أشكر الدكتور فنسنت Seutin على دعمه المستمر، كريستيل Gillissen ولوران Massotte للحصول على مساعدة فنية ممتازة، الدكاترة جان Defourny وساندرا Ormenese للالنصائح مع المجهر متحد البؤر، الدكتور جاك خصص لهبة الثاني مكبر للصوت Axopatch 200B، وGIGA-التصوير منصة لتبادل المجهر متحد البؤر والبرمجيات Imaris والدكتور ستيفن فريمان لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من FRS البلجيكية - FNRS (U.N002.13 وT.N0015.13) ونشر بدعم من مؤسسة جامعة البلجيكي (Publié AVEC LE المناظرات دي لا مؤسسة الجامعي دو بلجيك).

يعلن صاحب البلاغ أنه لا يوجد لديه المصالح المالية المتنافسة.

ويصف هذا التقرير بروتوكول خطوة بخطوة لتنفيذ المزدوجة somatodendritic تسجيلات خلية كاملة والتسجيلات شجيري المحلية. ومن المفيد لتحديد تأثير القنوات الأيونية (أي أنا ح) على مدار الساعة من إمكانات بعد المشبكي ورسم خرائط توزيع القناة الايونية (أنا ح) على نطاق somatodendritic من الخلايا العصبية DA سودائي، على التوالي. يتم الجمع بين الناتج القياسات الكهربية للنشر الكيمياء النسيجية خاصة لاسترداد مورفولوجيا الخلايا. كان يعمل الإجراء للتحقيق في الخلايا العصبية DA الموجودة في المادة السوداء، ولكن يمكن تعميمها على الخلايا العصبية المجاورة سودائي GABA، منطقة الجوفية السقيفية الخلايا العصبية DA أو غيرها من الخلايا العصبية الدماغ المتوسط. كما يمكن اتباع جميع الخطوات اللازمة لفحص القنوات الأيونية أخرى أعرب في التشعبات من الخلايا العصبية سودائي دون تعديلات هامة. اللاحق التصور هو أهمية خاصة لالخلايا العصبية مع محور عصبي الحملالتشعبات، مثل الخلايا العصبية سودائي 25،26، الحصين interneurons oriens-شكوة 21 أو بعض الخلايا العصبية CA1 الهرمي 67. ومن المثير للاهتمام، ويبدو أن الخلايا العصبية تقاسم هذه الميزة لتكون أكثر شيوعا مما يعتقد عموما 67. ويكشف التحليل الصرفي أيضا الموضع الدقيق للأقطاب ومحور عصبي. قد يكون الأمثل للكشف عن هذا الأخير من قبل وضع العلامات على البروتينات وأعرب في هذا الجزء محور عصبي الأولي (قنوات الصوديوم الجهد بوابات أو Ankyrin G) باستخدام المناعية 68،69. موثوقية البيانات التي تم جمعها مع التسجيلات الجذعية ووضع العلامات العصبية اللاحقة يعتمد دائما على نوعية شريحة. لذا أقصى الجهود يجب أن تطبق للحفاظ على سلامة الخلايا داخل الأنسجة. ويتحقق ذلك مع التعامل مع لطيف من الحيوانات السليمة، وأدوات ذات جودة عالية والكواشف، الأوكسجين الكافي لدرجات حرارة الأنسجة والجليد الباردة خلال فترة إعداد شرائح. تعتمد ظروف التسجيل مستقرة على اختيار الخلايا العصبية السليمة. في وضع خلية كاملة، يجب سلسلة المقاومة في بادئ الأمر عند أدنى مستوى ممكن وحافظت ثابتة في كافة مراحل التجربة. استقرار التسجيلات يعتمد كذلك على المتلاعبين ذات جودة عالية خالية من الانجراف والاهتزازات. يمكن تخفيض هذه الاضطرابات عن طريق تحسين الاستقرار ماصة: التحقق من اتصال حامل ماصة وheadstage، الذي يسيطر على تلك الكابلات micromanipulator هي الركود، وتجنب التغيرات المفاجئة في درجة الحرارة أو حركة المسرح وفحص آلية مناور. للحصول على تسجيلات مزدوجة، أدرج ميثيل 13،15،21 في حل داخل الخلايا، ولكن غلوكونات 9،14،25 يمكن بدلا من ذلك أن تستخدم. ومع ذلك، فإن أنيون الرئيسي قد يغير غشاء المحتملة 70،71 وبعض التيارات التي تعتمد على الجهد 72. يمكن استكمال حل داخل الخلايا مع ATP، GTP وفسفوكرياتين للحفاظ على physioloوظائف gical من الخلايا العصبية. بالإضافة إلى ذلك، إضافة صبغة الفلورسنت في حل ماصة (على سبيل المثال، اليكسا 594 أو Sulforhodamine 101 41) لتصور التشعبات خلال تسجيل الجسدية يمكن أن تكون مفيدة على سبيل المثال لوضع تطبيق الضغط (الشكل 7 في المرجع 41) أو تحفيز كهربائي ماصة. الحل ماصة للتسجيلات الخلية المرفقة يحتوي على تركيز K + عالية ولا نا + لتسجيل كبيرة أنا ح. الجدير بالذكر أن نسبة تركيز الصوديوم + / K + يؤثر على السعة الحالية 10، واحتمال انعكاس لل11 الحالي والمحاصرة من أنا ح 73. بدلا من ذلك، ح يمكنني أيضا أن يسجل استخدام خارج الرافضة 10. في هذا التكوين تسجيل ومع ذلك، قد يكون أقلقت الوسط بين الخلايا في القرب من القنوات. ونتيجة لذلك، فإن الاختلافات في تفعيل تعتمد على الجهد I &lt;لوحظ الفرعية&gt; ح عندما حصلت التيارات مقارنة باستخدام بقع الخلية المرفقة وخارج الرافضة 10. واجه تورم الخلايا العصبية في بعض الأحيان أثناء تسجيل التصحيح، المشبك، وغالبا ما ينشأ من أسباب واضحة مثل تدني نوعية المياه، وعدم التوازن القوي في الأسمولية أو درجة الحموضة بين حلول 39 أو أخطاء في داخل وخارج الخلية في تكوين الحلول. جودة التسجيلات الكهربية لديها حالات مباشر على نوعية مورفولوجيا الخلايا العصبية استردادها. وتستخدم عالية المقاومة الماصات الجسدية للتسجيلات المزدوجة (6-10 MΩ، كما هو الحال في المراجع 6،11) وللتسجيلات الجسدية واحدة بعد التسجيلات الخلية المرفقة للحد من التخفيف من الوسط بين الخلايا 14. ولذا فإن خلية كاملة تسجيل الجسدية بعد تسجيل الخلية المرفقة تظل قصيرة (&lt;10 دقيقة). بقع خارج التدريجي من كل من جسدي وشجيري الماصات ضرورية لإقفال السليم للجغشاء الذراع وانتعاش لاحق من مورفولوجيا الخلايا. بالإضافة إلى بنية الخلية، يمكن تحديد محتوى الكيميائية العصبية للخلايا العصبية سجلت 59،74. على سبيل المثال، فإن الخلايا بروتين تيروزين هيدروكسيلاز يمكن immunolabeled لتحديد قاطع للخلايا العصبية DA 13. وتتركز أساسا الخلايا العصبية DA في SN بارس المكتنزة، ذات كثافة أقل بكثير موجودة في SN بارس الشبكي، حيث اختلط أنها تحتوي على عدد أكبر من الخلايا العصبية GABA 75. في حين أن خلايا الجسم من الخلايا العصبية DA غالبا ما تكون أكبر من أن الخلايا العصبية GABA، وتحديد البصرية من هذه الخلايا مع IR-videomicroscopy غير مؤكد وعرقلت جزئيا التعتيم على المكتنزة بارس. وللتغلب على هذه القيود، وانتقاء ما قبل الخلايا العصبية DA يمكن أن يتيسر من خلال استخدام الفئران المعدلة وراثيا معربا عن علامة فلوري في مجموعة سكانية محددة من الخلايا العصبية (TH 65 أو DAT لالخلايا العصبية DA، GADلالخلايا العصبية GABA) والإضاءة epifluorescence. بدلا من ذلك، قد يتم تضمين صبغة الفلورسنت في حل من القطب الجسدية لتسهيل التصور من التشعبات. يتم إحضارها عن قرار زيادة الخلية الفلورسنت التي كتبها نيبكو الغزل القرص مبائر 14،22،30 أو اثنين الفوتون المجهري 7 مجتمعة لIR-DGC 6. ترتبط العديد من المزايا لنادي دبي للجواهر بالمقارنة مع مدينة دبي للإنترنت. أولا، كما لا يطلب رشة عمل مدينة دبي للإنترنت، وصورة IR-DGC يمكن مضافين مع 49،52،53،76 صورة مضان. ثانيا، نادي دبي للجواهر يمكن الجمع بين ضوئي وعلم البصريات الوراثي 77. والعيب من إعداد شريحة هو الحفاظ على سلامة الخلايا العصبية. الخلايا العصبية DA تمتد التشعبات في الطائرات المكانية الثلاثة 78،79 وبالتالي اقتطاع مقصورة شجيري لا يمكن تجنبها تماما في شرائح 80. اختيار اتجاه شرائح (الاكليلية، أفقي أو الفقرةالسهمي) هو المفاضلة. يجب النظر في أصل تعصيب والتصميم التجريبي لتحديد الاتجاه الصحيح للشرائح. الترقيع شجيري المباشر هو أسلوب يستخدم لرسم خريطة للتوزيع القنوات الأيونية وظيفية في مقصورات مختلفة من الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية تتيح لتحديد التغير في الخصائص الفنية للقنوات 20. واستكمالا للموقع وكثافة من القنوات الأيونية يمكن التأكد باستخدام المناعية في مستويات الضوء والمجهر الالكتروني 17،23. كما يوفر هذا النهج إمكانية تحديد كثافة قناة في الهياكل عيار الصغيرة التي لا يمكن الوصول إليها لماصات التصحيح. ولكن هذه القنوات قد يكون في حالة وظيفية متميزة 24 أو حتى غير نشطة مقارنة مع تلك المسجلة باستخدام تقنيات التصحيح، المشبك. ولذلك فإن الضرورية للحصول على صورة كاملة للموقع وخصائص كل من تقنياتالقنوات الأيونية في منطقة خلوية معينة (17). مع تطور الأصباغ الحساسة الجهد، وقد استخدم التصوير الجهد لدراسة انتشار نقاط وصول وEPSPs في الخلايا العصبية في مواقع متعددة 81. كبديل لالمزدوجة التسجيلات التصحيح، المشبك، ويمكن هذا النهج حتى يتم تنفيذ لالتشعبات رقيقة التي لا يمكن الوصول إلى ماصات التصحيح ولكن يتطلب معايرة دقيقة للإشارة والمتوسط. بينما الخلايا العصبية DA في SN ومنطقة الجوفية السقيفية يتم التحقيق فيها على نطاق واسع عبر تسجيلات الجسدية في سياق الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض، والخصائص الفنية للالتشعبات لا تزال مجهولة إلى حد كبير في كل الظروف. الترقيع من التشعبات تم تنفيذه لالخلايا العصبية الدوبامين سودائي من قبل العديد من الجماعات مع نجاح 13،25،26 ويبقى الأسلوب المفضل لتشريح خصائص منفعل من هذه الهياكل التحت خلوية غرامة 8. توفر تسجيلات شجيري مزيد من opportuNITY للتدقيق كفاءة ومرونة انتقال متشابك واللدونة من استثارة شجيري 82،83.

تتلقى الخلايا العصبية المعلومات متشابك الغالب على التشعبات. مثير وإشارات متشابك المثبطة نشر من موقعهم من جيل إلى الموقع التكامل حيث أثار امكانات العمل (الجزائرية) كما إشارة خرج. في طريقهم، وتتأثر إمكانات متشابك من قبل كل من هيكل من التشعبات والتفاعل بين خصائص الغشاء السلبية والإيجابية. الجمع بين هذه المعايير اختلافا كبيرا يتسع الطاقة الحسابية من الخلايا العصبية 1،2. ومع ذلك، فإن قطره صغير من التشعبات يعيق لكن دراسة خواصها الكهربائية. التطوير المستمر لتقنية التصحيح، المشبك 3، والبصريات 4 وصقل طرق تحضير شريحة 5 خلال العقود الماضية مكنت التسجيلات من رقيقة جدا (0،7-3 ميكرون Ø) التشعبات 6،7. وكانت هذه الأساليب، و، لا تزال تستخدم إلى حد كبير لفحص استثارة التشعبات في مجموعة سالخلايا العصبية و 8. التسجيلات شجيري المباشرة ضرورية لتحديد التوزيع 9-19 والاختلافات في الخصائص الفنية 20-22 من القنوات الأيونية في مقصورات العصبية متميزة. هذه البيانات هي تكملة ضرورية لتوزيعات القناة الايونية الكشف مع المناعية مجتمعة للضوء والإلكترون المجهري 23،24. وقد تم تنفيذ تسجيلات somatodendritic المزدوجة لاستكشاف انتشار إمكانات العمل 9،13-15،21،22،25-27 ونشر إمكانات متشابك 13،16،18 على نطاق somatodendritic من الخلايا العصبية، الحصول على نماذج كابل السلبي مفصلة 28- 30 والتحقيق في القرار الزماني التكامل الخلايا العصبية 31. المادة السوداء (SN) هي منطقة تقع في الدماغ المتوسط ​​تشارك في عدة وظائف مثل السيطرة على الحركة، والترميز الثواب والسلوكيات المعتادة. انخفاض الدوبامين يرجع إلى الخاصويرتبط فقدان الدوبامين (DA) الخلايا العصبية في SN مع الاضطرابات الحركية لوحظ في المرضى الذين يعانون من مرض باركنسون 32. وتتكون الدائرة سودائي اثنين من أنواع الخلايا الرئيسية: الدوبامين وGABAergic الخلايا العصبية. ومن المثير للاهتمام، وهذه الخلايا العصبية لها العديد من الميزات الخاصة التي تميزها عن غيرها من الخلايا العصبية. محور عصبي نسبة كبيرة من الخلايا العصبية DA وبعض الخلايا العصبية GABA تنبع من موقع شجيري مشيرا إلى أن جذع شجيري هي غير متجانسة (محور عصبي الحمل والتشعبات، تفتقر إلى محور عصبي) 25،26،33. وبالتالي فإن التشكل من هذه الخلايا العصبية يتناقض مع منظمة نموذجية من الخلايا العصبية التي نقل المعلومات يتبع قانون الاستقطاب الديناميكي المنبعثة من كاجال: بدءا من التشعبات، إلى سوما وأخيرا إلى أكسون 34. ومن المعروف أن الخلايا العصبية DA أيضا لإطلاق الدوبامين من التشعبات 35، وتوليد النشاط انفجار 36 و اللدونة 37 NMDA مستقبلات. وdissecنشوئها من هذه الظواهر هو بعيد المنال دون التسجيلات مباشرة من موقع حيث يتم البدء فيها. للحصول على نظرة ثاقبة للعلاقة بين الموقع الدقيق والخصائص الفنية للقنوات ايون ودورها في استثارة والمعلومات شجيري نقل في الخلايا العصبية سودائي والتسجيلات شجيري المباشرة هي الأسلوب المفضل. ويصف هذا التقرير إجراءات تفصيلية والتي يمكن استخدامها للحصول على تسجيلات التصحيح المشبك واحد أو اثنين من التشعبات من الخلايا العصبية سودائي واللاحق biocytin وضع العلامات المقابلة. المبادئ الأساسية لترميم جسدية وغشاء شجيري متشابهة جدا. عمليا إلا أن التسجيلات من المواقع شجيري تتطلب الأمثل محددة بالمقارنة مع تسجيلات الجسدية. التسجيلات الجذعية الناجحة تعتمد على نوعية الشرائح، والتكيف الأمثل للبصريات، نهج طيف من ماصة التصحيح والاستقرار في التسجيلات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="621">
	<tbody>
		<tr height="137">
			<td height="137" style="height:138px;width:156px;">Double-distillated water</td>
			<td style="width:143px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">Super Q</td>
			<td style="width:187px;">&#160;Resistivity &#62;14 M&#937; cm, ideal 18.2 M&#937; cm at 25&#176;C, filtered (0.22 &#181;m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Microfilter candles</td>
			<td style="width:143px;">Robu</td>
			<td style="width:137px;">Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:156px;">Tissue slicer with vibroprobe</td>
			<td style="width:143px;">Leica</td>
			<td style="width:137px;">VT1200</td>
			<td style="width:187px;">cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Tissue slicer</td>
			<td style="width:143px;">Dosaka</td>
			<td style="width:137px;">DTK-1000</td>
			<td style="width:187px;">cutting parameters: speed 4, frequency 7</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Razor blades</td>
			<td style="width:143px;">Gilette</td>
			<td style="width:137px;">Super Silver</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:143px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Reserve chamber</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Custom-made</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">PP beckers</td>
			<td style="width:143px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">213-1725</td>
			<td style="width:187px;">400 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Syringe filter</td>
			<td style="width:143px;">Merk Millipore</td>
			<td style="width:137px;">Millex - GV 0,22 &#181;m</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Cyanoacrylate glue&#160;</td>
			<td style="width:143px;">UHU</td>
			<td style="width:137px;">&#34;Sekunden Kleber&#34;</td>
			<td style="width:187px;">liquid glue</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Recording chamber&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;">Slice mini chamber</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Horizontal pipette puller</td>
			<td style="width:143px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:137px;">Brown-Flaming P-97</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Pipettes</td>
			<td style="width:143px;">Hilgenberg</td>
			<td style="width:137px;">1807524</td>
			<td style="width:187px;">2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Dental wax</td>
			<td style="width:143px;">Colt&#232;ne/Whaledent</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">orthodontic tray wax strips</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Platinum grid</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Microforge</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:137px;">MF-830</td>
			<td style="width:187px;">to fire-polish pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:156px;">Potassium methyl sulfate</td>
			<td style="width:143px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:137px;">215481</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:156px;">Biocytin</td>
			<td style="width:143px;">Molecular probes</td>
			<td style="width:137px;">B1592</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:156px;">Manometer</td>
			<td style="width:143px;">GREISINGER electronic</td>
			<td style="width:137px;">GDH 13 AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:156px;">Microscope</td>
			<td style="width:143px;">Zeiss</td>
			<td style="width:137px;">FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:156px;">Dodt Gradient Contrast</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Manipulators</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;">LN Mini 25</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:156px;">Frame grabber</td>
			<td style="width:143px;">The Imaging Source</td>
			<td style="width:137px;">DFG/USB2pro</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Camera</td>
			<td style="width:143px;">DAGE-MTI</td>
			<td style="width:137px;">NC-70</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:156px;">Condenser</td>
			<td style="width:143px;">Zeiss</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">high numerical aperture condenser working with oil</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:156px;">Objective</td>
			<td style="width:143px;">Zeiss</td>
			<td style="width:137px;">W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR</td>
			<td style="width:187px;">63x magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:156px;">Fourfold-changer</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">between the camera and the microscope</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:156px;">Black &#38; white video monitor</td>
			<td style="width:143px;">Sony</td>
			<td style="width:137px;">SSM-175CE</td>
			<td style="width:187px;">16-inch, 850 TV lines, analog</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:156px;">Sample Bottles, Amber Glass, with Cap</td>
			<td style="width:143px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">215-2409</td>
			<td style="width:187px;">to transfer slices from the setup to histology room</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">The Axon Guide</td>
			<td style="width:143px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Book</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:156px;">Stimfit</td>
			<td style="width:143px;">https://github.com/neurodroid/stimfit</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Analysis of electrophysiological data</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:156px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">441244</td>
			<td style="width:187px;">see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:26px;width:156px;">Well cell culture plate</td>
			<td style="width:143px;">Greiner-Bio-One</td>
			<td style="width:137px;">662160</td>
			<td style="width:187px;">for the staining of fixed slices</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:143px;">Merk</td>
			<td style="width:137px;">108643</td>
			<td style="width:187px;">see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">mouse anti-TH monoclonal primary</td>
			<td style="width:143px;">Immunostar</td>
			<td style="width:137px;">22941</td>
			<td style="width:187px;">working concentration: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568</td>
			<td style="width:143px;">Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A-11031</td>
			<td style="width:187px;">working concentration: 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:143px;">Dako</td>
			<td style="width:137px;">X0907</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">ProLong Diamond Antifade</td>
			<td style="width:143px;">Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">P36961</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Fluorescein Avidin DCS</td>
			<td style="width:143px;">Vector Lab</td>
			<td style="width:137px;">A-2011</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:156px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:143px;">Olympus</td>
			<td style="width:137px;">FV1000</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:156px;">ImageJ</td>
			<td style="width:143px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">NeuronJ</td>
			<td style="width:143px;">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">plugin for ImageJ</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Imaris</td>
			<td style="width:143px;">http://www.bitplane.com</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Reconstruction of biocytin filled neurons</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Neuromantic</td>
			<td style="width:143px;">http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Reconstruction of biocytin filled neurons</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:61px;width:156px;">WinWCP</td>
			<td style="width:143px;">http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Analysis of electrophysiological data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular patch-clamp recordings from the somatodendritic domain of nigral dopamine neurons

التشعبات من الخلايا العصبية الدوبامين يتلقى وينقل مدخلات متشابك، دعم العمل إمكانية العودة إكثار وإطلاق الناقلات العصبية. إن فهم هذه الوظائف الأساسية تسليط الضوء على نقل المعلومات في هذه الخلايا العصبية. توفر شجيري تسجيلات التصحيح المشبك إمكانية لفحص مباشر على الخواص الكهربائية من التشعبات والقنوات الأيونية الجهد بوابات الأساسية. ومع ذلك، هذه الهياكل الدقيقة ليست بسهولة الوصول إلى ماصات التصحيح بسبب قطرها صغير. ويصف هذا التقرير إجراء خطوة بخطوة لجمع التسجيلات مستقرة وموثوق بها من التشعبات من الخلايا العصبية الدوبامين في شرائح حادة. يتم الجمع بين القياسات الكهربية مع اللاحق التعافي من مورفولوجيا الخلايا. التجارب الناجحة تعتمد على تحسين إعداد شرائح والحلول والماصات، والتكيف الملائم للبصريات واستقرار ماصة في اتصال مع هيكل المسجلة. مبادئ القياسية سوموتطبق آتيك تسجيل التصحيح، المشبك إلى التشعبات ولكن مع نهج ألطف من ماصة. هذه التقنيات تنوعا يمكن تنفيذها لمعالجة مختلف المسائل المتعلقة خصائص منفعل من التشعبات.

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons at JoVE.com

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

التحت خلوية تسجيلات التصحيح، المشبك من المجال Somatodendritic من سودائي الدوبامين العصبية

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

subcellular-patch-clamp-recordings-from-somatodendritic-domain-nigral

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.8K Views.  Quartier Hôpital, 














University
of Liege. Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro. 

Video: Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الشبكية ماوس إعداد غامق تكييفها شريحة

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

المقترنة تسجيلات المشبك من تصحيح للسيارات ، والخلايا العصبية في العضلات الهيكلية الهدف اسماك الزرد

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

تسجيلات المشبك التصحيح في الأذن الداخلية خلايا الشعر المعزولة من اسماك الزرد

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondria are involved in many important cellular functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most important mitochondrial functions are related to the efficient production of ATP, the energy currency of the cell, by oxidative phosphorylation, and the mediation of signals for programmed cell death3.
The enzyme primarily responsible for the production of ATP is the F1FO-ATP synthase, also called ATP synthase4-5. In recent years, the role of mitochondria in apoptotic and necrotic cell death has received considerable attention. In apoptotic cell death, BCL-2 family proteins such as Bax enter the mitochondrial outer membrane, oligomerize and permeabilize the outer membrane, releasing pro-apoptotic factors into the cytosol6. In classic necrotic cell death, such as that produced by ischemia or excitotoxicity in neurons, a large, poorly regulated increase in matrix calcium contributes to the opening of an inner membrane pore, the mitochondrial permeability transition pore or mPTP. This depolarizes the inner membrane and causes osmotic shifts, contributing to outer membrane rupture, release of pro-apoptotic factors, and metabolic dysfunction. Many proteins including Bcl-xL7 interact with F1FO ATP synthase, modulating its function. Bcl-xL interacts directly with the beta subunit of F1FO ATP synthase, and this interaction decreases a leak conductance within the F1FOATPasecomplex, increasing the net transport of H+ by F1FO during F1FO ATPase activity8 and thereby increasing mitochondrial efficiency. To study the activity and modulation of the ATP synthase, we isolated from rodent brain submitochondrial vesicles (SMVs) containing F1FO ATPase. The SMVs retain the structural and functional integrity of the F1FO ATPase as shown in Alavian et al. Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of SMVs from rat brain and we delineate the patch clamp technique to analyze channel activity (ion leak conductance) of the SMVs.

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

A method to isolate submitochondrial vesicles enriched in F1FO ATP synthase complexes from rat brain is described. These vesicles allow the study of the activity of F1FO ATPase complex and its modulation using the technique of patch clamp recording.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; أتباز إعداد الحويصلة وتقنية لإجراء التسجيلات المشبك التصحيح من أغشية الحويصلة Submitochondrial

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

عزل الخلايا العصبية الحسية من<em&gt; Aplysia californica</em&gt; للحصول على التسجيلات المشبك التصحيح من التيارات الجلوتاميرجي

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا الجنينية الزرد ماوتنر

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

خلية كاملة تسجيلات التصحيح، المشبك من Morphologically- وحددت Neurochemically-الحصين Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

الكهربية والمورفولوجية توصيف العصبية الحادة رقائق في الدماغ عن طريق شرائح الموثوقة التصحيح، المشبك التسجيلات

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

تسجيلات خلية كاملة التصحيح، المشبك في الدماغ شرائح

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.