עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי DP2OD008470 מענק NIH. בנוסף, זיכרון RAM נתמך בחלקו על ידי קרנות הניתנים על ידי אוניברסיטת בית הספר למוסמכים נוטרדאם. אנו מודים לצוות המחלקה למדעי הביולוגיה, המרכז הזברה מחקר, והמרכז בתאי גזע משובי רפואה באוניברסיטת נוטרדאם. תודה מיוחדת לחברי מעבדה לעיסוק דיונים על ביולוגית כליות ומשוב המועילות על עבודה זו.

הנהלים לעבודה עם עוברי דג הזברה המתוארת פרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת נוטרדאם. 1. הכנת פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות 50x של התקשורת העובר E3 על ידי ערבוב 73.0 גרם NaCl, 3.15 גרם KCl, 9.15 גרם CaCl 2, ו 9.95 גרם MgSO 4 ב 5 ליטר של מים מזוקקים, ולאחסן ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור culturing של עוברי דג זברה, לדלל את תמיסת 50x המלאה של תקשורת עובר E3 לפתרון עובד 1x עם מים מזוקקים, ולאחר מכן להוסיף 200 μl של מתילן כחול 0.05% לכל 1 ליטר של 1x E3 לפעול כמו פטריות, ולאחסן ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון חסימת פיגמנטציה של התקשורת העובר E3 עם 0.003% 1-פניל-2-thiourea (PTU) על ידי שילוב 40 מ&quot;ל של המניה 50x E3 עם 0.06 מ&quot;ג PTU. ואז להביא את הנפח לסך של 2 ליטר עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את O E3 / PTU / N ב RT כדי לקבל את אבקת PTU אל הפתרון. ואז לאחסן את E3 / PTU בRT. הערה: E3 / PTU יש חיי מדף של כשבוע, ופתרונות ישנים יהיו פחות יעילים חסימת פיתוח פיגמנטציה זחלי דג זברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן ההרדמה של 0.2% Tricaine (MS-222) על ידי הוספת 1 גרם של Tricaine 500 מ&quot;ל מים מזוקקים ולהתאים את ה- pH ל 7.2 עם 1 M טריס, pH 9.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לבצע פתרון methylcellulose 2% עבור הדמיה על ידי הצבת פתרון של E3 1x (לא מתילן כחול), עם 1/10 נפח ה של 0.2% Tricaine הוסיף ב 4 ° C.. הערה: פתרון methylcellulose הוא פתרון עבה, ברור כי משמש כדי לייצב עובר לחיות בעדינות במיקרוסקופ. לאחר המניפולציות מבוצעות העוברים ניתן לכבס ב 1x E3 לפזר את methylcellulose מבלי לפצוע את החיה ולאפשר מיקרוסקופיה בשלבים הבאים באותה הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מקורר 4 ° C, ומערבבים הפתרון 1x E3 / Tricaine במרץ בצלחת ומערבבים ומוסיפים בהדרגה את הכמות המתאימה של מתילאבקת תאית תוך המשך לבחוש במרץ. מוסיפים בהדרגה את אבקת הפתרון למנוע היווצרות של אגרגטים methylcellulose מסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הכל את האבקה מערבבת לתוך תמיסת 2% methylcellulose / E3 / tricaine, מערבבי הפתרון המשולב בחדר הקר ° C 4 O / N. ההערה: הטמפרטורה הקרה היא טובה ביותר עבור המסת האבקה מלאה. אם הפתרון אינו ברור לאחר לילה אחד, ומערבבים במשך יום עבודה נוסף ו / או O השני / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר בועות אוויר מן methylcellulose 2% / E3 / tricaine פתרון, aliquot את התערובת לתוך צינורות 1.5 מ&quot;ל ספין במהירות גבוהה (12,000 XG) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות או עד 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פתרון 2% methylcellulose / E3 / Tricaine ב 4 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. הערה: לפני השימוש, aliquots צריך להיות מחומם מראש ל RT לעבודה עם דגימות דג הזברה. </li></ol> 2. הכנת כלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן כלי מניפולטור העובר, המשמש positioning עובר microinjection, על ידי הצמדת טיפ טעינת ג&#39;ל על קצה מחט לנתח 5 &quot;ישר, ובטוח עם קלטת או דבק מגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן מחטי microinjection באמצעות חולץ מחט, על ידי הנחת ראשון אש מלוטשת 10 זכוכית בורוסיליקט סנטימטר עם נימה לתוך המכשיר ולאבטח את הזכוכית בורוסיליקט ידי הידוק הידיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את זכוכית בורוסיליקט לעצב מחטים דקות-מחודדות. השתמש בהגדרות הבאות: מחממים 540, למשוך 245, מהירות 200, וזמן 125. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחטי מקום בתוך צלחת פטרי, השעיית אותם על רצועת פלסטלינה כדי להגן על טיפי מחט, ולשמור את הכלי הסגור למניעת הצטברות אבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לסיים להכין את המחט עבור microinjections, להשתמש בסכין גילוח או מלקחיים בסדר קצה לחתוך את קצה משך של המחט כדי ליצור טיפ הזרקת זוויתי חד בקוטר של כ 0.05-0.1 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את מגש microinjection, להכין פתרון 1.5% agarose / E3 בתוך 100 מ&quot;ל בבקבוק Erlenmeyer ו לפזר את agarose על ידי חימום E3 לרתיחה במיקרוגל ואז להתקרר ב RT במשך כ -10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הפתרון agarose / E3 מקורר לתוך צלחת פטרי כדי להפוך בסיס עם עומק של כ -0.5 ס&quot;מ. כאשר זה יש הקרושה לשפוך שכבה שנייה עם עומק של כ 0.3 סנטימטרים ולהכניס את התבנית היטב עובר הטרומית ולאפשר agarose כדי לחזק ב RT. הערה: כאשר מכניסים את התבנית לתוך השכבה אגר העליון / E3, הצבת את התבנית לתוך אגר בזווית כדי להקטין את מספר בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מגש microinjection כולו קבע, להרים את העובר הטרומי גם לעצב לאט ובזהירות באמצעות scoopula, ולאחר מכן למלא את המנה עם פתרון ולאחסן E3 על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 3. עובר כנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת טנקי הזדווגות דג זברה על ידי הצבת מחיצות לתאי הזדווגות וממלאת במי מערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים דג אחד בכל צד של המחיצה שלuch כי כל תא מכיל הזדווגות נקבה אחד ודגי זכר אחד, ומכסה כל תא הזדווגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, להסיר את המחיצות כדי לאפשר השרצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הדגים לאחר כ -30 דקות, ולאחר חזרת המבוגרים לאקווריום, לאסוף העוברים שלהם על ידי העברת מי טנק הזדווגות באמצעות כלי מסננת מתכת-רשת בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את המסננת מעל צלחת פטרי ולשטוף עם E3 לאסוף את העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עוברים על 28.5 ° CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עוברים הגיעו 24-26 somite שלב 26, למזוג רוב כלי התקשורת E3 ואז dechorionate על ידי הוספת 100 μl של 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל pronase על כל מנה של עוברים דוגרים צלחת ב RT (23 מעלות צלזיוס) במשך כ 15 דקות. הערה: זה ייקח כ 24-25 שעות מרגע הפריה כלפי העובר להגיע לשלב 24-26 somite אם הם נאספים באופן מתואר וטופח O / N ב 28.5 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את הצלחת עםE3 ולאחר מכן מערבולת בעדינות כדי לסלק את chorions מן העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג E3 / pronase ולשטוף את המנה עם 25 מיליליטר של E3 הטרי. צעד לשטוף חזור להסיר את כל pronase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעצור התפתחות פיגמנטציה, למזוג E3 ולהחליף עם 25 מ&quot;ל של טרי E3 / PTU כאשר עוברים הגיעו 24 שעות שלאחר ההפריה. הערה: בניסויים פורשים כמה ימים, להחליף את פתרון E3 / PTU עם תקשורת טריה פעם ביום כדי לשמור על הצלחת נקיה. </li></ol> 4. Microinjection של פתרון Nephrotoxin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הזרקה, להכין את פתרון nephrotoxin הרצויה יחד עם השליטה ברכב המתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס או ומערבבים בעדינות כדי להבטיח את התרופה (ים) הוא / הם בתמיסה, בדיקת צידי הצינור העליון של עמודת המים. הערה: פתרונות Nephrotoxin ניתן להכין להכיל כמויות זעירות של dextran מצומדות fluorescently לפקח יעילות microinjection וגם להעריך פינוי כלייתי ב subseqזמן uent מצביע 20,28. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מחט microinjection גזוז עם ~ 2-3 μl של nephrotoxin ידי השחלה טיפ טעינת ג&#39;ל בסדר לחלק האחורי של המחט להשעות את המחט בצורה אנכית עם חתיכת סרט לאפשר הפתרון למלא את קצה המחט גזוז על ידי כוח הכבידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שקצה המחט מלא, לאבטח את המחט הטעונה micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את נפח microinjection ידי הצבת טיפה של שמן מינרלי לשקופית מיקרומטר ולהזריק לתוך השמן כדי להעריך את גודל טיפה. נפח הזרקה של 500 pl בעל קוטר של 0.1 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים את המאפה של עוברים מן החממה, להרדים ידי הוספת כ 5 מ&quot;ל של Tricaine 0.2% כדי בצלחת העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח הרדמה מלאה, לגעת העובר בעדינות עם קצה של כלי מניפולטור העובר. חוסר התנועה מצביע הרדמה מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרדמה מוצלחת, להעביר עובר אל עובש ההזרקה עם transfפיפטה אה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתמרן כל עובר לתוך באר שונה של עובש נחת הראש באזור העמוק ביותר של כאלה היטב כי המטען נח לאורך השקע ואת הזנב מזדקר אל מחוץ למיתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט המלאה לתוך micromanipulator ומקם את קצה המחט ליד עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס בעדינות את המחט לתוך כלי הזנב על ידי הזזת הג&#39;ויסטיק קדימה על דוושת הרגל כדי לספק את microinjection. הערה: זריקה מוצלחת תעיד על ידי צפייה הנוזל להיכנס במחזור. יתר על כן, שיתוף הזרקה של nephrotoxicant עם dextran מצומדות fluorescently מאפשרת לחוקר לאמת זריקה מוצלחת לאחר ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך בעדינות בחזרה על הג&#39;ויסטיק כדי להוציא את המחט מן העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזרקה, להעביר את העוברים כדי בצלחת נקיה ולשטוף להסיר את Tricaine ולהחליף עם E3 טרי / PTU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה העובר לנקודת הזמן הרצוי כדי ישבניםמורפולוגיה של, אשר יכול להיות מתועד על ידי צילום תקשורת הרכבת methylcellulose, או תהליך לניתוח הניסיון כרצונכם. הערה: שחזור של עוברים יש לבחון כדי לקבוע את אחוז האנשים עם בצקת, אשר מציינת פגיעת כלייתית נפוצה. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

מספר רחב של סוכנים טיפוליים קושר עם AKI 29. היו מקדמות מחקר משמעותי בהבנת הנזק הנגרמת על ידי תרכובות בודדים רבים, כגון גנטמיצין aminoglycoside 30 ו ציספלטין כימותרפיות בשימוש נרחב 31,32. שינויים פתולוגיים מסוימים מעורבים בתנאים אלה, עם זאת, להישאר בנושא של מחקר מתמשך. אתגר המתהווה אחת נותר הבנה כיצד תרופות מרובות להשפיע לרעה חולה, במיוחד אלה באוכלוסיות בסיכון גבוה כגון אלה במסגרות טיפול נמרצות ואת 29 הקשישים. לפיכך, מודלים המאפשרים מחקרים המבוססים הסלולר נוספים אודות ההשפעות של AKI-סמים משמשים תפקיד חשוב בשיפור זיהוי של מצב זה ולהעריך תרופתיות דינמיות. עבודה עם מודלים יונקים כמו העכבר והחולדה הייתה בלתי נפרדת להקים שינויים תאיים בכליות הבאות AKI, buהגבלת t אחד עם מערכות אלה היא כי ישירה, תצפית בזמן אמת מוגבלת בשל המורכבות האדריכלית והמיקום הפנימי של האיבר. במילים פשוטות, הכליה אינה זמינה עבור תצפית ישירה, אשר מחייבת כי אנשים להקריב כדי לנתח את הכליה. ניתן יהיה להתמודד מגבלות אלה באמצעות עוברי דג הזברה, אשר יוצרים כליות פשוטה של שני nephrons שיש להם מבנה מגזר משומר עם חוליות אחרים, כולל בני אדם 33. פיתוח דג זברה מתרחש ברחם לשעבר ועם פיגמנטציה קטין, המאפשר תצפית ישירה של organogenesis כליות וניטור של תגובות לגירויים חיצוניים 34. כלים לניתוח מולקולרי, כגון ביטוי גני 35-37, כבר נוצל עם ברזולוציה גבוהה על מנת לקבוע את התכונות של nephrogenesis 38-40. מניפולציות ניסוייות לבדיקה של מולקולות קטנות באמצעות גנטיקה כימית מבוססות היטב דג זברה החלים על kidnEY 41-43. ואכן, בשנים האחרונות, דג הזברה הוחלו מודל כלייתית של סוכנים החל acetominophen כדי mycotoxins וחומצה aristolochic 44-48. חשוב לציין כי יש גם מגבלות משמעותיות על דוגמנות AKI בעובר דג הזברה, בגלל הפשטות מאוד של מבנה כליות בשלב זה בפיתוח. לדוגמא, דג זברה אינן מתאימה לטיפול אינטראקציות multifactorial בתוך רקמת כליה כי הוא ארוז בצפיפות עם nephrons כי מוקפי stroma מורכב המכיל סוגי תאי ביניים מרובים, כפי שנהוג המכרסם או metanephros אדם. לכן, דג הזברה הן מתאים ביותר להמחשת שינויים תאיים ומולקולריים אוטונומיים נפרון במהלך AKI. השיטה של ​​microinjection שתוארו כאן, בזמן שיש עקומת למידה תלולה, הוא מאוד שימושי לחקר שתי המדינות התפתחותיות ומחלות כולל nephrotoxins. טכניקה זו יכולה לשמש כדי teתרופות רח בנפרד או במשולב. בנוסף, זריקות יכולות להתבצע במהלך מגוון רחב של נקודות זמן פיתוח. שיטה דומה, מעשית לא פחות לביצוע microinjections תוך ורידי הזחלים דג הזברה תוארה בעבר על ידי Cosentino, et al. 21. אחת הבחנה משמעותית המתודולוגיה שלהם, לעומת השיטות שתוארו כאן, היא כי העובר להיות מוזרקת הוא משותק ניצול פיפטה מחזיק 21. שימוש פיפטה החזקה הנו חלופת עובש ההזרקה. חוקרים המבקשים ליישם microinjection כשיטה משלוח לסוכני nephrotoxicant צריכה להיות מודעת חלופה זו מומלצת להשוות את השיטות לזיהוי אשר עדיף באופן אישי, כמו ללמוד לתפעל את פיפטה מחזיק כדי לא לפגוע בעובר יהיה כרוך בפועל בדיוק כפי שהוא דורש תרגול לתמרן microinject באמצעות עובש הזרקה פשוט בהצלחה עם חלל דיכאון עבור embryos. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להכין מחטי הזרקה בגודל המתאים, וכדי לחתוך את הזווית על קצה המחט כדי לייעל כניסה חלקה ויציאה לתוך המחזור העוברי. במהלך הליך ההזרקה, זה קריטי כדי לנטר את עוצמת הזריקה להעריך עקביות של משלוח nephrotoxin בין דגימות. הערכה תקופתית של נפח הזרקה עם מיקרומטר יכולה להתבצע אם החוקר אינו בטוח לגבי שינויים בהיקף גדול, תוך ביצוע ניסוי. לדוגמה, בשל האופי של הטכניקה, קצה המחט יכול חלקית או לחלוטין לסתום עם פסולת הסלולר. סיבוך זה ניתן לסתור ידי ניקוי מחט מעת לעת על מנת להבטיח עקביות של הנוזל נפלט. בנוסף, חיוני לצבוע כמו פנול אדום ניתן להוסיף לתערובת לפעול כסמן חזותי של ההזרקה ולסייע ניטור פיזור נוזל 49,50. יתר על כן, זריקות של מולקולות נותבו יכולות לסייעביטוי חזותי אוכלוסיות תאים ספציפיים, בעקבות ההזרקה. עבור שיתוף הזרקת moieties dextran ניאון, במיוחד 10 conjugates dextran kDa, יש מספר יישומים 16,17. במקרה זה, ההערכה של עוצמת פלורסנט יכול להתבצע מיד לאחר ההליך כדי לאשר microinjection מוצלח עם דליפה מינימלית. עוצמת ניתן למדוד באמצעות הצילום לכידת תמונה מתאימה מחדש ואז בנקודות זמן לאחר למדוד את השינוי בעוצמת פלורסנט כדי למדוד פינוי כלייתי 51. יתר על כן, את הספיגה של dextran ב אבובית הפרוקסימלי מספק proxy עבור פונקציונליות של מגזר נפרון זה 16,17. יחדיו, ישנן דרכים רבות כי microinjection יכול להיות מנוצל כדי לחקור AKI עם דג הזברה, במיוחד כמודל זו מספקת את ההזדמנות כדי להתייחס הפרמקוקינטיקה in vivo. לכן, פעם אחת משתלט עליו, microinjection של nephrotoxinsאל עובר דג הזברה מספק פרדיגמה שימושי עבור מחקרי כליות.

AKI הוא אובדן פתאומי של בתפקוד הכליות, אשר יכול להוביל לתוצאות הרסניות לבריאות 1. AKI הוא נושא בריאות משמעותי ברחבי העולם בשל שכיחותה הגבוהה של כ -20% בקרב חולים מאושפזים, עם אף גבוהים יותר שיעורים 30-50% במקרים בטיפול נמרצים והקשישים, ושיעורי תמותה של 50-70% 1-3. למרבה הצער, השכיחות של AKI גדלה והוא צפוי להסלים עוד יותר בעשור הקרוב, בין שאר כתוצאת המגוון של גורמים שיכולים לגרום AKI, הכולל שלאחר ניתוח מתח, איסכמיה, וחשיפת nephrotoxins כגון אנטיביוטיקה תרופות כימותרפיות 4. AKI כרוך ניזק לתאים פתאומי בתוך הכליה, שכיח ב nephrons, שהן היחידות הפונקציונליות החיוניות, והם מורכבים של מסנן דם וכן אבובית מפולחת המנקזת שתנו לתוך צינוריות איסוף מרכזיות 1. כאשר מספר לא מבוטל של nephrons הואניזוק במהלך AKI, ההשפעות המיידיות כוללות הפרעה בסילוק פסולת מהמחזור, ואת זרימת נוזל מופחת או בוטלו באמצעות nephrons עקב חסימה מתאי מתים וגוססים 1. במשך הזמן, חסימה צינורי יכול להוביל לניוון של nephrons כולו, אשר מפחית 1 תפקוד כלייתי לצמיתות. שינויים פיסיולוגיים הכליה הבאה AKI גם הקשורות בתופעות דלקתיות מורכבות שיכולים להוביל צלקות כרוניות 1. למרות התוצאות הללו, nephrons יש כמה היכולת לעבור התחדשות לאחר AKI כי reconstitutes 5,6 אפיתל צינורי. אמנם יש כבר הבנה מולקולרית גדל והולך של התחדשות נפרון, המנגנונים להישאר חמקמקה לגבי רבים מחייבים המשך חקירה 7. המידה שבה AKI גורם לנזק כלייתי קבע גם נותר עלום. המחקר הנוכחי מצביע על פוטנציאל ההתחדשות עבור הכליה הואגבוה ביותר בעקבות מקרים חמורים פחות של AKI, בעוד יותר פרקים בולטים או חוזרים להוביל מחלת כליות כרונית (CKD) ותסתיים ב סופנית מחלת כליות (ESRD) הדורש השתלת מצילות חיים או דיאליזה 8,9. בנוסף, אנשים שכבר סובלים CKD נמצאים בסיכון גבוה עוד יותר להידבקות פרק חמור של AKI 8,9. יחדיו, ברור שהמשך מחקר בסיסי וקליני חיוני להבין, לטפל ולמנוע AKI. מחקר במודלים של בעלי חיים כבר סייע להעריך את ההתקדמות של שינויים מקומיים וסביבתיים המתרחשים במהלך AKI 10. כדי להרחיב את ההבנה הזאת, כמו גם לפתח טיפולים חדשים, במודל חיה דג הזברה כבר המועסקים במגוון דרכים 11,12. Nephrons של הכליה דג הזברה, בשני העובר מבוגר, להציג רמה גבוהה של שימור עם יונקים 13-16. יתר על כן, פגיעה אפיתל נפרון ב zebrafish דומה לתהליך חוליות גבוהות, לפיה ההרס המקומי של תאים צינורי ואחריו התפשטות intratubular ואת הקמתה מחדש של נפרון אדריכלות 17-19. בעובר, אולם ניזק אבובית נרחב מן nephrotoxins כמו ציספלטין קשור קטלני 20,21. לשם השוואה, מבוגרי דג זברה לשרוד AKI ולהציג יכולות משובים מהותיות הכליות. כך למשל, בעקבות החשיפה גנטמיצין אנטיביוטי aminoglycoside, דג הזברה להתחדש נזק אפיתל אבובית ולגדול יחידות נפרון חדשים וכן 22-24. בעוד גנטמיצין הנגרמת אלה מחקרים AKI סיפקו מידע שלא יסולא בפז, להבנת נזק כלייתי מ nephrotoxins מגוונים נותר קריטי להעריך את ההשפעות בתגובה סוגים שונים של נזק 25. עובר דג הזברה, בשל גודלו, שקיפות עקיבות גנטיות, יש יתרונות רבים ללימודי nephrotoxin &lt;sup&gt; 25, שבהם השיטה של microinjection 20,21 משמשת לניהול המולקולה (ים) לחקירה. Nephrons נוצרות על ידי הפריה 24 שעות שלאחר (hpf) ומתחילים לסנן דם בכ 48 hpf 26,27. לפיכך, ההיווצרות המהירה והתפקוד של הכליה העוברית מאפשרים ניתוח הניסיון. עם זאת, תהליך של microinjection יש אתגרים טכניים ויש יכול להיות עקומת למידה תלולה מאסטרינג טכניקה. במאמר זה וידאו, אנו מתארים כיצד לבצע microinjections ולספק עצות לפתרון בעיות כדי להגביר את שיעור זריקות מוצלחות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="801">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:229px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:129px;">AB01915</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>Mo. P097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15510-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;(microinjection tray) 150mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low Temperature Incubator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11 690 516DQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Dissecting Tweezer</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Micrometer</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>2280-24</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nephrotoxin microinjection in zebrafish to model acute kidney injury

הכליות הן רגישות לפגוע מחשיפה לכימיקלים שהם לסנן ממחזור הדם. זה יכול להוביל לפציעת איבר הקשורים ירידה מהירה בתפקוד הכלייתי ופיתוח של התסמונת הקלינית המכונית אי-ספיקת כליות חריפה (AKI). סוכנים תרופתיים המשמשים לטיפול נסיבות רפואיות החל זיהום חיידקים לסרטן, כאשר מנוהלים בנפרד או בשילוב עם תרופות אחרות, יכולים ליזום AKI. דג זברה היא מודל חיה כדאי ללמוד את ההשפעות הכימיות על תפקוד כלייתי in vivo, כפי שהם יוצרים כליה עוברית המורכבת מיחידות פונקציונליות נפרון כי הם משומרים עם חוליות גבוהות, כולל בני אדם. יתר על כן, דג זברה יכול להיות מנוצל כדי לבצע מסך גנטי וכימי, המספק הזדמנויות להבהיר את ההיבטים התאיים ומולקולריים של AKI ולפתח אסטרטגיות טיפוליות כגון זיהוי של מולקולות כליה. הנה, אנחנו מדגימים microinjection איך לתוךעובר דג זברה יכול להיות מנוצל כפרדיגמה מחקרי nephrotoxin.

תחנת microinjection להגדיר כולל סטראו, micromanipulator ו ווסת לחץ (איור 1 א). שקוף של צלחת ההזרקה עדיפה להציג דגימות במהלך הליך זה (איור 1 ב). הכנת מחט הזריקה כרוכה משייכת הזכוכית בורוסיליקט המתאימה, ולאחריו הכנת הקצה עם חיתוך ולבסוף חזרה טעינה את המחט. באופן אופטימלי, קצה המחט הוא משופע ולא להקהות (התרשים 1C), חתך כי נעשה על ידי לדוג הקצה חד של מכשיר החיתוך, כגון מלקחיים בסדר, במהלך הליך החיתוך (איור 1D). הקצה המחודד הזה הוא חיוני מאוד ישפיע על היכולת להכניס את המחט בעדינות לתוך דג הזברה. ביום הזרקה, עובר מוקמו באמצעות עובר חסון אבל וגמישמניפולציה כלים (1E איור). עבור הזריקה, עובר היו תמרן, כך הגוף נח לאורך הצד של מגש ההזרקה לספק מנוף צעד ההזרקה הבא (האיור 1F). בעוד הזרקה, יש למקד את מטוס מבט על הטורסו העוברי כדי להמחיש את היעד וסקולרית עבור החדרת מחט ואז לבחון את החומר המוזרק להיכנס במחזור (האיור 1G). השקיפות של העובר דג הזברה הופך לפשוט יותר את ההליך microinjection, ויכול להיות עוד יותר משופר על ידי טיפול כימי PTU ב 24 hpf כדי להפחית את התפתחות פיגמנטציה במהלך קורס זמן הניסוי טיפוסי (איור 2 א). כאן, דגימות העובר הורשו לפתח דרך שלב 72 hpf, אז היו או מדומה מוזרק, microinjected עם הרכב מלוחים, או microinjected עם 2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל גנטמיצין (איור 2 א).תצפית חיים לאחר נערכה אחד ושני ימים לאחר הזרקה, באמצעות תאורה שקופה עם סטראו (איור 2 ב). לעומת עוברי מדומה או מלוחים מוזרק, רק אנשים מוזרק גנטמיצין הראה התפתחות בצקת (איור 2 ב), בצקת קרום הלב במקרה זה, כנראה בגלל ביטול של פונקציונליות כלייתי תקין בקנה אחד עם תצפיות שפורסמו בעבר 11,20,21. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54241/54241fig1.jpg" /> איור 1. מנגנון וכלי Microinjection. (א) תחנת הזרקה להגדיר עם סטראו (משמאל), micromanipulator ו בעל מחט (באמצע) ווסת לחץ (מימין). (ב) שקוף של צלחת ההזרקה. (C) משמאל: מחט לחתוך בלאנט. מימין: מחט לחתוך משופעים. (ד) Fמלקחי ine משמשים לחיתוך טיפי מחט. (E) כלי מניפולציה המשמשים להכנסה ומקם את הדגימות לתוך תבנית ההזרקה. (F) עוברים ערוכים במתכונת microinjection. סרגל קנה מידה = 0.5 מ&quot;מ. (G) מיצוב של מחט ליד העובר להזרקה. סרגל קנה מידה = 0.15 מ&quot;מ. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54241/54241fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54241/54241fig2.jpg" /> איור 2. בצקת הזרקת ציר זמן ופוסט ניסיוני assay. (א) דוגמא nephrotoxin ציר זמן ניסיוני דג זברה, כאן להחיל מחקר גנטמיצין. העוברים היו dechorionated ומטופל עם פתרון PTU ב 24 שעות שלאחר ההפריה (hpf). כל יום, פתרון PTU היה יצק ומחליף עם תקשורת טריה כפי שצוין על ידי smaller חצים ירוקים. ב 72 hpf, עובר היו מורדמים, עברו עובש הזרקה ומאז הם ראו כדלקמן: מוזרק מדומה או מוזרק או מלוח (שליטה ברכב) או גנטמיצין. לאחר להחיות את העוברים בתקשורת טריה, העוברים נצפו לאחר הזרקת 1 ו -2 ימים (96 ו -120 hpf, בהתאמה) לניתוח רכישת תמונה. (ב) למעלה: העובר דג הזברה uninjected. תיכון: עובר מוזרק 72 hpf עם מי מלח. תחתונה: העובר מוזרק עם 2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​גנטמיצין. סרגל קנה מידה = 0.5 מ&quot;מ. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54241/54241fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury at JoVE.com

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

פציעות כליות הנגרמות nephrotoxins, הכולל תרופות החל אנטיביוטיקה כימותרפיות, שיכולות לגרום להפרעות מורכבות בפתוגנזה ששרידיו מובנים. פרוטוקול זה מדגים כיצד דג הזברה יכול לשמש בסיס לפיתוח מודלים למחלות של תנאים אלה, אשר יכול להיות מיושם על זיהוי של צעדים renoprotective.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

nephrotoxin-microinjection-in-zebrafish-to-model-acute-kidney-injury

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.8K Views.  University of Notre Dame.  פציעות כליות הנגרמות nephrotoxins, הכולל תרופות החל אנטיביוטיקה כימותרפיות, שיכולות לגרום להפרעות מורכבות בפתוגנזה ששרידיו מובנים. פרוטוקול זה מדגים כיצד דג הזברה יכול לשמש בסיס לפיתוח מודלים למחלות של תנאים אלה, אשר יכול להיות מיושם על זיהוי ש...

Video: Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

השתלה של מח כליות שלמים דג הזברה למבוגרים

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinjections תוך ורידי של הזחלים דג הזברה לחקר פגיעה כליות חריפה

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

השתלה של תאים ישירות לתוך הכליה של דג הזברה למבוגרים

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

הפעלה של אפופטוזיס על ידי Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום ג</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissection של הכליה דג הזברה למבוגרים

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

פגיעת הליזר הביא על שריר שלד עוברי דג זברה

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging דג הזברה למבוגר

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

ניתוח של הרכב נפרון ותפקוד בכליות דג הזברה למבוגר

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...