríticas locais. É útil para a determinação da influência de canais iónicos (isto é, I h) sobre o decurso de tempo de potenciais pós-sinápticos e mapeamento da distribuição do canal de iões (I h) ao longo do domínio somatodendrítico de neurónios da substância negra de DA, respectivamente. Resultantes medidas eletrofisiológicas são combinados para deixar histoquímica hoc para recuperar a morfologia das células. O procedimento foi utilizado para investigar neurónios DA localizados na substantia nigra, mas podem ser generalizados para os neurónios da substância negra vizinhos GABA, área tegmental ventral neurónios DA ou outros neurónios do mesencéfalo. Todas as etapas também podem ser seguidas para examinar outros canais iônicos expressos em dendrites dos neurónios da substância negra, sem modificações importantes. Visualização post hoc é particularmente pertinente para os neurônios com axônio-bearingdendrites, como neurônios da substância negra 25,26, hipocampo interneurônios Oriens-alveus 21 ou alguns neurônios piramidais CA1 67. Curiosamente, os neurônios que partilham esta característica parece ser mais comum do que geralmente se pensa 67. A análise morfológica revela também a posição precisa dos eletrodos e axônio. A detecção do último pode ser otimizado pela rotulagem de proteínas expressas no segmento axônio inicial (canais de Na + dependentes de voltagem ou Ankyrin G) usando imunohistoquímica 68,69. A fiabilidade dos dados recolhidos com as gravações dendríticas e rotulagem neuronal subsequente, invariavelmente, depende da qualidade fatia. Esforço máximo deve, pois, ser aplicado para preservar a viabilidade das células no tecido. Isto é conseguido com a manipulação suave de animais saudáveis, ferramentas de alta qualidade e reagentes, oxigenação suficiente das temperaturas de tecidos e geladas ao longo da preparação de fatias. condições de gravação estáveis ​​contam com a seleção de neurônios saudáveis. No modo de célula inteira, resistência em série inicialmente deverá ser tão baixo quanto possível e mantida constante ao longo da experiência. A estabilidade das gravações é mais dependente manipuladores de alta qualidade desprovidas de deriva e vibrações. Estas perturbações podem ser reduzidas através da optimização da estabilidade pipeta: verificar a ligação ao suporte da pipeta e a headstage, controlar que os cabos são micromaniplador folga, evitando alterações bruscas de temperatura ou o movimento fase e verificar o mecanismo do manipulador. Para as gravações dupla, metilsulfato 13,15,21 foi incluído na solução intracelular, mas gluconato 9,14,25 pode ser alternativamente empregue. No entanto, o principal anião podem alterar o potencial de membrana 70,71 e algumas correntes dependentes de voltagem 72. solução intracelular pode ser suplementado com ATP, GTP e fosfocreatina para preservar a physiolofunções gicos dos neurônios. Além disso, a adição de um corante fluorescente na solução de pipeta (por exemplo, Alexa 594 ou Sulforodamina 101 41) para visualizar os dendritos durante uma gravação somática pode ser útil, por exemplo para colocar um pedido de pressão (Figura 7 em Ref. 41) ou um estimulante eléctricos pipeta. A solução de pipeta para gravações ligado à célula contém uma alta concentração de K + e nenhum Na + para gravar grande I h. Digno de nota a proporção da concentração de Na + / K + influencia a amplitude da corrente 10, o potencial de inversão da corrente 11 e a propagação de h I 73. Como alternativa, eu h também podem ser gravados utilizando fora-outs 10. Nesta configuração de gravação no entanto, o meio intracelular na proximidade dos canais pode ser perturbado. Por conseguinte, as diferenças na activação dependente de voltagem de I &lt;sub&gt; h é observado quando as correntes comparando obtidos utilizando manchas ligado à célula e fora-outs 10. Inchaço dos neurônios é ocasionalmente encontrada durante a gravação de patch-clamp, e muitas vezes surge de causas distintas, tais como a baixa qualidade da água, forte desequilíbrio da osmolaridade ou pH entre a soluções de 39 ou erros intra e extracelular na composição de soluções. A qualidade dos registos electrofisiolicos tem uma incidência directa sobre a qualidade da morfologia de neurónios recuperados. Alta resistência pipetas somáticas são utilizados para gravações duplas (6 - 10 mohms, como nas refs 6,11.) E para gravações somáticos simples após gravações ligado de células para minimizar a diluição do meio intracelular 14. A gravação somática de célula completa após a gravação ligado de células é, portanto, mantido curto (&lt;10 min). patches de fora para fora de ambos os somáticas e dendríticas pipetas são essenciais para o fecho do cmembrana ell e subsequente recuperação da morfologia celular. Além disso a estrutura da célula, o conteúdo neuroquímica pode ser determinado para os neurónios gravados 59,74. Por exemplo, a proteína intracelular tirosina-hidroxilase pode ser immunolabeled para a identificação inequívoca dos neurónios DA 13. Neurónios DA concentram-se principalmente no SN pars compacta, com uma densidade muito mais baixa presentes no SN pars reticulata, onde eles são misturados com um maior número de neurónios GABA 75. Enquanto o corpo da célula dos neurónios DA é muitas vezes maior do que a de neurónios GABA, a identificação visual destas células com IR-videomicroscopia é incerto e parcialmente impedida pela opacidade da pars compacta. Para ultrapassar estas limitações, a pré-selecção de neurónios DA pode ser facilitada pela utilização de ratos transgénicos que expressam um marcador fluorescente, numa população específica de neurónios (TH 65 ou DAT para neurónios DA, GADpara os neurônios GABA) e iluminação de epifluorescência. Alternativamente, um corante fluorescente pode ser incluída na solução do eléctrodo somática para facilitar a visualização dos dendritos. O aumento da resolução da célula fluorescente é trazida por Nipkow confocal disco giratório 14,22,30 ou microscopia de dois fótons 7 combinados para IR-DGC 6. Várias vantagens estão relacionadas com DGC em comparação com DIC. Em primeiro lugar, na forma de prismas DIC não são requeridos, a imagem IR-DGC pode ser coberto com uma 49,52,53,76 imagem de fluorescência. Em segundo lugar, a DGC pode ser combinado com fotoestimulação e Optogenetics 77. Uma desvantagem de preparação fatia é a preservação da integridade dos neurónios. Neurónios DA alargar as suas dendrites nos três planos do espaço e, portanto, 78,79 truncamento do compartimento dendríticas não pode ser completamente evitada em fatias 80. A escolha da orientação de fatias (coronal, horizontal ou para-sagital) é um trade-off. A origem da inervação eo delineamento experimental devem ser considerados para selecionar a orientação da direita de fatias. patching dendrítica directa é a técnica utilizada para mapear a distribuição de canais de iões funcionais nos diferentes compartimentos das células. Além disso, esta técnica oferece para determinar a variabilidade nas propriedades funcionais dos canais 20. Como complemento a localização e densidade de canais de iões pode ser verificado usando imuno-histoquímica para a luz e microscopia eletrônica níveis 17,23. Essa abordagem também oferece a possibilidade de determinar a densidade de canais em estruturas de pequeno calibre que são inacessíveis para pipetas de patch. No entanto, estes canais pode estar em um estado funcional distinta 24 ou mesmo inativa em comparação com os registados utilizando técnicas de patch-clamp. Ambas as técnicas são, portanto, necessário para obter uma imagem completa da localização e propriedades decanais iônicos em uma região celular específica 17. Com o desenvolvimento de corantes sensíveis à voltagem, imagiologia de tensão foi usado para examinar a propagação de EPSPs de APs e em neurónios em vários locais 81. Como uma alternativa a dupla gravações de patch-clamp, esta abordagem pode ainda ser implementado por dendrites finas que não são acessíveis para pipetas patch, mas exigem uma calibração precisa do sinal e média. Enquanto neurónios DA na SN e área tegmental ventral são amplamente investigada por meio de gravações somáticas no contexto fisiológico e fisiopatológico, as propriedades funcionais das suas dendrites permanece largamente desconhecido em ambas as condições. Aplicação de patches de dendrites foi implementado para os neurónios dopaminérgicos da substância negra por vários grupos com sucesso 13,25,26 e continua a ser o método de escolha para dissecar propriedades excitáveis destas estruturas subcelulares finas 8. gravações dendríticas proporcionar uma maior opportuComunidade de fiscalizar a eficiência ea plasticidade da transmissão sináptica e da plasticidade da excitabilidade dendrítica 82,83.

Os neurónios receber informações sináptica predominantemente nas suas dendrites. Excitatórios e sinais inibitórios sinápticas espalhados do seu local de produção para o local de integração onde potenciais de acção (APs) são evocadas como o sinal de saída. Em seu caminho, potenciais sinápticos são influenciados tanto pela estrutura dos dendritos e da interação entre propriedades da membrana passivos e ativos. A combinação destes parâmetros altamente variáveis aumenta o poder computacional de neurónios 1,2. No entanto, o pequeno diâmetro de dendritos dificulta no entanto, o estudo das suas propriedades eléctricas. O contínuo desenvolvimento da técnica de patch-clamp 3, a óptica 4 e aperfeiçoamento de métodos para a preparação fatia 5 durante as últimas décadas têm permitido gravações de muito fina (0,7-3 mm Ø) dendrites 6,7. Estes métodos eram, e são, em grande parte, ainda usado para examinar a excitabilidade dos dendritos em uma varieneurônios F 8. Gravações dendríticas diretos são essenciais para determinar a distribuição 9-19 e as diferenças nas propriedades funcionais 20-22 de canais iônicos em compartimentos neuronais distintas. Estes dados são o complemento necessário das distribuições de canais de iões detectados com imunohistoquímica combinada à luz e microscopia eletrônica 23,24. Gravações somatodendríticos dupla têm sido implementadas para explorar a propagação dos potenciais de ação 9,13-15,21,22,25-27 e disseminação de potenciais sinápticos 13,16,18 ao longo do domínio somatodendrítico de neurônios, obtenção de modelos de cabos passivos detalhados 28- 30 e investigar a resolução temporal de integração neuronal 31. A substância negra (SN) é uma região localizada no meio do cérebro envolvida em várias funções, tais como o controlo do movimento, a codificação de recompensa e comportamentos habituais. A diminuição de dopamina devido à específicaperda de dopaminérgicos (DA) neurónios no SN está associado com os distúrbios motores observadas em pacientes que sofrem de doença de Parkinson 32. O circuito nigral é composto por dois tipos de células principais: dopaminérgicos e GABAérgicos neurónios. Curiosamente, esses neurônios têm várias características específicas que os distinguem de outros neurônios. O axônio de uma grande proporção de neurônios DA e alguns neurônios GABA origina de um site dendrítica, indicando que o mandril dendrítica é heterogênea (axônio-rolamento e dendrites-falta axônio) 25,26,33. A morfologia desses neurônios contrasta, por conseguinte, com a organização típica de neurônios em que a transferência de informações segue a lei da polarização dinâmica emitida por Cajal: a partir de dendrites, a soma e, finalmente, para axônio 34. Neurónios DA também são conhecidos para a libertação de dopamina a partir de suas dendrites 35, gerar actividade de rotura 36 e 37 plasticidade NMDA-receptor. a dissecçãoção desses fenômenos é evasivo, sem gravações directos a partir do local onde eles são iniciados. Para obter conhecimentos sobre a relação entre a localização precisa e propriedades funcionais dos canais de iões e o seu papel na excitabilidade e informações dendrítica transferência em neurónios da substância negra, gravações dendríticas directos são o método de escolha. Este relatório descreve um procedimento detalhado que pode ser usado para obter gravações de patch-clamp simples e dupla de dendrites dos neurónios da substância negra eo hoc biocitina rotulagem lugar correspondente. Os princípios básicos para remendar o somático e da membrana dendrítica são muito semelhantes. Praticamente no entanto, as gravações de sites dendríticas requerem otimização específica em comparação com gravações somáticas. gravações dendríticas sucedidas dependem da qualidade das fatias, ajuste ideal da óptica, abordagem suave da pipeta patch e estabilidade das gravações.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="621">
	<tbody>
		<tr height="137">
			<td height="137" style="height:138px;width:156px;">Double-distillated water</td>
			<td style="width:143px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">Super Q</td>
			<td style="width:187px;">&#160;Resistivity &#62;14 M&#937; cm, ideal 18.2 M&#937; cm at 25&#176;C, filtered (0.22 &#181;m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Microfilter candles</td>
			<td style="width:143px;">Robu</td>
			<td style="width:137px;">Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:156px;">Tissue slicer with vibroprobe</td>
			<td style="width:143px;">Leica</td>
			<td style="width:137px;">VT1200</td>
			<td style="width:187px;">cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Tissue slicer</td>
			<td style="width:143px;">Dosaka</td>
			<td style="width:137px;">DTK-1000</td>
			<td style="width:187px;">cutting parameters: speed 4, frequency 7</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Razor blades</td>
			<td style="width:143px;">Gilette</td>
			<td style="width:137px;">Super Silver</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:143px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Reserve chamber</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Custom-made</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">PP beckers</td>
			<td style="width:143px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">213-1725</td>
			<td style="width:187px;">400 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Syringe filter</td>
			<td style="width:143px;">Merk Millipore</td>
			<td style="width:137px;">Millex - GV 0,22 &#181;m</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Cyanoacrylate glue&#160;</td>
			<td style="width:143px;">UHU</td>
			<td style="width:137px;">&#34;Sekunden Kleber&#34;</td>
			<td style="width:187px;">liquid glue</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Recording chamber&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;">Slice mini chamber</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Horizontal pipette puller</td>
			<td style="width:143px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:137px;">Brown-Flaming P-97</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Pipettes</td>
			<td style="width:143px;">Hilgenberg</td>
			<td style="width:137px;">1807524</td>
			<td style="width:187px;">2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Dental wax</td>
			<td style="width:143px;">Colt&#232;ne/Whaledent</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">orthodontic tray wax strips</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Platinum grid</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Microforge</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:137px;">MF-830</td>
			<td style="width:187px;">to fire-polish pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:156px;">Potassium methyl sulfate</td>
			<td style="width:143px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:137px;">215481</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:156px;">Biocytin</td>
			<td style="width:143px;">Molecular probes</td>
			<td style="width:137px;">B1592</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:156px;">Manometer</td>
			<td style="width:143px;">GREISINGER electronic</td>
			<td style="width:137px;">GDH 13 AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:156px;">Microscope</td>
			<td style="width:143px;">Zeiss</td>
			<td style="width:137px;">FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:156px;">Dodt Gradient Contrast</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Manipulators</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;">LN Mini 25</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:156px;">Frame grabber</td>
			<td style="width:143px;">The Imaging Source</td>
			<td style="width:137px;">DFG/USB2pro</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Camera</td>
			<td style="width:143px;">DAGE-MTI</td>
			<td style="width:137px;">NC-70</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:156px;">Condenser</td>
			<td style="width:143px;">Zeiss</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">high numerical aperture condenser working with oil</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:156px;">Objective</td>
			<td style="width:143px;">Zeiss</td>
			<td style="width:137px;">W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR</td>
			<td style="width:187px;">63x magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:156px;">Fourfold-changer</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">between the camera and the microscope</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:156px;">Black &#38; white video monitor</td>
			<td style="width:143px;">Sony</td>
			<td style="width:137px;">SSM-175CE</td>
			<td style="width:187px;">16-inch, 850 TV lines, analog</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:156px;">Sample Bottles, Amber Glass, with Cap</td>
			<td style="width:143px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">215-2409</td>
			<td style="width:187px;">to transfer slices from the setup to histology room</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">The Axon Guide</td>
			<td style="width:143px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Book</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:156px;">Stimfit</td>
			<td style="width:143px;">https://github.com/neurodroid/stimfit</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Analysis of electrophysiological data</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:156px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">441244</td>
			<td style="width:187px;">see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:26px;width:156px;">Well cell culture plate</td>
			<td style="width:143px;">Greiner-Bio-One</td>
			<td style="width:137px;">662160</td>
			<td style="width:187px;">for the staining of fixed slices</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:143px;">Merk</td>
			<td style="width:137px;">108643</td>
			<td style="width:187px;">see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">mouse anti-TH monoclonal primary</td>
			<td style="width:143px;">Immunostar</td>
			<td style="width:137px;">22941</td>
			<td style="width:187px;">working concentration: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568</td>
			<td style="width:143px;">Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A-11031</td>
			<td style="width:187px;">working concentration: 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:143px;">Dako</td>
			<td style="width:137px;">X0907</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">ProLong Diamond Antifade</td>
			<td style="width:143px;">Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">P36961</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Fluorescein Avidin DCS</td>
			<td style="width:143px;">Vector Lab</td>
			<td style="width:137px;">A-2011</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:156px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:143px;">Olympus</td>
			<td style="width:137px;">FV1000</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:156px;">ImageJ</td>
			<td style="width:143px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">NeuronJ</td>
			<td style="width:143px;">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">plugin for ImageJ</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Imaris</td>
			<td style="width:143px;">http://www.bitplane.com</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Reconstruction of biocytin filled neurons</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Neuromantic</td>
			<td style="width:143px;">http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Reconstruction of biocytin filled neurons</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:61px;width:156px;">WinWCP</td>
			<td style="width:143px;">http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Analysis of electrophysiological data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular patch-clamp recordings from the somatodendritic domain of nigral dopamine neurons

Dendrites dos neurónios dopaminérgicos receber e transmitir entrada sináptica, suporte potencial de ação back-propagação e liberação de neurotransmissores. Entender essas funções fundamentais irá lançar luz sobre a transferência de informações nestes neurônios. Dendríticas gravações de patch-clamp prevê a possibilidade de examinar diretamente as propriedades elétricas dos dendritos e canais de iões dependentes da voltagem subjacentes. No entanto, estas estruturas finas não são facilmente acessíveis para pipetas de patch por causa do seu pequeno diâmetro. Este relatório descreve um procedimento passo-a-passo para recolher gravações estáveis ​​e fiáveis ​​a partir dos dendritos de neurônios dopaminérgicos em fatias aguda. Medidas eletrofisiológicas são combinados com a recuperação post hoc da morfologia celular. experiências bem sucedidas dependem melhorado de preparação de fatias, soluções e pipetas, um ajuste adequado da óptica e estabilidade da pipeta em contacto com a estrutura gravada. princípios padrão de somatic gravação de patch-clamp são aplicados aos dendritos, mas com uma abordagem mais suave da pipeta. Estas técnicas versáteis podem ser implementadas para abordar várias questões relativas às propriedades excitáveis ​​de dendrites.

O protocolo descrito acima tem a intenção de facilitar a recolha de dados através de gravações de patch-clamp dendríticas. Esta técnica, combinada com histoquímica post hoc, ajuda a obter insights sobre os mecanismos de muitos sinais elétricos originários ou espalhamento em dendrites. Acesso directo à dendrites com pipetas de patch é difícil, mas especial atenção a vários aspectos metodológicos irá melhorar a taxa de sucesso das gravações. Um experimentador suficientemente experientes em gravação somática estável pode esperar obter selos de alta resistência (GÊ) e experiências completas sobre a maioria das tentativas. Uma a duas gravações dendríticas de alta qualidade podem ser recolhidos por dissecção. A disponibilidade de fatias de cérebro de alta qualidade contendo somata saudável e dendrites é um pré-requisito para acesso a essas estruturas finas (Figura 1). o criteriuma para selecionar esses neurônios são uma superfície lisa e homogênea em todo o celular e um soma e dendritos de baixo contraste, quando observada com óptimas ajustado óptica (Figura 1A e 1B). Seleção de neurônios muito fortemente contrastada geralmente leva a gravações instáveis (Figura 1C e 1c). Por conseguinte, tais neurónios deve ser evitada. Em comparação com outros neurônios, os neurônios da substância negra DA exibir características morfológicas e eletrofisiológicas específicos. Estas características geralmente avaliadas com uma única pipeta somática também pode ser observada em dupla somática (Figura 2) e gravações de somatodendríticos (Figura 3). Longos injeções atuais hiperpolarizantes induzir uma rectificação potencial de membrana chamada &quot;sag&quot; (Figuras 2B e 5D). O axónio origina, na maioria dos casos, num sítio dendrítica tal como identificadousando critérios complementares 13,25,26, indicando que o compartimento dendrítica nestes neurónios é heterogénea (Figura 3A - 3B). Como consequência, o compartimento onde o AP é observado em primeiro lugar corresponde ao compartimento no qual o axónio emerge (Figura 3C - 3D) 13,25,26. O axónio é geralmente terminada por uma bolha axonal causado por um corte do axónio durante corte 64, mas esta estrutura não é sistematicamente detectado. A retracção pronunciada observada em neurónios da substância negra consecutivo para a activação da I h sugere uma elevada expressão de subunidades de HCN. Para determinar a influência da I h na integração de sinais sinápticos, correntes (EPSC) formas de onda sinápticas-like foram gerados e injetado através do eletrodo de registro dendríticas durante as gravações dupla somatodendríticos 55 (&lt;forte&gt; Figura 4). A cinética destas EPSCS simulados foram baseadas em ascensão e tempo de decaimento constantes de EPSCS espontâneas reais. O aEPSP resultante foi gravado com o eletrodo somática. Aplicação no banho do I h bloqueador ZD 7288 aumentou a duração da aEPSP, indicando a contribuição de I h para o curso de tempo dos sinais sinápticas (Figura 4B). ZD 7288 aboliu também a membrana rectificação potencial confirmando que os resultados SAG da activação da I h (Figura 4C). Os resultados obtidos com os EPSPs simuladas pode ser correlacionada com experiências que utilizam EPSPs evocados electricamente 65. Para mapear a distribuição precisa do canal no domínio somatodendrítico de neurónios DA, gravações ligado de células foram executadas (Figura 5). A selagem de alta resistência (&gt;&gt; 1 GÊ) é uma necessidade absoluta para as gravações ligado de células (Figura 5B </strong&gt;). Em dendrites dos neurónios DA, Eu h activa lentamente com degraus de tensão hiperpolarizantes de comprimento e o estado de equilíbrio de corrente é atingido após centenas de ms (Figura 5C), como mostrado anteriormente 66. Esta observação indica que os canais HCN expressos em dendrites dos neurónios DA possuem diferentes subunidades em comparação com aqueles em neurónios piramidais ou de outros tipos de células 10,16,66. À medida que a distribuição do canal pode ser não homogénea no compartimento dendrítica e como o compartimento dendrítica é em si heterogéneos, a identidade do dendrito (axónio-rolamento ou dendrito nonaxon-rolamento) é revelada por comparação da imagem IR-DGC com a imagem confocal após coloração biocitina (Figura 3A e B). Recuperação da morfologia das células é, portanto, necessário para ambas as gravações de somatodendríticos dupla e para gravações ligado à célula por meio de gravações de células somáticas toda subsequentes. Figura 1. Visualizando o Soma e proximal dendrites dos neurônios dopaminérgicos da substância negra usar o infravermelho Videomicroscopia. (A) IR-DGC imagem de um neurônio DA nigral mostrando a soma e dendritos proximais e duas pipetas somáticas e dendríticas. Uma gravação somatodendrítico dupla foi realizada com sucesso neste neurônio saudável. Observar o baixo contraste e a superfície lisa em todo o domínio somatodendrítico da célula. (B) Um outro exemplo de um neurónio DA saudável. (C) DA neurónio com uma superfície mais áspera e desigual e um contraste forte. Embora tenha sido obtida uma gravação dupla, a estabilidade foi abaixo do ideal, e a duração da gravação foi curto (~ 15 min) devido a um aumento gradual da resistência acesso em ambas as pipetas. (D) segundo exemplo de um neurônio DA mostrando uma fortemente contrastada soma e dendritos proximal. Neste caso, um forte aumento da resistência acesso foi observada pouco depois da pausa no modo de célula inteira. Uma tentativa de diminuir a resistência acesso por pressão negativa não teve sucesso. Neurónios no painel C e D podem ter sido danificados durante o procedimento de corte e deve ser evitado para experiências. (E) simultânea dupla gravação somática num neurónio DA saudável no início da gravação. (F) O mesmo neurónio como no painel E com um corpo da célula inchada depois de ~ 17 min. Note a ausência completa de contraste, a aparência bola-like da soma e a presença do grande núcleo que não é aparente em neurônios saudáveis. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54601/54601fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig2.jpg" /> Figura 2. </strong&gt; simultânea Duplo Somatic gravação de uma DA Neuron. (A) IR-DGC imagem durante a gravação de dupla somática a partir de um neurônio DA. (B) hiperpolarizando e despolarização 1 s injeções de corrente longa (-160 a 80 pA, incremento de 80 pA) e variações de tensão correspondentes gravados simultaneamente com as duas pipetas de patch. Note a presença do afundamento no rastreio de tensão com a etapa atual de hiperpolarização longa e grande pós-hiperpolarização após a AP durante o pulso de corrente de despolarização. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54601/54601fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig3.jpg" /> Figura 3. dupla S Gravação omatodendritic num DA Neuron. (A) imagem IR-DGC de um neurônio DA. A distância entre a dendrítica e somapipeta tique é 29 uM imagem. (B) z-confocal projecção do neurónio no painel A marcado com avidina conjugada com isotiocianato de fluoresceína (FITC). O neurônio foi preenchido com biocitina durante a gravação. O axônio originado de um dendrito proximal perto da soma, tal como indicado pela seta. (C) a gravação de tensão de célula inteira somatodendrítico dupla simultânea do neurônio no painel A. AP registrado na soma (vestígios de tensão preto) e dendritos (tensão vermelho traços) em resposta a um 1 s passo de injecção de corrente longa via somática (da esquerda; traçado atual preto) e pipeta alternativamente dendríticas (direita; traço corrente vermelha) (D) somática e AP dendrítica mostradas na escala de tempo expandido.. Com qualquer somática ou injeção de corrente dendrítica, a AP somáticas (preto) precedeu a AP dendríticas (vermelho). O atraso entre APs neste neurônio foi de 120 ms e 210 mS com somático e injeção de corrente dendrítica, respectivamente. atrasosforam medidos no AP amplitude semi-máxima durante a fase de subida do AP. A AP é observada pela primeira vez no compartimento próximo ao qual o axônio emerge, confirmando observações anteriores 25,26. Neste caso, a gravação dendrítica é feita a partir de uma dendrite-falta axónio. Um exemplo de uma gravação de uma dendrite axônio de rolamento está em Ref. 13 (na sua Fig. 1). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54601/54601fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig4.jpg" /> Figura 4. Propagação da EPSPs artificiais ao longo do somatodendrítico Axis of DA neurônios. (A) imagem IR-DGC de um neurônio DA. A distância entre a pipeta e dendrítica somática é de 45 uM. Ambas as pipetas de patch está no modo de célula inteira de gravação actual-clamp. (B) Correntegravado com a pipeta dendrítica na corrente de grampo e usado para gerar o EPSP artificial (topo). A corrente é obtida pela injecção de uma forma de onda semelhante EPSC (t rise = 0,6 ms; τ decaimento = 3 ms de amplitude = 100 Pa) através do dendrítica pipeta de gravação 55. Na parte inferior, aEPSPs registados no soma em condições de controle (preto) propagado e depois da aplicação do banho do ZD7288 I h bloqueador (30 mM; traço vermelho). Cada traço de tensão é a média de 40 varreduras individuais. Observar o grande aumento da duração do EPSP na presença de ZD7288 indicando a contribuição de I h para o curso de tempo de EPSP. (C) Tensão vestígios gravados a partir do soma, em condições de controlo (preto) e após a aplicação de 30 | iM ZD 7288 ( vermelho) em resposta a uma longa (30 pa; 1 s) passo actual hiperpolarizante. Note-se a ausência do potencial de membrana de rectificação (SAG), após o bloqueio de I &lt;sub&gt; h. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54601/54601fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig5.jpg" /> Figura 5. Presença de I h em dendritos das DA Neuron. (A) IR-DGC imagem de um neurônio DA e pipeta sobre dendrito proximal. (B) capacitivo e de vazamento de correntes durante um comando de tensão 5 mV na configuração anexado à célula. A resistência de selagem foi GÊ 5, neste exemplo, o passo (C) tensão de hiperpolarização. (90 mV; parte superior) a partir de um potencial de membrana 0 mV induzida uma activação lentamente I h. O rastreio da corrente foi invertida e equipada com uma única função exponencial dá uma constante de tempo de t = 632 ms. (D) Tensãorespostas da soma registrada de células inteiras (painel A) a 1 s hiper e despolarizantes pulsos de corrente (-160 a 120 Pa, 40 pA de incremento). A gravação de célula inteira somáticas foi realizado após a gravação ligado à célula. Note-se a ausência de APs devido à aplicação extracelular da TTX e Cd 2+ suprime a ativação espontânea durante a gravação ligado à célula. Estes voltagem dependentes de Na + e Ca 2+ bloqueadores atuais foram adicionados a suprimir as correntes de ação. Os painéis A - D, são do mesmo neurónio (E) imagem IR-DIC de outro neurónio DA e uma pipeta dendrítica correntes (F) de tensão-dependentes activados por um pulso de teste de 0 mV a partir de um pré-pulso de 50 ms a -120 mV.. em um patch de fora para fora excisada do dendrito proximal do neurônio no painel E. Segurar potencial de -80 mV. Note-se a inativação dependente do tempo da corrente. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54601/54601fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma maior</a>versão desta figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substância </td><td> g / mol </td><td> Concentração </td><td> para 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,443 </td><td> 125 mM </td><td> 7.305 g </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mM </td><td> 2.100 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,551 </td><td> 2,5 mm </td><td> 0,186 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137.99 </td><td> 1,25 mM </td><td> 0,172 g </td></tr><tr><td> glicose </td><td> 198,17 </td><td> 25 mM </td><td> 4,95 g </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 M (solução) </td><td> 1 mM </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1 M (solução) </td><td> 2 mM </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaridade: ~ 310 mOsmol / L (intervalo ideal: 314-325 mOsmol / L), pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: fluido cerebrospinal artificial (ACSF). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substância </td><td> g / mol </td><td> Concentração </td><td> para 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,443 </td><td> 87 mM </td><td> 5.084 g </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mM </td><td> 2,1001 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 7,551 </td><td> 2,5 mm </td><td> 0,18637 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137.99 </td><td> 1,25 mM </td><td> 0,17248 g </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 M (solução) </td><td> 7 mM </td><td> 7 mL </td></tr><tr><td> glicose </td><td> 198,17 </td><td> 10 mM </td><td> 1,9817 g &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> sacarose </td><td> 342,29 </td><td> 75 mM </td><td> 25,672 g </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1 M (solução) </td><td> 0,5 mM </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaridade: ~ 326 mOsmol / l, pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabela 2: sacarose-ACSF para preparar fatias. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substância </td><td> g / mol </td><td> Concentração </td><td> para 100 ml </td></tr><tr><td> KMeSO 4 </td><td> 150,2 </td><td> 120 mM </td><td> 1,8024 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 20 mM </td><td> 0,14912 g </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 M (solução) </td><td> 2 mM </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> Na 2 ATP </td><td> 551,1 </td><td> 2 mM </td><td> 0,1102 g </td></tr><tr><td> Na 2 GTP </td><td> 523,2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 0,02661 g </td></tr><tr><td> Na 2 -Phosphocreatine </td><td> 255,1 </td><td> 5 mM </td><td> 0,1275 g </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 380,4 </td><td> 0,1 mM </td><td> 3.803 mg </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23831 g </td></tr><tr><td> biocitina </td><td> 1 mg / mL </td><td></td><td> 0,1 g </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaridade: ~ 302 mOsmol / l, pH = 7,2 ajustado com KOH </td></tr></tbody></table> Tabela 3: solução intracelular para gravações dupla. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substância </td><td> g / mol </td><td> Concentração </td><td> para 100mL </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 120 mM </td><td> 0,8947 g </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1 M (solução) </td><td> 2 mM </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 M (solução) </td><td> 1 mM </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23831 </td></tr><tr><td> TEA-Cl </td><td> 165,7 </td><td> 20 mM </td><td> 0,3314 g </td></tr><tr><td> 4-AP </td><td> 94,11 </td><td> 5 mM </td><td> 0,04705 g </td></tr><tr><td> BaCl2 </td><td> 244,26 </td><td> 1 mM </td><td> 0,02443 g </td></tr><tr><td> CdCl2 </td><td> 183,32 </td><td> 0,02 mm </td><td> 0.3666 mg </td></tr><tr><td> TTX </td><td> 1 mM </td><td> 200 nM </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaridade: ~ 290 mOsmol / L, ajustado com D-glicose (Ref. 16); pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabela 4: Solução de eletrodo para gravações ligado por células.

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Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcelulares Gravações patch-clamp do domínio somatodendrítico da substância negra dopamina Neurônios

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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University
of Liege. Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro. 

Vídeo: Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Neurociência

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Gravações patch emparelhado Grampo da Motor-neurônio e músculo alvo ósseas em Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Gravações patch clamp em células ciliadas da orelha interna Isolado de Zebrafish

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondria are involved in many important cellular functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most important mitochondrial functions are related to the efficient production of ATP, the energy currency of the cell, by oxidative phosphorylation, and the mediation of signals for programmed cell death3.
The enzyme primarily responsible for the production of ATP is the F1FO-ATP synthase, also called ATP synthase4-5. In recent years, the role of mitochondria in apoptotic and necrotic cell death has received considerable attention. In apoptotic cell death, BCL-2 family proteins such as Bax enter the mitochondrial outer membrane, oligomerize and permeabilize the outer membrane, releasing pro-apoptotic factors into the cytosol6. In classic necrotic cell death, such as that produced by ischemia or excitotoxicity in neurons, a large, poorly regulated increase in matrix calcium contributes to the opening of an inner membrane pore, the mitochondrial permeability transition pore or mPTP. This depolarizes the inner membrane and causes osmotic shifts, contributing to outer membrane rupture, release of pro-apoptotic factors, and metabolic dysfunction. Many proteins including Bcl-xL7 interact with F1FO ATP synthase, modulating its function. Bcl-xL interacts directly with the beta subunit of F1FO ATP synthase, and this interaction decreases a leak conductance within the F1FOATPasecomplex, increasing the net transport of H+ by F1FO during F1FO ATPase activity8 and thereby increasing mitochondrial efficiency. To study the activity and modulation of the ATP synthase, we isolated from rodent brain submitochondrial vesicles (SMVs) containing F1FO ATPase. The SMVs retain the structural and functional integrity of the F1FO ATPase as shown in Alavian et al. Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of SMVs from rat brain and we delineate the patch clamp technique to analyze channel activity (ion leak conductance) of the SMVs.

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

A method to isolate submitochondrial vesicles enriched in F1FO ATP synthase complexes from rat brain is described. These vesicles allow the study of the activity of F1FO ATPase complex and its modulation using the technique of patch clamp recording.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; Ó</sub&gt; ATPase Vesicle Preparação e Técnica para Execução de Remendo Recordings Grampo de membranas de vesículas submitocondriais

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolamento de neurônios sensoriais de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Para Remendo Recordings Grampo de Correntes glutamatérgicos

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Grampo patch Gravações de Embryonic Cells Zebrafish Mauthner

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-cell Recordings patch-clamp de Morphologically- e identificados Neuroquimicamente hipocampo Interneurônios

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Eletrofisiológica e Caracterização Morfológica de Neuronal Microcircuits em aguda fatias do cérebro do Usando Emparelhados patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.