Bu çalışma NIH hibe DP2OD008470 tarafından kısmen desteklenmiştir. Ayrıca, RAM Notre Dame Graduate School Üniversitesi tarafından sağlanan fonlarla kısmen desteklenmiştir. Biz Kök Hücre ve Notre Dame Üniversitesi Rejeneratif Tıp Biyolojik Bilimler Bölümü, Zebra balığı Araştırma Merkezi ve Merkezi kadroya teşekkür ederim. Biz özellikle böbrek biyoloji ve bu işin kendi yararlı geribildirim hakkında tartışmalar takılmak için laboratuar üyelerine teşekkür ederim.

Bu protokol açıklanan Zebra balığı embriyolarının ile çalışmak için prosedürler Notre Dame Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Çözümler 1. hazırlanması <ol><li> Oda sıcaklığında 73.0 g NaCl, 3.15 g KCI, 9.15 g CaCl2 ve damıtılmış suyun 5 L 9.95 g MgSO 4 ve mağaza karıştırılarak E3 embriyo medya 50x stok çözeltisi olun. </li><li> zebra balığı embriyoların kültür için, daha sonra her 1, bir mantar öldürücü olarak hareket etmek 1x E3 L ve mağazada için% 0,05&#39;lik metilen mavisi 200 ul, damıtılmış su ile 1 x çalışma çözeltisi E3 embriyo ortam stokunun 50x stok solüsyonu seyreltik RT. </li><li> 0.06 mg PTU 50x E3 stokunun 40 ml birleştirilerek% 0.003 1-fenil-2-tioüre (PTU) ile E3 embriyo ortam pigmentasyon bloke çözeltisi olun. Sonra damıtılmış su ile 2 L &#39;lik bir toplam hacim getirmek. </li><li> çözüm haline PTU tozu almak için oda sıcaklığında E3 / PTU O / N karıştırın. Sonra da E3 / PTU saklamakRT. E3 / PTU yaklaşık bir haftalık bir raf ömrü vardır ve eski çözümler Zebra balığı larvaları pigmentasyon gelişmesini engelleme az etkili olacaktır: Not. </li><li> damıtılmış su, 500 ml Tricaine 1 g eklenerek% 0.2 Tricaine (MS-222) bir anestezik yapmak ve 1 M Tris, pH 9.5 ile pH&#39;ı 7.2&#39;ye ayarlayın. </li><li> Tricaine 4 ° C&#39;de% 0.2 1/10 hacim, 1 x E3 (Resim metilen mavi) içeren bir çözelti vererek görüntüleme için% 2 metilselülöz solüsyonu yapmak için hazırlayın. Not: metilselüloz çözeltisi yavaşça mikroskopi için canlı embriyolar stabilize etmek için kullanılır kalın açık bir çözümdür. manipülasyonlar yapıldıktan sonra embriyolar hayvan yaralanmasına ve aynı örnekte sonraki aşamalarında mikroskopi etkinleştirmeden metilselüloz eritmek için 1x E3 yıkanabilir. </li><li> 4 ° C&#39;ye soğutulduğunda, bir karıştırma plakası üzerinde kuvvetli bir şekilde 1 x E3 / Tricaine solüsyonu ilave edin ve yavaş yavaş metil uygun miktardaselüloz tozu kuvvetlice karıştırın devam ederken. Yavaş yavaş çözünür metilselüloz agregatların oluşumunu önlemek için çözeltiye toz ekleyin. </li><li> Tüm toz% 2 metilselülöz / E3 / tricaine çözeltiye karıştırılır sonra, 4 ° C soğuk oda göre O / N bileşik solüsyonu ilave edin. Not: Soğuk sıcaklık tamamen toz çözülmesi için en iyisidir. Çözelti sonra bir gece net değilse, ek bir iş günü ve / veya ikinci bir O / N karıştırın. </li><li> 30 dakika boyunca ya da 2 saat kadar 4 ° C&#39;de yüksek hızda (12.000 xg) 1.5 ml tüpler ve spin içine% 2 metilselüloz / E3 / tricaine çözeltisi, kısım karışımı hava kabarcıklarını çıkarmak için. </li><li> Uzun süreli depolama boyunca 4 ° C &#39;de% 2 metilselülöz / E3 / Tricaine çözeltisi yerleştirin. Not: kullanımdan önce, tam bölünen miktarları, zebra balığı numunelerin çalışma için oda sıcaklığına önceden ısıtılmış olmalıdır. </li></ol> Araçlar 2. Hazırlık <ol><li> po için kullanılan bir embriyo manipülatör aracı hazırlayın5 &quot;düz diseksiyon iğnenin ucunda bir jel yükleme ucu takarak, mikroenjeksiyon için embriyolar ırma ve bant veya yapıştırıcı ile sabitleyin. </li><li> İlk yangın koyarak bir iğne çektirmenin kullanarak mikroenjeksiyon iğneler hazırlayın aracı haline filament ile 10 cm borosilikat cam cilalı ve kolları sıkarak borosilikat cam sabitleyin. </li><li> ince konik iğne moda borosilikat cam çekin. aşağıdaki ayarları kullanın: 540 ısıtmak, 245, hız 200 ve saati 125 çekin. </li><li> kil modelleme bir şerit onları askıya bir Petri kabı içine yerleştirin iğneler, iğne uçları korumak ve toz birikmesini önlemek için kapalı çanak tutmak. </li><li> microinjections için iğne hazırlanıyor bitirmek için yaklaşık 0.05-0.1 mm çapında bir keskin köşeli enjeksiyon ucu oluşturmak için iğnenin çekti ucunu kesmek için bir jilet veya ince forseps kenar kullanın. </li><li> mikroenjeksiyon tepsisini yapmak için, bir 10&#39;da% 1.5 agaroz / E3 çözüm hazırlamak0 ml Erlenmeyer şişe ve daha sonra yaklaşık 10 dakika boyunca oda sıcaklığında soğumasına izin verin bir mikrodalga kaynama E3 ısıtılarak agaroz çözülür. </li><li> yaklaşık 0,5 cm derinliğe sahip bir vakıf yapmak için bir Petri kabı içine soğutulmuş agaroz / E3 çözüm dökün. Bu, yaklaşık 0.3 cm derinliğinde ikinci bir tabaka dökmek ve prefabrik embriyo de kalıp yerleştirin ve agaroz oda sıcaklığında katılaşmaya izin katılaşmış zaman. Not: hava kabarcıklarının sayısını azaltmak için, bir açı ile agar içine kalıp yerleştirme üst agar / E3 tabaka haline kalıp takarken. </li><li> Tüm mikroenjeksiyon tepsi belirledi olduğunda, prefabrik embriyo iyi o zaman 4 ° C&#39;de E3 çözüm ve mağaza ile çanak doldurun, yavaş ve dikkatli bir scoopula kullanarak kalıp kaldırın. </li></ol> 3. Embriyo Hazırlık <ol><li> çiftleşme odalarına bölücüler koyarak Zebra balığı çiftleşme tankları kurmak ve sistem su ile doldurun. </li><li> Bölücü s her iki tarafında bir balık yerleştirinuch her çiftleşme odası bir kadın ve bir erkek balık içerir ve her çiftleşme odasına kapsadığını. </li><li> Ertesi sabah, yumurtlama etkinleştirmek için bölücüler çıkarın. </li><li> sonra yaklaşık 30 dakika, ve akvaryuma yetişkin döndükten sonra, ince bir tel örgü süzgeç aracıyla çiftleşme tankı suyun geçerek onların embriyolar toplamak balık edin. </li><li> Petri kabı üzerine süzgeç ters çevirin ve embriyolar toplamak için E3 ile durulayın. </li><li> 28.5 ° CO / N embriyolar inkübe edin. </li><li> Embriyolar 24-26 hücre gruplarının aşama 26 ulaştığı zaman, embriyoların, her çanak 50 mg / ml Pronaz 100 ul ilave edilmesi ve yaklaşık 15, oda sıcaklığında bir çanak (23 ° C) inkübe edilerek dechorionate sonra E3 ortam en ve dekante min. Not: şekilde tarif ve 28.5 ° C&#39;de O / N kuluçkaya toplanması durumunda embriyolar 24-26 hücre gruplarının aşamaya ulaşmak için bu karnına düştüğü andan itibaren yaklaşık 24-25 saat sürer. </li><li> ile çanak doldurunDaha sonra E3 ve embriyoların chorions çıkarmak için hafifçe döndürün. </li><li> E3 / pronase Durusu ve taze E3 25 ml çanak durulayın. Tekrarlayın durulama adımı tüm pronase kaldırmak için. </li><li> , Pigmentasyon gelişmesini engellemek E3 süzün ve embriyolar 24 saat sonrası gübreleme ulaşmış taze E3 / PTU 25 ml değiştirmek için. Not: deneyler birkaç gün yayılan için, temiz çanak tutmak için günde bir kez taze medya ile E3 / PTU çözüm değiştirin. </li></ol> Nephrotoxin Çözüm 4. Mikroenjeksiyon <ol><li> Enjeksiyon gününde, uygun araç kontrolü ile birlikte arzu edilen Nephrotoxin solüsyon hazırlanır. </li><li> Girdap veya ilaç (lar) sağlamak üzere hafifçe karıştırın su kolonunun tüp ve üst tarafı kontrol / çözelti içinde yer alır. Not: Nephrotoxin çözümleri mikroenjeksiyon etkinliğini izlemek ve ayrıca subseq böbrek klerensini değerlendirmek için floresan konjuge dekstran eser miktarda içeren hazırlanabiliruent zaman 20,28 işaret ediyor. </li><li> iğne arkasına ince bir jel yükleme ucu geçirilerek Nephrotoxin bir ~ 2-3 ul bir kesilmiş mikroenjeksiyon iğne yükleyin ve çözüm yerçekimi tarafından kesilmiş iğne ucu doldurmak için izin bant parçası ile dikey iğne askıya. </li><li> İğne ucu dolduğunda, mikromanipülatör yüklenen iğne sabitleyin. </li><li> Bir mikrometre slayt üzerine mineral yağ bir damla koyarak mikroenjeksiyon ses seviyesini test ve damlacık boyutunu değerlendirmek için yağın içine enjekte edilir. 500 ul enjeksiyon hacmi 0.1 mm bir çapa sahiptir. </li><li> inkübatör embriyoların çanak çıkarın ve embriyo çanak yaklaşık% 0.2 Tricaine 5 ml ekleyerek uyutmak. </li><li> tam anesthetization sağlamak için, yavaşça embriyo manipülatör aracı ucuyla embriyo dokunun. hareket eksikliği yeterli anesthetization gösterir. </li><li> Başarılı anesthetization sonra, transf ile enjeksiyon kalıp embriyo transferineer pipet. </li><li> gövde depresyon boyunca dinlenir ve kuyruk depresyon dışarı kadar yapışır iyi böyle derin alanda kafa yerleştirerek kalıp farklı bir kuyunun içine her bir embriyo Manevra. </li><li> Mikromanipülatör doldurulur iğne takın ve embriyo yanındaki iğne ucu yerleştirin. </li><li> Yavaşça ileri joystick&#39;i hareket ettirerek kuyruk kabına iğne takın ve mikroenjeksiyon sunmak için ayak pedalına basın. Not: Başarılı enjeksiyon sıvı izleyerek gauged olabilir dolaşıma girebilir. Bundan başka, floresan konjuge dekstran ile nephrotoxicant birlikte enjeksiyon işlemiyle daha sonra başarılı bir enjeksiyon kontrol etmek için araştırmacı sağlar. </li><li> Yavaşça embriyo iğne kaldırmak için joystick geri çekin. </li><li> enjeksiyonundan sonra, temiz bir çanak embriyo transferine ve Tricaine kaldırmak ve taze E3 / PTU ile yerine durulayın. </li><li> eşek istenilen zaman noktasına embriyo inkübeistenildiği gibi deneysel analiz için metil montaj medya, ya da süreç içinde fotoğraf ile belgelenmiştir edilebilir s morfolojisi. Not: embriyoların Recovery yaygın böbrek hasarı gösteren ödem, bireylerin yüzdesini belirlemek için değerlendirilmelidir. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Terapötik maddelerin bir çok çeşitli sayıda AKI 29 ile ilişkilendirilmiştir. Böyle aminoglikozid gentamisin 30 ve yaygın olarak kullanılan kemoterapötik sisplatin 31,32 olarak birçok bireysel bileşikler tarafından uyarılan hasar anlaşılmasında önemli araştırma gelişmeler olmuştur. Bu koşullar dahil patolojik değişiklikler, devam eden çalışmanın konusu olmaya devam etmektedir. Bir acil zorluk birden fazla ilaç olumsuz gibi kritik bakım ortamlarında olanlar ve yaşlılar 29 gibi yüksek riskli toplumlarda özellikle bu hastaların nasıl etkilediğini anlamak kalır. Böylece, ilaca bağlı AKI etkileri hakkında daha fazla hücresel dayalı çalışmaları sağlayacak modeller bu durumun tespiti iyileştirilmesi ve dinamik ilaç etkileşimleri takdir önemli bir rol vermektedir. Fare ve sıçan gibi memeli modelleri ile çalışmak AKI aşağıdaki böbrekte hücresel değişiklikler kurmak için ayrılmaz olmuştur bubu sistemler ile T bir sınırlama doğrudan, gerçek zamanlı gözlem, mimari karmaşıklığı ve organın iç konuma sınırlı olmasıdır. Basitçe söylemek gerekirse, böbrek bireylerin böbrek analiz etmek feda edilmesini gerektiren doğrudan gözlem için mevcut değildir. Bu sınırlamalar, insanlarda 33 dahil olmak üzere diğer omurgalılar, bir korunmuş bölüm yapıya sahip iki nefron basit bir böbrek oluşturan zebrafish embriyolar kullanılarak karşılık olabilir. Zebra balığı gelişme dış işaretlere 34 renal organogenez ve yanıtların izlenmesi doğrudan gözlem için izin eski utero ve küçük pigmentasyon ile oluşur. Gen ifadesi 35-37 gibi moleküler analiz araçları, nefrogenezisi 38-40 özelliklerini belirlemek amacıyla yüksek çözünürlüklü faydalanılmıştır. Kimyasal genetik yoluyla küçük moleküllerin test için deneysel manipülasyonlar iyi zebrabalıkları yılında kurulan ve kidn uygulanabileney 41-43. Gerçekten de, son yıllarda, zebra balığı asetominofen mikotoksinlerden ve aristolochic asit 44-48 arasında değişen maddelerin nefrotoksisite model uygulanmıştır. Zebrafish embriyo AKI modelleme açısından önemli kısıtlamalar nedeniyle gelişme bu aşamada böbrek yapısının çok basitliği, ayrıca olduğuna dikkat etmek önemlidir. kemirgen veya insan metanephros olduğu gibi, örneğin, Zebra balığı, yoğun birden interstisyel hücre tiplerini içeren karmaşık bir stroma ile çevrilidir nefron ile doludur böbrek dokusu içinde çok faktörlü etkileşimleri ele alınmasına uygun değildir. Böylece, zebra balığı en iyi AKI sırasında nefron özerk hücresel ve moleküler değişiklikler görselleştirmek için uygundur. mikroenjeksiyon gibi bir yöntem, bir öğrenme eğrisi yaparken, nephrotoxins içeren her iki gelişim ve hastalık durumlarını incelemek için yararlı olan, burada açıklanan. Bu teknik te kullanılabilirst ilaçlar tek başına ya da kombinasyon halinde kullanılabilir. Buna ek olarak, enjeksiyonlar gelişimi zaman noktalarında geniş bir aralığında gerçekleştirilebilir. Zebra balığı larvası intravenöz microinjections gerçekleştirmek için benzer bir eşit olarak geçerli yöntemin daha önce ve ark., 21 Cosentino tarafından tarif edilmiştir. Metodoloji biri anlamlı fark, burada tarif edilen yöntemlere göre, embriyo, bir tutma pipeti 21 kullanılarak immobilize edilir enjekte edilecek olmasıdır. Bir holding pipet kullanılması enjeksiyon kalıp bir alternatiftir. nephrotoxicant ajanlar için bir dağıtım yöntemi, bu alternatifin farkında olması gerektiği gibi mikroenjeksiyon uygulamaya koymaya ve uygulama içerecektir embriyo zarar vermemek için tutma pipet işlemek için öğrenme gibi, şahsen tercih edilir olduğunu belirlemek için yöntemler karşılaştırmak isteyebilirsiniz Araştırmacılar o pratik gerektirir gibi başarılı manevra ve Microinject EMBR bir depresyon boşluğuna ile basit bir enjeksiyon kalıp kullanarakYÖS. Bu yordamı gerçekleştirirken, uygun büyüklükte enjeksiyon iğneleri hazırlamak ve embriyonik dolaşıma pürüzsüz giriş ve çıkış optimize etmek için iğne ucu açısını kesmek için kritik öneme sahiptir. enjeksiyon işlemi sırasında, örnekler arasında Nephrotoxin teslimat tutarlılığını değerlendirmek için enjeksiyon hacmi izlemek için çok önemlidir. Bir mikrometre ile enjeksiyon hacmi periyodik olarak değerlendirilmesi bir deney yaparken araştırmacı hacmindeki değişiklikler hakkında belirsiz ise yapılabilir. Örneğin, nedeniyle tekniğin doğası gereği, iğne ucu kısmen veya tamamen hücresel enkaz ile yapışmasına neden olabilir. Bu komplikasyon püskürtülen sıvı tutarlılığı sağlamak için periyodik olarak iğne temizleyerek engellenebilir. Buna ek olarak, fenol kırmızısı gibi vital boya enjeksiyonu görsel bir işaret olarak görev ve sıvı dağılımı 49,50 denetlenmesine yardımcı olmak için karışıma ilave edilebilir. Bundan başka, izleyici moleküller enjeksiyonlar yardımcı olabilirenjeksiyonu takiben spesifik hücre popülasyonu, görselleştirme. Floresan dekstran parçalarının, özellikle de 10 kDa dekstran konjugatları eş enjeksiyon için, uygulama 16,17 bir dizi vardır. Bu durumda, floresan yoğunluğu değerlendirilmesi az sızıntı başarılı mikroenjeksiyon teyit etmek için prosedür takip hemen gerçekleştirilebilir. Yoğunluk renal klerensi 51 ölçmek üzere floresan yoğunluğu değişimi ölçmek için sonraki zaman noktalarında yeniden gözden sonra uygun görüntü yakalama fotoğraf ve kullanılarak ölçülebilir. Ayrıca, proksimal tübül içinde dekstran reabsorbsiyonu bu nefron segmentinde 16,17 işlevlerinin bir vekil sağlar. Birlikte ele alındığında, mikroenjeksiyon bu model in vivo farmakokinetik gidermek için fırsat sağlar özellikle de Zebra balığı ile AKI araştırmak için kullanılabilir birçok yolu vardır. Bu durumda, bir kez nephrotoxins mikroenjeksiyon hakimZebra balığı embriyo içine böbrek çalışmalar için kullanışlı bir paradigma sağlar.

AKI yıkıcı sağlık sonuçları 1 yol açabilir böbrek fonksiyonlarının ani bir kayıptır. AKI daha yüksek kritik bakım olgularında% 30-50 oranları ve yaşlı, ve% 50-70 1-3 mortalite oranları ile, bağlı yatan hastalarda yaklaşık% 20 yüksek insidansı dünya çapında önemli bir sağlık sorunudur. Ne yazık ki, AKI prevalansı giderek artmaktadır nedeniyle, antibiyotikler gibi nephrotoxins post-operatif stres, iskemi ve maruz kalma dahil AKI neden olabilir faktörlerin çeşitliliği, kısmen, önümüzdeki on yıl içinde daha da yükselmek tahmin edilmektedir kemoterapötik ilaçlar 4. AKI yaygın temel fonksiyonel birimler ve kan filtresi ve merkezi toplayıcı kanallarda 1 İdrarı boşaltır parçalı bir tübül oluşmaktadır nefron, ortaya çıkan, böbrek içindeki ani hücresel hasara içerir. Ne zaman nefron önemli bir kısmı vardırAKI sırasında hasar, ani etkiler ölü ve ölmekte olan hücrelerden 1 tıkanması nedeniyle nefron aracılığıyla bir dolaşımdan atık klerensinde kesinti, ve azalan veya yürürlükten kaldırılan sıvı akışını içerir. Zamanla, boru şeklindeki tıkanıklığı kalıcı böbrek fonksiyonlarını 1 azaltır tüm nefron, dejenerasyonu neden olabilir. AKI aşağıdaki böbrekte fizyolojik değişiklikler de kronik yara izi 1 yol açabilir karmaşık inflamatuar olayları içerir. Bu sonuçların rağmen, nefron tübüler epitel 5,6 tekrar oluşturur AKI sonra rejenerasyon geçmesi için bazı kapasitesine sahiptir. Nefron rejenerasyon artan moleküler anlayış var olsa da, mekanizmalar birçok açıdan zor kalır ve soruşturma 7 devam gerektirecek. AKI kalıcı böbrek hasarı ile sonuçlanan derecesi de bilinmemektedir. Mevcut araştırma böbrek için rejeneratif potansiyeli olduğunu göstermektedirEn yüksek daha belirgin veya tekrarlanan bölüm kronik böbrek hastalığı (KBH) neden olurken, AKI daha az şiddetli Aşağıdaki hallerde ve hayat kurtarıcı nakli ya da diyaliz 8,9 gerektiren son dönem böbrek yetmezliği (SDBY) olarak birikirler. Ayrıca, zaten CKD muzdarip kişilerin AKI 8,9 şiddetli bölüm yakalanma daha yüksek bir risk altındadır. Birlikte ele alındığında, temel ve klinik araştırma, anlama tedavi ve AKI önlemek için hayati önem taşımaktadır devam ettiğini açıktır. Hayvan modelleri ile Araştırma AKI 10 sırasında meydana gelen yerel ve çevresel değişiklikler ilerlemesini takdir vesile olmuştur. Bu anlayış genişletmek yanı sıra yeni tedaviler geliştirmek için, Zebra balığı hayvan modeli yolları 11,12 çeşitli istihdam edilmiştir. Zebra balığı böbrek nefron, embriyo ve yetişkin hem de memelilerde 13-16 ile birlikte koruma yüksek derecede gösterir. ze daha, nefron epitel hasarıbrafish tübüler hücrelerin lokal yıkımı intratubuler çoğalması ve nefron mimarisinin 17-19 yeniden kurulması izler sayede yüksek omurgalıların, süreci benzer. Embriyo, bununla birlikte, sisplatin gibi nephrotoxins kapsamlı tübül hasarı öldürücülüğü 20,21 ile ilişkilidir. Karşılaştırıldığında, zebrabalıkları yetişkinler AKI hayatta ve böbrekte maddi rejeneratif yeteneklerini sergileyecekleri. Örneğin, aminoglikozid antibiyotik gentamisin maruz kaldıktan sonra, Zebra balığı tübül epitel hasarı yeniden ve yeni nefron birimleri de 22-24 büyür. Bu gentamisin kaynaklı AKI çalışmaları farklı nephrotoxins böbrek hasarı anlamak, çok değerli bilgiler sağlamıştır olsa da etkileri ve hasar 25 farklı türde yanıt takdir için kritik kalır. Zebra balığı embriyo nedeniyle büyüklüğü, şeffaflık ve genetik tractability için, Nephrotoxin çalışmaları için pek çok faydaları vardır &lt;Mikroenjeksiyon 20,21 yöntemi soruşturma molekülü (ler) yönetmek için kullanılır sup&gt; 25. Nefron 24 saat sonra döllenme (hpf) tarafından oluşturulan ve yaklaşık 48 hpf 26,27 kanı filtre başlarlar. Böylece, embriyonik böbrek hızlı oluşumu ve fonksiyonu deneysel analizini kolaylaştırır. Ancak, mikroenjeksiyon işlemi teknik zorlukları vardır ve teknik mastering için bir öğrenme eğrisi olabilir. Bu video makalede, biz microinjections gerçekleştirmek ve başarılı enjeksiyonları oranını arttırmak için sorun giderme ipuçları sağlamak açıklanmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="801">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:229px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:129px;">AB01915</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>Mo. P097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15510-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;(microinjection tray) 150mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low Temperature Incubator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11 690 516DQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Dissecting Tweezer</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Micrometer</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>2280-24</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nephrotoxin microinjection in zebrafish to model acute kidney injury

Böbrekler onlar kan filtrelemek kimyasallara maruz zarar yatkındır. Bu böbrek fonksiyonu ve akut böbrek hasarı (ABH) olarak bilinen klinik sendrom gelişiminde hızlı bir düşüş ile ilişkili organ hasarına yol açabilir. Farmakolojik maddeler tek tek uygulandığında bakteriyel enfeksiyondan kanseri kadar sağlık durumları tedavi etmek için kullanılabilir ya da başka ilaçlar ile kombinasyon halinde, AKI başlatabilir. Balığı onlar insanları da kapsayan yüksek omurgalıların ile korunan nefron işlevsel birimler oluşan bir embriyonik böbrek formu olarak yararlı bir hayvan modeli, in vivo olarak böbrek fonksiyonu kimyasal etkilerini incelemek için vardır. Dahası, zebra balığı AKI hücresel ve moleküler yönlerini aydınlatmak ve bu tür nefrokoruyucu moleküllerin kimlik olarak tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için fırsatlar sağlayan genetik ve kimyasal ekranlar, gerçekleştirmek için kullanılabilir. Burada, biz içine nasıl mikroenjeksiyon göstermekzebra balığı embriyo Nephrotoxin çalışmaları için bir paradigma olarak kullanılabilir.

Kurmak bir mikroenjeksiyon istasyonu stereomikroskopta, micromanipulator ve basınç regülatörü (Şekil 1A) içerir. Enjeksiyon plaka transillüminasyonu Bu prosedür (Şekil 1B) içinde örnekleri görüntülemek için tercih edilir. enjeksiyon iğnesinin hazırlanması arka yükleme iğne nihayet kesme ile kenar hazırlayarak ardından uygun borosilikat cam, çekme içerir. Optimal, iğne ucu kesme işlemi sırasında (Şekil 1C) gibi ince forseps olarak keskin kesme aleti, kenarına açı ile yapılan bir kesim, künt yerine eğimli olduğu (Şekil 1D). Bu eğimli kenar önemlidir ve büyük ölçüde yavaşça zebrafish içine iğneyi yeteneğini etkiler. Enjeksiyon gününde, embriyolar sağlam ama esnek embriyo kullanılarak konumlandırıldımanipülasyon araçları (Şekil 1E). Enjeksiyon için, embriyolar gövde daha sonra, enjeksiyon aşamasında (Şekil 1F) için bir kaldıraç sağlamak için püskürtme tepsinin kenarı boyunca dinlenmiş şekilde, manevra edildi. Enjekte ederken, bir iğne yerleştirilmesi için damar hedef görselleştirmek ve daha sonra enjekte malzeme dolaşımı (Şekil 1G) girmek gözlemlemek embriyonik gövde üzerinde görüş uçağı odaklanmalıdır. Zebra balığı embriyo asetat mikroenjeksiyon prosedürünü kolaylaştırır ve ayrıca tipik deney hızı zaman süresini (Şekil 2A) ne pigmentasyon gelişmesini azaltmak için 24 hpf PTU kimyasal muamele ile geliştirilebilir. Burada, embriyo örnekleri edildi, daha sonra 72 HPF aşamasında gelişmeye bırakılmıştır ya sahte tuzlu su taşıyıcı ile mikroenjeksiyon ya da 2.5 mg / ml gentamisin (Şekil 2A) ile birlikte mikro-enjekte enjekte edilir.Daha sonraki canlı gözlem stereomikroskop (Şekil 2B) ile transillüminasyon aydınlatma kullanarak, enjeksiyon sonrası bir ve iki gün sonra gerçekleştirildi. Sahte veya salin enjekte edilen embriyolar ile karşılaştırıldığında, sadece gentamisin enjekte bireyler daha önce yayınlanan gözlemler 11,20,21 uygun normal böbrek işlevinin bir ortadan kaldırma göstermektedir, bu durumda, perikardiyal ödem, ödem (Şekil 2B) göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54241/54241fig1.jpg" /> Şekil 1. Mikroenjeksiyon cihaz ve aletler. Stereomikroskop (solda) ile kurmak (A) Enjeksiyon istasyonu, mikromanipülatör ve iğne tutucu (orta) ve basınç regülatörü (sağda). Enjeksiyon plakasının (B) transillüminasyon. Sol (C): Künt kesim iğne. Sağ: Eğimli kesim iğne. (D) Fine forseps iğne uçları kesmek için kullanılır. (E) yerleştirin ve enjeksiyon kalıp içine örnekleri konumlandırmak için kullanılan Manipülasyon araçları. (F) Embriyolar mikroenjeksiyon kalıp içinde dizilmiş. Ölçek çubuğu = 0,5 mm. Enjeksiyon için embriyo iğne (G) konumlandırma aşağıdaki. Ölçek çubuğu = 0.15 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54241/54241fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54241/54241fig2.jpg" /> Zebra balığı deneysel zaman çizelgesi Nephrotoxin Şekil 2. Deneysel zaman çizelgesi ve sonrası enjeksiyon ödem deneyi. (A) Örnek, burada bir gentamisin çalışmaya başvurdu. Embriyolar dechorionated ve 24 saat sonra döllenme (HPF) de PTU çözeltisi ile muamele edildi. Smalle ile gösterildiği gibi, her gün PTU çözeltisi boşaltıldı ve taze ortam ile değiştirilmiştiryeşil okları r. Sahte enjekte edilmesi veya iki tuzlu su (taşıt kontrol) ya da gentamisin enjekte: 72 HPF, embriyolar bir enjeksiyon kalıbına aktarılır ve daha sonra aşağıdaki şekilde işlendi, anestezi uygulandı. taze ortam embriyolar canlandırılması sonra, embriyolar analizi ve görüntü elde etmek için 1 ve 2 gün sonra, enjeksiyon (sırasıyla 96 ve 120 HPF) gözlendi. (B) Üst: uninjected Zebra balığı embriyosu. Orta: serum fizyolojik ile 72 hpf enjekte embriyo. Alt: Embriyo 2.5 mg / ml gentamisin ile enjekte edilir. Ölçek çubuğu = 0.5 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54241/54241fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury at JoVE.com

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

kemoterapötik antibiyotik arasında değişen ilaçlar yer alır nephrotoxins, kaynaklanacak böbrek yaralanmaları, kimin patogenezi tam olarak anlaşılamamıştır karmaşık bozuklukları oluşabilir. Bu protokol, zebra balığı böbrek koruyucu önlemlerin tanımlanması için uygulanabilir, bu koşullar, hastalık modelleme için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

nephrotoxin-microinjection-in-zebrafish-to-model-acute-kidney-injury

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.8K Görüntüleme.  University of Notre Dame.  kemoterapötik antibiyotik arasında değişen ilaçlar yer alır nephrotoxins, kaynaklanacak böbrek yaralanmaları, kimin patogenezi tam olarak anlaşılamamıştır karmaşık bozuklukları oluşabilir. Bu protokol, zebra balığı böbrek koruyucu önlemlerin tanımlanması için uygulanabilir, bu koşullar, hastalık modelleme için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. 

Video: Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı Tüm Böbrek İliği Nakli

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biyoloji

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Akut Böbrek Sakatlık Eğitim Zebra balığı Larva İntravenöz Microinjections

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Doğrudan Yetişkin Zebra balığı Böbrek Hücre Nakli

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Sitokrom Sitoplazmik Mikroenjeksiyon Apoptoz aktivasyonu C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek diseksiyonu

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Zebra balığı Embriyonik İskelet Kası Lazer-yaralama

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı Gavaging

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek Nefron Kompozisyon ve Fonksiyon Analizi

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...